一種基於適配體納米金交聯複合物的TNF‑α檢測試試劑盒及方法與流程

2023-10-25 00:45:15 2

本發明屬於檢測試紙技術領域，涉及一種基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試試劑盒及方法。

背景技術：

阿爾茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)是一種危害性高、醫療護理成本巨大、尚無根治方法的神經退行性疾病。隨著我國社會老齡化過程，患者人數逐年增加，給社會帶來了極大的負擔，因此ad的早期診斷和幹預具有重大意義。

已有的ad臨床檢測手段主要為：依靠認知量表測試結合核磁共振掃描，鑑定結果可靠度高，但對ad早期診治敏感性不佳(患者沒有明顯症狀或具有輕微的認知功能的減退(mildcognitiveimpairment，mci))；此外，檢測樣本為腦脊液，取樣時常採用脊椎穿刺等手段，有副作用，並且不能進行多次取樣，給疾病的追蹤性檢測帶來困難。

體液標誌物作為一種敏感性佳、特異性高、易於使用的指示劑，可真實反應ad的病理進程。腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)是一種主要由巨噬細胞和單核細胞產生的炎症因子，參與機體的炎症反應。腦內慢性炎症反應是ad的重要病理特徵之一。

技術實現要素：

本發明解決的問題在於提供一種基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試試劑盒及方法，利用核酸適配體和納米金交聯複合物比色檢測tnf-α，能夠簡便、快速的檢測待測樣品中是否含有tnf-α。

本發明是通過以下技術方案來實現：

一種基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試劑盒，包括：

納米金溶液，其中包括用於形成納米金交聯複合物的納米金顆粒；

巰基化的單鏈序列dna1和dna2，dna1、dna2分別與納米金顆粒連接，形成aunps-dna1顆粒和aunps-dna2顆粒；

單鏈連接序列linker，linker含有與tnf-α特異性結合的適配體序列，且linker的兩端分別與dna1、dna2相互補；dna1、dna2和linker可雜交形成雙鏈；

在進行檢測時，aunps-dna1顆粒、aunps-dna2顆粒和linker在緩衝液中孵育後雜交形成納米金交聯複合物。

所述的納米金交聯複合物在與tnf-α結合前為團聚狀態，反應溶液為藍色；納米金交聯複合物與tnf-α結合後，tnf-α與linker上的適配體序列結合，破壞適配體納米金交聯複合物，納米金由團聚狀態變為分散狀態，反應溶液由藍色變為紅色。

所述的dna1的核苷酸序列為：tcacttcgctgaaaaaaa-(ch3)3-sh；

所述的dna2的核苷酸序列為：sh-(ch3)6-ctgtattgtcgc；

所述的linker的核苷酸序列為：tcctccatccgcgagtgggcgacaatactgtcagcgttcact。

一種基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測方法，包括以下操作：

1)納米金的製備：利用檸檬酸鈉還原法製備出粒徑13～20nm的納米金顆粒

2)巰基化的dna1、dna2分別與納米金經鹽老化方法連接形成aunps-dna1顆粒和aunps-dna2顆粒；

3)將aunps-dna1顆粒、aunps-dna2顆粒和linker雜交形成藍色的適配體納米金交聯複合物；

4)將得到的適配體納米金交聯複合物離心，去除上清；沉澱重懸後得到重懸液；

5)向得到的重懸液中加入待檢液，用加等量水作對照，孵育；

6)觀察待檢液加入後重懸液的顏色變化，若待檢液中含有tnf-α，tnf-α特異性結合linker上的適配體，破壞納米金交聯複合物，納米金由團聚狀態變為分散狀態，重懸液由藍色變為紅色；同時用紫外可見分光光度計測定其全波長。

所述納米金的製備為：將氯金酸邊攪拌邊加熱至沸騰，然後加入檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍轉為紅色後持續加熱2～8min，冷卻後得到納米金溶液。

所述dna1、dna2在與納米金結合前，先將其溶於滅菌超純水中；dna1、dna2的濃度為0.1-1mm。

所述的linker的濃度為10-100μm；雜交條件為室溫反應1小時，4℃過夜。

所述的dna1、dna2和linker的比例為1～10：1～10：1～10；

所述的重懸液含有100-300mmnacl和30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8；所述的待檢液中tnf-α為溶解狀態。

所述的孵育條件為室溫孵育1h；全波長掃描時的波長為400-900nm。

與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果：

本發明提供的基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試紙條及方法，利用基於核酸適配體和納米金交聯複合物比色檢測tnf-α，基於靶標特異性，優選出核酸適配體，核酸適配體無需標記，無需使用大型的儀器設備，克服了適配體需要標記而導致成本提高和電化學操作相對複雜的不足，降低了檢測成本。

本發明提供的基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試紙條及方法，選擇性和特異性好，這是由核酸適配體本身的特點和結構決定的，在篩選適配體的過程中加入tnf-α，用selex篩選方法，選出能與tnf-α特異性結合而不與其他物質發生特異性反應的核酸適配體；

本發明提供的基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試劑盒，基於ad進程中伴隨的腦內神經炎症反應的發生，ad早期患者血清中tnf-α水平顯著升高，可用於ad早期檢測或其他炎症相關疾病的快速診斷，具有簡便、快速、可靠性高等優點。

附圖說明

圖1為nupack模擬分析dna1、dna2和linker交聯分析圖；通過模擬分析，這三條單鏈雜交形成雙鏈時所釋放出的自由能為-52.11kcal/mol，可以看出這三條單鏈可以形成穩定的雙鏈結構；

圖2為本發明的檢測原理示意圖，小球為分散狀態的納米金顆粒，為dna1、dna2、巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網狀結構的複合物，溶液由紅色變為藍色；引入tnf-α後，藍色複合物的網狀結構破壞，複合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現分散狀態，溶液顯示紅色。

圖3為適配體納米金交聯複合物交聯前後的對比圖，單分散狀態的納米金粒徑在10～20nm左右，溶液呈現紅色，當其通過適配體和納米金表面的dna1、dna2交聯後，溶液顆粒變大，呈現藍紫色。

圖4為適配體納米金交聯複合物交聯前後的全波長掃描圖，分散狀態的納米金最大吸收峰在520nm左右，當納米金團聚後，溶液會發生紅移現象。

具體實施方式

下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。

本發明提供的基於適配體納米金交聯複合物的tnf-α檢測試紙條及方法，利用核酸適配體和納米金交聯複合物比色檢測tnf-α，基於核酸適配體和納米金交聯複合物來進行的，下面分別對其進行說明。

關於核酸適配體：

適配體是在體外通過selex過程人工篩選出來的一類和靶分子有著高度的特異性親和能力的短鏈寡核苷酸序列，就像抗原-抗體結合一樣，靶分子可以和它對應的適配體特異性地結合。

selex技術即指數富集的配基系統進化技術(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，利用分子生物學的技術，構建人工合成的單鏈隨機寡核苷酸文庫，將寡核苷酸文庫和靶分子相互作用，保留結合的寡核苷酸配基，經反覆擴增、篩選數個循環，即可使與該靶分子特異性結合的寡核苷酸序列得到富集，利用該技術可以從隨機單鏈核酸序列庫中篩選出特異性與靶物質高度親和的適配體。

dna1和dna2首先需與linker的對應區域互補，並通過linker連接後形成線性分子；同時，dna1、dna2自身以及之間不形成穩定的互補結構；linker設計時除考慮與dna1和dna2互補外，還考慮互補序列自身結構對適配體構象的影響，避免獨自形成髮夾結構等，影響對靶分子的識別。

具體的設計結果如表1所示，其中序列1為tnf-α適配體序列，序列2為dna1序列，序列3為dna2序列，序列4為linker序列。

序列表1

參見圖1，圖1為nupack模擬分析dna1、dna2和linker交聯分析圖，通過軟體模擬分析，這三條單鏈雜交形成雙鏈時所釋放出的自由能為-52.11kcal/mol，可以看出這三條單鏈可以形成穩定的雙鏈結構。

參見圖2，紅色小球為分散狀態的納米金顆粒，為dna1，為dna2，巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網狀結構的複合物，溶液由紅色變為藍色；引入tnf-α後，藍色複合物的網狀結構破壞，複合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現分散狀態，溶液顯示紅色。

具體的，本發明所提供的dna1、dna2、linker均由上海生工生物工程有限公司合成。

下面給出具體的檢測方法：

(1)納米金的製備：利用檸檬酸鈉還原法製備出粒徑13～20nm的納米金備用；

(2)巰基化的dna1、dna2分別與納米金經鹽老化方法連接形成顆粒1(aunps-dna1)和顆粒2(aunps-dna2)；所述dna在和納米金結合前，先將1od的dna溶解於60μl滅菌超純水中，其中，dna1、dna2的濃度為0.1-1mm；具體的，dna1、dna2的濃度為0.5mm；

(3)aunps-dna1、aunps-dna2和linker雜交形成藍色的適配體納米金交聯複合物；其中，雜交條件為室溫反應1小時，4℃過夜；linker的濃度為10-100μm；

(4)將上一步驟中得到的適配體納米金交聯複合物離心，去除上清；離心條件為11600g，10min；dna1、dna2和linker的比例為1～10：1～10：1～10；

(5)沉澱用buffer重懸，得到重懸液；重懸液含有100-300mmnacl、30mmtris-acetate；重懸液的ph為7～8；

(6)向上一步驟中得到的重懸液中加入tnf-α，用加等量水作對照，孵育；孵育條件為室溫，1h；所述的tnf-α溶解於200μl滅菌超純水中，得到0.25mg/ml母液。

(7)觀察顏色變化，加入tnf-α後溶液會由藍色變為紅色或者紫紅色；同時用紫外可見分光光度計測定其400-900nm的全波長，觀察樣品最大吸收峰的波長，單分散狀態的納米金最大吸收峰在520nm處，當在linker的作用下發生團聚時，最大吸收峰的波長會紅移至某一大於520nm的波長處(本發明中紅移至550nm)，當加入tnf-α後，最大吸收峰會藍移至520nm左右，通過一系列濃度梯度的tnf-α標品的a520/a550可以做出隨tnf-α濃度變化的標準曲線。

上述方法中，tnf-α可以特異性結合其適配體，破壞適配體納米金交聯複合物，納米金由團聚狀態變為分散狀態，溶液由藍色變為紅色，檢測過程無需複雜的儀器和專業的操作人員，顯色迅速，在室溫下就可以進行，具有良好的靈敏性和特異性。

檢測結果表明，本發明的靈敏度檢測可達tnf-α190nm；檢測速度：室溫孵育1h後測定結果。

本發明的檢測以定性為主，可進行半定量：在190～600nm濃度範圍內，通過酶標儀測量結果可進行半定量。

進一步的，所述納米金溶液的製備方法為：取50.0ml0.01％的氯金酸於100ml燒瓶中，在磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，加入1.0～5.0ml1％檸檬酸三鈉水溶液，溶液由藍轉為紅色後持續加熱5min，即得所述納米金溶液。

本發明的技術方案是基於以下原理實現的：dna1、dna2和linker是互補的單鏈核酸，在一定條件下，這三條單鏈可以雜交形成雙鏈；linker中含tnf-α適配體序列，可與tnf-α特異性結合。巰基連接的aunps-dna1和aunps-dna2通過linker可以雜交形成網狀結構的複合物，溶液由紅色變為藍色；檢測時，無tnf-α，複合物不會發生變化，溶液仍為藍色；引入tnf-α後，藍色複合物的網狀結構破壞，複合物分離成為aunps-dna1和aunps-dna2，納米金呈現分散狀態，溶液顯示紅色。

參見圖3所示的，適配體納米金交聯複合物交聯前後的全波長掃描圖，分散狀態的納米金最大吸收峰在520nm左右，當納米金團聚後，溶液會發生紅移現象。

圖4為適配體納米金交聯複合物交聯前後的全波長掃描圖，分散狀態的納米金最大吸收峰在520nm左右，當納米金團聚後，溶液會發生紅移現象；全波長掃描用以判斷檢測前後的具體狀態的變化，輔助定性。

結果表明：酶標儀測定全波長表明，和0μl的tnf-α溶液對比，最大吸收峰從555nm移至530nm處，納米金團聚體顆粒變小，溶液的藍色增加。

以上給出的實施例是實現本發明較優的例子，本發明不限於上述實施例。本領域的技術人員根據本發明技術方案的技術特徵所做出的任何非本質的添加、替換，均屬於本發明的保護範圍。