一種用於腫瘤局部介入治療的tat-peⅲ融合蛋白及製備方法

2023-10-24 22:20:52 2

專利名稱：：一種用於腫瘤局部介入治療的tat-peⅲ融合蛋白及製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種融合蛋白，更具體地說，本發明涉及一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融合蛋白。同時，本發明還涉及一種所述TAT-PEID融合蛋白的製備方法。
背景技術：
：腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康。放療、化療等常規治療方法在治療腫瘤的同時也殺傷正常細胞，副作用極大。腫瘤的生物治療是不同於手術、放療和化療的一種全新的腫瘤治療方法，不僅可以克JJgj改療、化療手段的上述缺點，而且能夠顯著提高治療效果，因此受到醫學研究人員的廣泛關注。利用免疫毒素進行導向治療是生物治療的一個重要途徑。免疫毒素是可以識別和選擇性破壞某些特定細胞功能的一類融合蛋白，由靶向區和細胞毒區兩部分組成。靶向區多為抗體或細胞因子，細胞毒區多選擇銅綠假單胞菌外毒素A(/^eiw/湖o加s3er收/oosaexotoxinA，PE)的部分片段。PE是分子量為66KD的單鏈蛋白質，通it^"延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制真核細胞的蛋白質合成而導致細胞死亡，是自然界存在的毒性最強的分子之一，殺細胞作用遠高於化學抗癌藥物，因此，免疫毒素是目前研究最多的導向藥物。PE由613個M酸組成，含有三個不同的結構域Ia區是細胞受體結合區，Ib區具有連接調節作用，n區是跨膜轉位區，m區是酶活性區。常用於構建免疫毒素的PE片段是PE40(Ia區缺失)和PE38(Ia及部分Ib缺失)。美國國立癌症研究所Hhara等構建了一種微型免疫毒素，分子中僅含TGFot和PE的ID區(PEm)，對表達TGF受體的細胞具有較高的細胞毒活性，並對荷瘤小鼠具有明顯的紳瘤消退效應，表明PEm也能有效地用於構建免疫毒素。免疫毒素作為一種新型治療藥物具有廣闊的應用前景，但是在臨床應用中仍然面臨許多挑戰。首先，免疫毒素的穿透性有待提高，尤其在實體瘤的治療中，藥物的穿透性至關重要。其次，研製免疫毒素時應儘量控制其分子大小，減小免疫毒素的分子量。單克隆抗體是構建免疫毒素時最常用的導向分子，但完整的單抗分子量大，通常有150KD左右；即便近年經過改進的單鏈抗體，分子大小也有25KD左右。因此，為克服現有技術的局限性，在現有導向治療的研究基礎上，若能構建一種既保留免疫毒素的高細胞毒性、又具有很強穿透性的小分子物質，再藉助現代把向治療技術直接作用於腫瘤組織，無疑對增強腫瘤治療效果，減輕全身毒副作用都具有重要意義。穿膜肽(penetratin)是近年發現的一類具有細胞生物膜穿透功能的小分子肽類物質，其中來源於人類免疫缺陷病毒HIV-1Tat的蛋白轉導域(proteintransductiondomain,PTD)能夠高效穿過生物膜的結構域，將與其共價連接的多肽、蛋白質及DNA等分子跨膜導入幾乎所有的組織和細胞，轉導效率很高而且對細胞沒有損傷。Tat蛋白PTD的核心序列由11個M酸組成，其序列為YGRKKRRQRRR，是目前為止所發現的TatPTD最短的序列，其轉導能力不比全長Tat序列差。Schwarze等研究發現TatPTD可介導相對分子量15KD~200KD的蛋白從細^卜向細胞內直接跨膜轉運，表明TatPTD具有廣鐠的蛋白轉導作用。原發性肝癌是臨床常見的惡性腫瘤，我國每年死於肝癌約11萬人，佔M^^肝癌死亡人數的45%。對於不能手術切除的中晚期肝癌，介入治療是目前最好的治療方法。現用各種肝癌介入治療藥物或由於在胂瘤組織內擴散差，或由於局部殺毒力不強等缺點，只適合於小肝癌，較大肺瘤效果往往不佳，尋找合適的局部介入治療藥物是近來肝癌治療研究的一個方向。介入治療技術提高藥物治療耙向性，對於目前尚無根治方法的惡性腫瘤，介入治療可將幾種最有效的抗癌藥搭配在一起，通過導管技術找到腫瘤的供養動脈，把抗癌藥和栓塞劑直接注入腫瘤組織，發揮最大的抗腫瘤作用，對全身毒副作用小，同時將腫瘤的供血血管阻塞，4吏腫瘤失去血供"餓死".本發明所述TAT-PEHI融合蛋白，作為介入治療抗癌藥物，可用於包括肝癌在內的多種腫瘤的局部^h入治療。所述TAT-PEffl融合蛋白保留了免疫毒素對腫瘤細胞的高殺傷活性，具有轉導效率高、分子量小的優點，克服了免疫毒素的局限性，用於介入治療，可以避免TAT-PEm融合蛋白在治療過程中對正常組織細胞的損害。同時也能有效解決免疫毒素穿透性弱的問題。
發明內容本發明的目的是提供一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融M白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的m區組成。本發明的另一個目的是提供一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEm融合蛋白的製備方法，將TatPTD與PEffl融合製得。本發明的目的還在於提供一種栽體為pQE-TAT-PEm的重組質粒。本發明提供了一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融合蛋白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的m區組成。HIV-1AY358073抹TAT蛋白PTD序列對應的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgaagacagagacgaaga。在這11個AJ^酸中，有6個精氨酸(R)，兼顧精氨酸在HIV-1和E.Coli的使用偏嗜性，將HIV-1AY358073林TAT蛋白PTD序列中兩個精氨酸的使用密碼cga替換為cgt;,氨酸外，其餘5個胺基酸的密碼使用情況均不含有大腸埃希菌(E.Coli)的稀有密碼子，可以保留原核苷酸序列。因此，我們用於構建pQE-TAT-PEIH重組質粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtaga。本發明提供的用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEDI融合蛋白具有SEQIDNO:1所示的M酸序列。本發明還提供一種編碼上述用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEffl融合蛋白的DM序列，其具有SEQIDNO:2所示的序列或者編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡併性的序列。本發明提供了一種TAT-PEm融合蛋白的製備方法，將TatPTD與PEIH融合製得。包含下列步驟確定人類免疫缺陷病毒的TATPTD胺基酸所對應的核苷酸序列；選擇加在TatPTD兩側的甘氨酸的密碼子；擴增同時含有TatPTD和PEni片斷的目的基因。其中，用於構建pQE-TAT-PEm重組質粒的HIVTatPTD的核苷酸序列優選為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtagsu優選的甘氨酸的密碼子為ggc。優選的目的基因長度為729bp。優選的擴增方法為使用PCR方法。本發明提供了一種表達目的蛋白的重組質粒，即pQE-TAT-PEm。優選利用屍rall、Wfldm酶切位點，將目的基因克隆於原核表達載體pQE-31中製得.更優選經位於PEm目的片段5'端的戶WI和3'端的#//2dm雙酶切，即為線性化的pQE-TAT栽體，還可用於克隆其它的目的片段。本發明將來源於人類免疫缺陷病毒HIV-1Tat的蛋白轉導域(proteintransductiondomain,PTD)與銅綠假單胞菌外毒素A的m區(PEffl)融合，構建pQE-TAT-PEffl重組質粒，經表達、純化得到具有抑瘤活性的TAT-PE冚融合蛋白。TAT融合蛋白系統是一種很好的蛋白傳送工具，打破了蛋白質通常只能通過細M面受體和信號轉導途徑將所攜帶的生物信息傳遞到細胞內的旨，在臨床應用大分子藥物治療腦血管疾病、腫瘤疾病中具有廣闊的應用前景，同時也能有效解決免疫毒素穿透性弱的問題。本發明利用TAT介導蛋白質的方法，將TatPTD的編碼基因與外源蛋白基因連接，表達融合蛋白，所得到的TAT-PEm融合蛋白不僅保留了TAT原有的穿透力，而且不影響外源蛋白的活力。本發明採用MTT法測定了TAT-PEffl融合蛋白的體外抑瘤活性，結果表明TAT-PEin融合蛋白對B16細胞具有明確的細胞毒作用；同時建立小鼠B16黑色素瘤模型，檢測TAT-PEm融合蛋白的體內抑瘤活性，其結果顯示TAT-PEOI融合蛋白具有一定的抗腫瘤作用。本發明所述TAT-PEffl融合蛋白，可用於包括肝癌在內的多種腫瘤的局部介入治療。所述TAT-PEm融合蛋白保留了免疫毒素對腫瘤細胞的高殺傷活性，具有轉導效率高、分子量小的優點，克服了免疫毒素的局限性。用於介入治療，可以避免TAT-PEffl融合蛋白在治療過程中對正常組織細胞的損害。圖1表示pQE-TAT-PEHI重組質粒構建圖；圖2A表示TAT-PEffl-PCR擴增產物電泳，其中1.1kbDNAMarker(1000(f250bp);2.TAT-PEHI-PCRproducts;圖2B表示pQE-TAT-PEffl重組質粒雙酶切鑑定，其中1.1kbDMMarker(1000(T250bp);2.pQE-TAT-PEIH經A/I/W/2dffl雙酶切；圖3表示pQE-TAT-PEm重桑贈粒構建的測序峰圖；圖中1.pQE-31栽體序列，從左向右依次為翻*始密碼ATG,RGS'6xHis標籤；2.酶切位點酶切後補平的序列；3.戶rall酶切位點酶切後的序列；4.甘氨酸序列；5.HIVTatPTDll個胺基酸的g序列；6.甘氨酸序列；7.屍WI酶切位點序列；8.PEffl的序列；圖4表示IPTG誘導表達pQE-TAT-PEDI陽性重組子的SDS-PAGE分析；其中，1:低分子量蛋白標準；2-5:pQE-TAT-PEffl質粒經IPTG誘導後；6:pQE-31載體誘導後；圖5表示TAT-PEffl融合蛋白的親和層析(Ni-NTAresin)純化，圖中1，throughpeakofsample;2，elutionpeakwithbuffer圖6表示TAT-PEHI融合蛋白親和層析純化的SDS-PAGE電泳，圖中1:低分子量蛋白標準；2:PQE-31載體誘導後；3:pQE-TAT-PEHI誘導表達產物；4:TAT-PEIH融合蛋白親和層析穿過峰；5、6:TAT-PEffl融合蛋白親和層析^J^;圖7表示MTT比色法測定TAT-PEID融合蛋白對B16細胞的影響；具體實施方式試劑與材料一、質粒、菌抹與細胞林表達質粒pQE-31為德國Qiagen公司同名產品，pUCm-T載體為上海生工產品，重組了PE全長基因的pQE-PE重組質粒由本室構建，大腸埃希菌JM109以及B16黑色素瘤細胞抹由本室保存。二、主要試劑試劑名稱戶"iS;rTaqDNA聚合酶T4DNA連接酶(T4DNALigase)T4DMDNA多聚酶(T4DNAPolymerase)Ni-NTA親和樹脂(Ni-NTAagarose)笨甲基磺醯氟(PMSF)還原型穀胱甘肽/氧化型穀胱甘肽(GSH/GSSG)小牛血清DMEM培養液胰酶(trypsin)四甲基偶氮唑鹽(MTT)二甲基亞碸(DMS0)丙三醇(甘油)試劑來源美國MBI公司曰本Takara公司日本Takara公司日本Tak:ara公司曰本Takara公司美國Promega公司美國MBI公司德國Qiagen〃>司上海生工美國Amresco分裝成都哈裡/>司美國Gibco7^司美國BI0S0URCE公司美國BBI公司成都科龍化工試劑廠北京紅星化工廠Hoechst33342染料北京晶美生物公司>^丙啶(PI)北京晶美生物公司實施例一、pQE-TAT-PEID重組質粒的分子i殳計1.在將HIVTatPTD核心序列的11個皿酸轉換為對應的核苷酸序列時，要兼顧HIV的密碼子使用偏嗜性，並且排除大腸埃希菌的稀有密碼子，以利於HIVTatPTD在大腸埃希菌中的正確高t良達。同時，在TAT11個胺基酸的兩側各加l個甘氨酸，以保證鍵的自由旋轉(freebondrotation)。(l)HIVTatPTD11個胺基酸所對應的核苷酸序列的確定在NCBI網站，查找到多個HIV-l分離株的基因序列，其中，AY358073的TAT蛋白PTD的a酸序列為YGRKORQRRR，與用於穿膜的TATPTD序列完全一致。HIV-lAY358073林TAT蛋白PTD序列對應的核苷^f列為tatggcaggaagaagcgaagacagagacgaaga。在這11個#^酸中，有6個精氨酸(R)，其對應的核苷酸序列為第3、6、7、9、10、ll位的胺基酸；兼顧精氨酸在HIV-l和E.的使用偏嗜性，將HIV-1AY358073林TAT蛋白PTD序列中兩個精氨酸(第6、10位)的使用密碼cga替換為cgt;除精氨酸外，其餘5個胺基酸的密碼使用情況均不含有大腸埃希菌(E.fo//)的稀有密碼子，可以保留原核苷酸序列。因此，用於構建pQB-TAT-PElH重組質粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為Utggcaggaagaagcgtagacagagacgtagae(2)加在TATPTD兩側的甘氨酸的密碼子選擇兼顧甘氨酸在HIV-l和E.的使用偏嗜性，選擇ggc作為甘氨酸的使用密碼。2.根據GenBank公布的PE^S序列，針對PE的HI區設計特異性引物。在上遊引物的5端依次引入保護M(CAT)、,wn酶切位點(CAG'CTG)、與HIVTatPTD核心序列的11個^酸相對應的g序列、戶WI酶切位點(CTGCA，G)，設計的上遊引物長度達74bp，序列為PTW:5，-CATCAGCTGGCTATGGCAGGAAGAAGCGTAGACAGAGACGTAGAGGCCTGCAGTTCCTCGGCGACGGCGGCGAC-3，。下遊引物為P2，序列為5，"GCGCAAGCTTCAGTTACTTCAGG-3，。5，端引入#//^111酶切位點，i殳計的引物委託上海生工生物工程z^司合成。3.為了減少目的蛋白中的外源序列，通常儘量選用載體多克隆位點兩側的酶切位點來克隆目的片段，pQE-31多克隆位點兩側的酶切位點分別是勘iI和W/3dffl。經DMStar軟體分析，#//3dDI在擬插入的目的片段PE邁中沒有切點，可用；勘/aHI在PEm中有切點，因此不能直接^f吏用，為此，^研究擬先用勘iaHI對pQE-31進行酶切，再用T4DNAPolymerase補平粘端，與經過平端酶UV〃n)酶切的目的片段進行連接，以克隆目的片段。4.利用/Vi/n、#//7dm酶切位點，將目的基因克隆於原核表達栽體pQE-31中，重組質粒^^名為pQE-TAT-PEIII。5.pQE-TAT-PEIH重組質粒經位於PEffl目的片段5，端的A,I和3，端的#//dHI雙酶切後，即為線性化的pQE-TAT載體，還可用於克隆其它的目的片段。實施例二、PCR擴增同時含有TatPTD和PEHI的目的基因1.PCR擴增及產物回收反應體系如下pQE-PE重組質粒模板PTAT(8.3nmol/L)2plP2(6.7,l/L)2pldNTPs(每個2.5咖ol/L)1^1&r時DNA聚合酶(5U/fU)0.5pl10xPCRbuffer5ji125mol/LMgCl24^150%甘油5plDMSO2.5plddH20_27plTotal50[ilPCR反應糾94匸，2min;94€,40sec，—48t:，40sec，—72匸，lmin，2個循環；94X:，40sec，—58t:，40sec，—72t:，lmin，20個循環；72ClOmin。電泳證實擴增出了與預期大小相符的目的片段後，採用膠回收試劑盒回收純化目的片段，-20匸保存備用。在PCR擴增的上遊引物中，引入了TatPTD的g序列，通過PCR擴增，可以實現TatPTD和PEHI片段目的基因的融合結論以pQE-PE重組質粒為;j^板，用5'端引入HIVTatPTD核心序列的P麗和5'端引入W/7dffl酶切位點的P2為引物，進4亍PCR擴增反應，1%瓊脂糖,電泳顯示，在700bp左右有一清晰條帶，與設計的片段大小(729bp)相符(見圖2-1)。實施例三、pUCm-T-TAT-PEin重組質粒的構建1.pUCm-T載體與TAT-PEIHPCR產物的連接反應pUCm-T栽體lplPCR產物(TAT-PEm)3pl10xbufferforT4DNALigaseT4DNALigase(5U/pl)lplPEG4000lplformulaseeoriginaldocumentpage12反應條件16*C，16h，—65*C，10min。2.連接產物轉化;^埃希菌JM109取5pl連接產物轉化到lOOjilJM109感受態細胞中，取200nl轉化產物塗布LB(AMP)平板(表面塗布X-gal和IPTG)，37t:孵育18h。3.篩選陽性重組子從轉化平板上隨，取8個白色菌落,分別接種於3mlLB(AMP)液體培養基，37"C振搖培養18h。鹼裂解法少量提取質粒，用ZVtfII、A'/2dffl進行雙酶切鑑定，酶切體系如下質粒■8pl/Vtfll(12U/V1)0.5plW/3dm(15U/jU)0.5ji110xMbuffer_Total10pl反應條件371C,3h。酶切產物行1%瓊脂糖皿電泳分析，同時對篩選到的重組質粒進行核苷酸測序鑑定。實施例四、pQg-TAT-PEHl重組質粒的構建(參見圖1)1.I酶切pQE-31質粒及酶切產物回收pQE-31質粒的勘滷I酶切反應體系pQE-31質粒67jil勘/rflI(萌nl)5pl10xbuffer_8plTotal80jU反應條件37"C，3h。採用1%瓊脂糖^^電泳、膠回收試劑盒回收上述pQE-31經勘/aHI酶切線性化質粒，回收產物溶於30pl(idH20中，於-20lC保存備用。2.3'突出端補平反應體系如下pQE-31/^jzflI線性4t質粒30^15xbuffer8^1dNTPs(每個2.5腸1/L)1.5plT4■Polymerase_0.8^1Total40.3pl混勻後置於PCR儀中，反應務fr:20min，—70匸，10tnin。採用1%瓊脂糖粉艮電泳、膠回收試劑盒回收補平的pQE-31/勘成I線性化質粒，回收產物溶於25plddH20中，於-20匸M備用。3.#//3d邁酶切及酶切產物回收反應體系如下補平的PQE-31/勘isHI線性化質粒25jUW/Jdm(15U/nl)2pl10xMbuffer_^Total30jil反應條件37C,3h。採用l4瓊脂糖皿電泳、膠回收試劑盒回收上迷pQE-31經勘irfU及#//3dm酶切的線性化質粒，回收產物溶於20plddHz0中，於-20x:絲備用。4.pUCm-T-TAT-PEHI重組質粒的雙酶切反應反應體系如下:tableseeoriginaldocumentpage14反應條件37匸，3h。採用1%瓊脂糖:^電泳、回收產物溶於20plddH20中，於-20r絲備用。5.雙酶切產物連接反應反應體系如下pQE-31片段TAT-PEm片段T4DNALigase(5U/pl)10xbufferforT4DNALigase膠回收試劑盒回收純化，6|il1.6"Total16.6fil混勻後置於PCR儀中，反應條件16"C，16h，—65"C,10min。6.連接產物轉化JM109取10nl連接產物轉化到lOOjilJM109感受態細胞中，塗布LB(AMP)平板，37t:孵育18h，觀察菌落生長情況。7.陽性重組子的篩選、鑑定^L轉化平板上的菌落，接種於4ml含AMP的LB液,養基中，37t:振搖培養18h，鹼裂解法少量提取質粒，用戶WI、jW/3dm進行酶切鑑定，同時對篩選到的重組質粒進行核苷酸測序鑑定。結論pQE-TAT-PEm重組質粒雙酶切及核苷酸測序鑑定將TAT-PEHI的PCR純化產物與pUCm-T載體連接，篩選到的陽性pUCm-T-TAT-PEm重組質粒經戶ran/#/'/3dHI雙酶切後、回收純化，與經勘通I酶切、3，突出端補平、#//dm酶切的pQE-31質粒片段進行連接，連接產物轉化JM109細菌感受態細胞，，菌落，提取質粒DNA,用/W/3dm進行雙酶切鑑定，酶切產物經1%瓊脂糖皿電泳，結果見圖2-2。由圖可見，陽性重組質粒可切出預期大小片段(理論值為645bp)。對重組質粒進行核苷酸測序，結果表明，重組質粒的序列和閱讀框均正確，與我們最初的分子設計完全吻合(見圖3)。實施例五、目標蛋白的放大表ii^包涵體製備依照小規模培養法，各種成分按比例增加到2000ml,用LB培養基對pQE-TAT-PEffl/JM109工程菌進行培養和表達，以擴大產量。按如下方法製備包涵體1.8000rpm離心收集表達菌體，每升培養物可產生3~4g溼細胞沉澱。按每克細胞沉澱加3mlbufferA充分混懸細菌，13000g離心10min。2.將沉澱重懸於IO倍體積的bufferA中，加入8jillOOmmol/LPMSF。在冰浴中超聲破菌，i爻置條件為工作3sec，間歇2sec,全程40min，取樣塗片，用顯^t^^L察破菌情況.3.超聲結束後，加TritonX-l00，使終濃度為0.1°/。，混勻，4X:靜置30min。4.13000g離心lh。棄上清，將沉澱重懸於3倍體積的bufferA中。5.13000g離心10min。將沉澱重懸於3倍體積的bufferA中。6.13000g離心20min。將沉澱重懸於9倍體積含0.1%p-巰基乙醇的bufferB中，4X:冰箱放置2h,不時搖動以溶解包涵體。將裂菌液上清及沉澱溶解液上清取樣行SDS-PAGE電泳分析。結論pQE-TAT-PEHI重組質粒在JM109中的誘導表達將pQE-TAT-PEm重組質粒轉化大腸埃希菌JM109，篩選到了表達穩定的pQE-TAT-PEm/JM109工程菌。將篩選到的陽性工程菌pQE-TAT-PEIII/JM109過夜培養後，次日按l:50的比例擴大培養至A6。。《0.6，加入IPTG至終濃度為100pmol/L,37X:誘導表達5h,取適量的表達菌行SDS-PAGE電泳，結果如圖4所示，從圖中可見陽性重組子在約27kDa處有一條蛋白帶，此蛋白與推測的融合蛋白分子量大小相符，為序列正確的陽性重組子表達產物。實施例六、TAT-PEHI融合蛋白的親和層析純化1.用Qiagen公司的Ni-NTA純化系統，採用pH皿的方法對目標蛋白進行親和層析純化。2.取2ml填料，離心去掉保存液，並用bufferB(pH8.0)洗滌兩次，再用其重懸填料，然後裝柱，採用bufferB平衡柱子，取經0.22,濾膜過濾的TAT-PEin包涵體溶解液上清3ml上樣，續以bufferC(pH6.3)衝洗雜蛋白，待UV值回歸基線後，用bufferD(pH4.5)洗脫目標融合蛋白，收集UV>0.05的峰，最後用bufferB淨化平衡柱子。將上述各步留取的樣品作SDS-PAGE電泳分析。結論TAT-PEHI融合蛋白的Ni-NTA親和柱層析從親和層析純化圖譜(圖5)可見，加入pH4.5的bufferD後，出現一洗脫峰；SDS-PAGE電泳顯示(圖6)，在親和層析穿過峰中無目標蛋白質存在，洗脫峰中含分子量約27kD的蛋白質，與TAT-PEm融合蛋白理論分子量相符，說明在載量範圍內，親和層析柱可完全捕獲該融合蛋白；且捕獲的融合蛋白純度高，基本無雜蛋白存在，表明採用親和層析可實現TAT-PEm融合蛋白的一步純化，實施例七、目標蛋白的透析復性TAT-PEHI融合蛋白的等電點為8.44，在pH9.0的透析液中進行復性。1.調整親和層析洗脫蛋白的濃度為0.1mg/ml，將稀釋後的變性蛋白溶液裝入預先處理好的透析袋(截留分子量1.4kD)中。2.將透析袋放入一隻裝有400ml透析液I的燒杯中，4"C,攪拌透析3~4h更換新的透析液I，重複此步驟兩次.3-將透析袋itX400ml透析液n中，4t:,攪拌透析34h。更換新的透析液II，重複此步驟兩次。4.將透析袋敘400ml0.01mol/L的PBS中，4t:，攪拌透析3-4h。5.將透析袋放入400ml滅菌去離子水中，4t:，攪拌透析3-4h。6.將透析袋中溶液合併，冷凍乾燥。用0.Olmol/L的PBS溶解，0.22咖濾膜過濾除菌，採用BCA法進行蛋白濃度測定。實施例八、BCA法測定目標蛋白濃度將已復性的蛋白濃縮凍幹，TAT-PEIH凍乾產物，用0.01mol/L的PBS溶解，0.22um濾膜過濾除菌，從中取2pl加入到98plddH20中，以ddH20為空白對照調零，在S腿rtSpec3000分光光度計上採用BCA法進4亍蛋白含量測定。測得TAT-PEIH樣品濃度為1.866mg/ml。用該樣品做活性鑑定。實施例九、TAT-PEm融合蛋白的體外抑瘤活性檢測(一)MTT法檢測TAT-PEID融合蛋白的體外抑瘤活性1.細胞準備B16細胞的培養、傳代與凍存參照《細胞培養》的方法進行。2.MTT檢測①將B16細胞以每孔103~1(T個細ii^種於96《L^，每孔200pl。培養24h36h後，吸棄上清，每孔加入細胞培養液150n1，再加入不同濃度的TAT-PEffl融合蛋白，每種濃度以及對照各設3個復孔。每孔終體積為200yl，於37TC，5義C02孵箱培養36h。②吸棄上清，以PBS洗一遍，每孔加入MTT(5mg/ml)20nl和細胞培養液180nl，繼續培養4h。③吸棄每孔上清，加入150plDMSO，終止培養，輕柔振蕩混勻10min。在680型酶標儀上以490nm波長測各孔光吸收值(OD)。實驗結果以細胞存活率表示細胞存活率(%)-(試驗組OD值/對照組OD值)x10054。一般以細胞存活率對藥物濃度對數作圖並掩泎圖法求出半數抑制濃度值UC50)。參見圖7。採用MTT法測定了TAT-PEm融合蛋白對腫瘤細胞的體外抑瘤活性，結果表明TAT-PEm融合蛋白對B16黑色素瘤細胞的半數抑制濃度(IC50值)為21.62ng/ml。(二)TAT-PEffl融合蛋白對B16細胞作用的形態學檢測螢光顯微皿察PE分子的細胞毒功能非常強大，m區是毒性功能區，具有ADP-核糖基轉移酶活性，通it^延伸因子-2的ADP-核糖基化抑制細胞的蛋白質合成而導致細胞死亡。而多細胞生物的細胞死亡存在兩種不同形式細胞凋亡與細胞壞死。細胞凋亡在一定情況下可轉化為細胞壞死，但兩者在形態學、生化代謝、分子機制、結局和意義等方面存在本質的區別。毒素分子通常以細胞壞死的形式引起細胞死亡。本文擬採用Hoechst/PI雙染色法來檢測TAT-PEIH融合蛋白究竟以何種形式引起B16細胞死亡。染色方法參照MTT實驗的IC50結果，向一瓶生長良好的B16細胞中加入500m12.5mg/ml的TAT-PEffl融合蛋白，37"，5%C02孵箱中培養36h後，800rpm離心5min收集藥物處理細胞，加入PBS,調細胞濃度至1x106以上。從中吸取40pl至1.5mlEp管中，加入35jj1Hoechst(終濃度10mg/ml),37r溫育20~30min;再加入PI3~5n1(終濃度10yg/ml)，4"C靜置10~20min;取一滴於潔淨載玻片上，加蓋玻片，置螢光顯微鏡下觀察。以未經TAT-PEffl融合蛋白處理的正常B16細胞為對照，同上染色。採用Hoechst/PI雙染色法進行形態學觀察，結果顯示，未經過千預的正常對照組僅見極少數細胞凋亡或壞死，可能為正常的細胞程序性死亡或機械操作引起的壞死。而與TAT-PEffl融合蛋白共稃育36h的B16細胞可見大量凋亡、壞死，表明TAT-PEDI融合蛋白對B16細胞具有明確的細胞毒作用；結果顯示，多數細胞同時出現凋亡與壞死，提示死細胞大多源於凋亡後期的繼發性壞死。實施例十、TAT-PE辺融合蛋白的體內抑瘤活性檢測(一)荷瘤動物4莫型的建立建立小鼠B16黑色素瘤模型，接種B16黑色素瘤細胞5x105個/只的小鼠全部有腫瘤長出，一周成瘤率100%;荷瘤兩周時，從40隻荷瘤鼠中剔除成瘤不良的10隻小鼠，將其餘30隻荷瘤鼠隨機分為兩組A組為對照組，B組為治療組，15隻/組。(二)荷瘤小鼠分組、給藥治療A^見察將成功荷瘤的小鼠隨機分為兩組，15隻/組。A組為對照組植入腫瘤，觀察黑色素瘤的生長情況。B組為治療組荷瘤兩周後開始給藥，每天一次；參照MTT實驗的IC50結果，每次向瘤體內直接注入TAT-PEIH融合蛋白約70jig。4周後，所有動物均處死，取出黑色素瘤，稱取瘤重。實體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示。計算方法為瘤重抑制百分率-(l-試驗組瘤重/對照組瘤重)xl00。/。。中草藥抑制率大於30%，合成藥大於40%，且有統計學意義，重複3次，療效穩定，則評定有一定的抗腫瘤作用。荷瘤兩周後開始給藥。每天一次，每次向瘤體內直接注入TAT-PEIH融合蛋白約70yg。給藥時，對於直徑小於2cm的肺瘤，細針穿刺至肺瘤的中心進行單點注射即可；而對於直徑大於2cm的腫瘤，則沿穿刺路徑由i^5L近連續注射或在兩個路徑上分別進行連續注射，以儘可能實現整個瘤體完全的藥物轉導。治療過程中，未見荷瘤小鼠出現明顯的全身不^A應。治療4周後停藥，停藥次日處死小鼠，解剖皮下瘤塊，稱重。實體瘤的療效以瘤重抑制百分率表示。TAT-PEffl蛋白對BALB/C小鼠黑色素瘤的瘤重抑制百分率-(1_，組瘤重/對照組瘤重)x100%=52.75%，結果顯示TAT-PEm融合蛋白具有一定的抗腫瘤作用。序列表中國人民解放軍第三軍醫大學—種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEm融合蛋白及製備方法<130〉7P99054-CN2Patentlnversion3.3〈211>242PRTTAT-PEm融合蛋白的胺基酸序列<400〉1Met1ArgGlyGluPhe65PheGlyAspArgArgLysGlyArg50ValGlyLysAsp35LeuSerHisHisHisHisHisHisThrAspProGlyArg20Val5ArgGinArgArgSerPheSerLeuGinAlaGlyGlyGlyValTyrTyrHisPheGinVal130Glu115Tyrlie100ProArg85AlaGly70AlaHis55ThrThr40ArgArg25Arg10GlyLeuGinPheGlyThrGinGinLeuGluPheLeuGluAspAlaArgGlyAspProArgSerGinValProArgSer135Gly120SerAla105ArgAsp90LeuAla75LeuGlu60AlaAsn45ArgLeu30TrpTyr15GlyGlyAspThrValGlyTyrValGinSerlieAspAlaTyrGlylieArgAsnAlalieL6UProGlyPhe140Gly125TyrTyr110AlaTrp95AlaVal80ArgGinLeuLeuArgThrSerLeuThr145GlyHisLeuProAlaAlaProGluAlaAla150LeuProLeuArgLeuAsp165GluGlyGlyArgLeuGlu180lieProSerThrGlyGluValGluArgLeu155AlalieThrGlyProGlu170175GlyTrpProLeuAlaGluThrValVal195LeuAspProSerAlaGlyAsp210AlaLeu225LeuLyslieLeu185lieProThrAspPro200lieProAspLysAla190AsnVallie160GluArgGlyProAspTyrAla230Ser215SerGinProArg205GinAlalieSerGlyLys235Glu220ProProArgGluAsp2402〈211>729DNA編碼TAT-PEIII的DNA序列<400〉2atg卿ggatctcaccatcaccatcaccatacggatcctggctatggcaggaagaagcgt60agacagagacgtagaggcctgcagttcctcggcgacggcggcgacgtcagcttcagcacc120cgcggcacgcagaactggacggtggagcggctgctccaggcgcaccgccaactggaggag180cgcggctatgtgttcgtcggctaccacggcaccttcctcgaagcggcgca幼gcatcgtc240ttcggcggggtgcgcgcgcgcagccaggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatc300gccggcgatccggcgctggcctacggctacgcccaggaccaggaacccgacgcacgcggc360cggatccgcEiacggtgccctgctgcgggtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttc420taccgcaccaigcctgaccctggccgcgccggaggcggcgggcgaggtcgaacggctgatc480ggccatccgctgccgctgcgcctggacgccatcaccggccccgagg鄉a鄉cgggcgc540ctggagaccattctcggctggccgctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgatc600cccaccgacccgcgcaacgtcggcggcgacctcgacccgtccagcatccccgacaaggaa660caggcgatcagcgccctgccggactacgccagccagcccggcaaaccgccgcgcgaggac720ctgaagt幼729權利要求1、一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，其特徵在於，含有人類免疫缺陷病毒的TATPTD和銅綠假單胞菌外毒素A的III區。2、根據權利要求1所述的用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融^"白，其特徵在於，組成TAT-PEffl融合蛋白的TATPTD不含有大腸埃希菌E.Coli的稀有密碼子。3、根據權利要求2所述的用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，其特徵在於，該TAT-PEIH融合蛋白具有SEQIDNO:1所示的A^酸序列。4、一種編碼權利要求3所述的用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEID融合蛋白的DM序列，其特徵在於其具有SEQIDN0:2所示的序列或者編碼相同蛋白質的與其具有遺傳密碼簡併性的序列。5、一種權利要求1所述的用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIH融合蛋白的製備方法，其特徵在於，將TatPTD與PEffl融合製得，包含下列步驟確定人類免疫缺陷病毒的TatPTD胺基酸所對應的核苷酸序列；選4^加在TatPTD兩側的甘氨酸的密碼子；擴增同時含有TatPTD和PEffl片斷的目的基因。6、根據權利要求5所述的TAT-PEffl融合蛋白的製備方法，其特徵在於，所述用於構建pQE-TAT-PEm重組質粒的HIVTatPTD的核苷酸序列為tatggcaggaagaagcgtagacagagacgtaga。7、根據權利要求5所述的TAT-PEDI融合蛋白的製備方法，其特徵在於，所選擇的甘氨酸的密碼子為ggc。8、根據權利要求5所述的TAT-PE邁融合蛋白的製備方法，其特徵在於，所述目的基因長度為729bp,9、一種表達權利要求5、6、7、8中任一項所迷的目的基因的重組質粒，其特徵在於，所述質粒載體為pQE-TAT-PEEL10、根據權利要求9所述的重組質粒，其特徵在於，利用戶w/n、〃/;3dffl酶切位點，將目的基因克隆於原核表達載體pQE-31中製得。全文摘要本發明提供一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白，它由人類免疫缺陷病毒的TATPTD與銅綠假單胞菌外毒素A的III區組成。本發明還提供一種用於腫瘤局部介入治療的TAT-PEIII融合蛋白的製備方法。用本發明方法所得TAT-PEIII融合蛋白保留了免疫毒素對腫瘤細胞的高殺傷活性，同時具有轉導效率高、分子量小的優點，克服了免疫毒素的局限性。用於介入治療，可以避免TAT-PEIII融合蛋白在治療過程中對正常組織細胞的損害。文檔編號C12N15/63GK101125891SQ20071009246公開日2008年2月20日申請日期2007年7月20日優先權日2007年7月20日發明者歡李,胡曉梅,胡福泉,饒賢才,黃建軍申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學