親和性的明膠-氨基矽烷-陽極氧化鋁複合膜的製備方法

2023-10-11 02:11:34 1

專利名稱：親和性的明膠-氨基矽烷-陽極氧化鋁複合膜的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種用於蛋白分離的親和膜的製備方法，尤其是具有親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法。
技術背景傳統柱親和分離使用的顆粒狀吸附劑具有"死端"式孔結構，目標蛋白與配基的結合受 到表面液膜擴散、孔擴散以及吸附動力學三方面速度的限制，其中主要傳質阻力來自孔擴散。 親和膜分離與其相比具有"通孔"或"對流孔"，則只受表面液膜擴散及吸附動力學的影響， 消除了孔擴散這一速度控制過程，從而可在較低的操作壓力和較高的流速下對目標蛋白進行 快速分離和純化，縮短操作時間、提高純化效率，減少分離能耗。親和膜分離技術要求膜基質具有親水性，物理、化學性質穩定，機械穩定性好，孔徑和孔隙率分布均勻，可利用的化學基團(如-OH基、-NH2基、-COOH基等)多，非特異性吸附低等特點[Ge DT, Shi W， Ren L, et al., Journal of Chromatography A, 2006, 1114: 40-44〗。陽極氧化鋁膜具有孔徑均一、排列有序、分布均勻等特點，常作為模板用於"納米複製"技術來製備各種功能材料的納米管、納米線、納米結構陣列體系及量子點陣等。陽極氧化鋁膜具有理想的孔徑和孔隙率分布以及較好的化學和機械穩定性，具有作為親和膜基質膜的潛力，但由於陽極氧化鋁膜上活性基團含量少，很難固載大量的配基，必須對其進行化學改性，使其滿足作為親和分離介質的要求，然而目前尚未見有關陽極氧化鋁膜改性的相關報導。 發明內容本發明的目的在於提供一種具有較多的活性基團(-NH2基、-COOH基)，良好的親水性 和生物相容性，可廣泛應用於親和分離，以氨基矽烷偶聯劑為活化劑的親和性的明膠一氨基 矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法。本發明的具體步驟如下1) 陽極氧化鋁膜的活化以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸置於10% 20 %氮基矽烷溶液中，於20 7(TC下反應0.5 2h ，取出膜清洗、乾燥，得帶有環氧基的陽極氧化鋁膜；2) 明膠一環氧基矽垸一陽極氧化鋁複合膜的製備將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸於含有l-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDOHC1)的明膠HC1水溶液中於20 4(TC下 反應12 36h ,取出複合膜清洗、乾燥，即得明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜；或將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸於濃度為0.5% 4.0%的羰基二咪唑的丙酮溶液中於 20 5(TC下反應0.5 2h ，然後再將膜置於濃度為2 8mg/ml的明膠水溶液中於20 40 °C 下反應2 8h ，取出複合膜清洗、乾燥，即得明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜。陽極氧化鋁膜的孔徑最好為0.1 0.8 pm，厚度最好為30 200 pm，孔隙率最好為40% 85 o/o。環氧基矽垸溶液的溶劑為無水乙醇和pH5.0乙酸鈉一冰醋酸緩衝液的混合溶液，無水乙 醇與乙酸鈉一冰醋酸緩衝液的體積比為(10 15) : 1。氨基矽烷可為Y-氨丙基三乙氧基矽垸、Y-氨丙基三甲氧基矽垸、，氨丙基甲基二甲氧基矽 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基矽垸。含有EDOHC1的明膠HC1水溶液中EDOHC1的濃度最好為5 20 mg/ml。明膠HC1水溶 液中明膠的濃度最好為2 8 mg/ml。明膠HC1水溶液的pH最好為3.0 5.0。本發明將明膠通過共價鍵偶聯在陽極氧化鋁膜上。選用的活化試劑為氨基矽烷偶聯劑，氨基矽烷作為連接兩種不同性質材料的"分子橋"已經在複合材料、塗料、膠粘劑等行業中得到了廣泛的應用。由於其無毒性、無汙染、適用廣泛、成本低、優異的粘接性能等優點，目前逐漸應用於生物醫學領域，作為一種活化或交聯試劑修飾藥物載體或生物材料基質。另外，所選用的改性材料明膠是一種熱水可溶的多肽化合物，由動物的皮、骨等結締組織中的膠原蛋白質水解而成，由於它具有來源豐富、親水性佳、生物相容性好和具有大量活性官能團(-NH2基、-COOH基)等優點，使其作為改性材料能夠彌補單一陽極氧化鋁膜材質在應用於親和膜時的缺陷。所製備的明膠一氨基矽垸-陽極氧化鋁複合膜具有活性官能團多、生物相容性好、孔徑和孔隙率分布均勻以及傳質阻抗小等優點，可有效提高親和分離的溶質回收率和配基利用率，進而提高親和分離效能。可廣泛用於親和純化分離。
具體實施方式
下面通過實施例對本發明作進一步說明。 實施例11. 陽極氧化鋁膜的活化將8ml，氨丙基三乙氧基矽垸、30ml無水乙醇和3ml乙酸鈉 -冰醋酸緩衝液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.15 ^m、厚度為200 pm、孔隙率為85 %的陽 極氧化鋁膜置於上述混合溶液中在7(TC反應0.5h 。膜取出用乙醇清洗後，150。C加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜的製備將160mg明膠溶於20mlpH3.0鹽酸溶 液中，加入400 mg EDOHCl，獲得含有EDOHC1的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1製備的帶 氨基的陽極氧化鋁膜置於上述溶液中在2(TC下振蕩反應36h ，反應結束後用大量蒸餾水振蕩清洗膜24h ，於40'C烘箱中乾燥lh ，即得明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜。 3.明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠量的確定(1) 標準曲線的繪製取400mg茚三酮、50mgSnCl2溶於10ml二甲亞碸中，加入2ml 2 mol/L的乙酸鈉溶液，配製成茚三酮顯色液。取100 mg明膠溶於5 ml pH3.0檸檬酸水溶液 中，在9CTC水浴條件下水解24h ，冷卻至室溫加入5 ml pHll.O NaOH溶液使體系呈中性。 依次用移液管準確量取Oml， 0.2ml， 0.4ml， 0.6 ml， 0.8 ml ， 1.0 ml的該溶液置於比色管中， 分別加入1 ml茚三酮顯色液，用蒸餾水補加至10ml，充分搖勻，在9(TC水浴加熱15min後， 冷卻至室溫，於570nm下比色。所得數據繪製標準曲線。(2) 樣品含量的測定取製備所得的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜，用分析天平 精密稱重後剪碎置於含2mlpH3.0檸檬酸水溶液的比色管中，在9(TC水浴條件下水解24h ， 冷卻至室溫加入2mlpH11.0NaOH溶液使體系呈中性。放置5-10min後，加入1 ml茚三酮顯 色液，在9(TC水浴加熱15min後，冷卻至室溫，於570 nm下比色。測得所製備的明膠一氨 基矽烷一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠的量為70±4 (mg明膠)/(g膜)。實施例21. 陽極氧化鋁膜的活化將3.5mlr氨丙基三甲氧基矽烷、30ml無水乙醇和2ml乙酸 鈉-冰醋酸緩衝液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.7nm、厚度為80pm、孔隙率為55 %的陽 極氧化鋁膜置於上述混合溶液中，在6(TC反應lh 。膜取出用乙醇清洗後，15(TC加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠—氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備將40 mg明膠溶於20 ml pH5.0鹽酸溶 液中，加入100 mg EDOHC1,獲得含有EDOHC1的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1製備的帶 氨基的陽極氧化鋁膜置於上述溶液中在35'C下振蕩反應30h ，反應結束後用大量蒸餾水振蕩 清洗膜24h ，於40。C烘箱中真空千燥lh ,即得明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜。3. 明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯明膠的量為53±6(mg明膠)/(g膜)。實施例31. 陽極氧化鋁膜的活化將5ml，氨丙基甲基二甲氧基矽垸、28ml無水乙醇和2ml乙 酸鈉-冰醋酸緩衝液(pH5.0)混合，取一片孔徑為0.4pm、厚度為30)tmi、孔隙率為65 %的 陽極氧化鋁膜置於上述混合溶液中在20。C反應2h 。膜取出用乙醇清洗後，15(TC加熱lh ， 即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠—氨基矽烷一 陽極氧化鋁複合膜的製備將200 mg明膠溶於20 ml pH 4.0鹽酸溶液中，JnA0.25gEDOHCl，獲得含有EDOHCl的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1製備的帶氨 基的陽極氧化鋁膜置於上述溶液中在2(TC下振蕩反應24h ，反應結束後用大量蒸餾水振蕩清 洗膜24h ，於4(TC烘箱中乾燥lh ，即得明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜。3.明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯明膠的量為65±8 (mg明膠)/(g膜)。實施例41. 陽極氧化鋁膜的活化將5.5ml 氨丙基甲基二乙氧基矽垸、30ml無水乙醇和2ml 乙酸鈉-冰醋酸緩衝液(pH5.0)混合，取一片孔徑為O.l pm、厚度為120 pm、孔隙率為40 % 的陽極氧化鋁膜置於上述混合溶液中在40。C反應1.2 h 。膜取出用乙醇清洗後，15(TC加熱 lh ，即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基矽烷—陽極氧化鋁複合膜的製備將130 mg明膠溶於20 ml pH 3.5鹽酸溶 液中，加入0.35gEDOHCl，獲得含有EDOHCl的明膠鹽酸溶液。取一片步驟1製備的帶氨 基的陽極氧化鋁膜置於上述溶液中在4(TC下振蕩反應12h ，反應結束後用大量蒸餾水振蕩清 洗膜24h ，於40'C烘箱中乾燥lh ，即得明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜。3. 明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯明膠的量為67±5 (mg明膠)/(g膜)。實施例51. 陽極氧化鋁膜的活化取一片孔徑為0.4 pm、厚度為30^m、孔隙率為80 %的陽極 氧化鋁膜按照實施例1步驟1的方法進行活化，即得帶有氨基的陽極氧化鋁膜。2. 明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備將步驟1製備的帶有氨基的陽極氧化鋁 膜浸於1.5%的羰基二咪唑的丙酮溶液中，於20 。C下，振蕩反應lh ，用丙酮清洗3次，並 置於4(TC烘箱中真空乾燥30min。將羰基二咪唑活化後的膜置於2 mg/ml的明膠水溶液中。 於室溫下，振蕩反應5h 。取出該膜置於40'C烘箱中真空乾燥2h ，即得明膠一氨基矽烷一 陽極氧化鋁複合膜。3. 明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜上偶聯明膠量的確定按照實施例1步驟3的方 法確定膜上偶聯明膠的量為65±8 (mg明膠)/(g膜)。
權利要求
1.親和性的明膠-氨基矽烷-陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特徵在於其具體步驟如下1)陽極氧化鋁膜的活化以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸置於10％～20％氨基矽烷溶液中，於20～70℃下反應0.5～2h，取出膜清洗、乾燥，得帶有環氧基的陽極氧化鋁膜；2)明膠-環氧基矽烷-陽極氧化鋁複合膜的製備將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸於含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的明膠HCl水溶液中於20～40℃下反應12～36h，取出複合膜清洗、乾燥，即得明膠-氨基矽烷-陽極氧化鋁複合膜；或將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸於濃度為0.5％～4.0％的羰基二咪唑的丙酮溶液中於20～50℃下反應0.5～2h，然後再將膜置於濃度為2～8mg/ml的明膠水溶液中於20～40℃下反應2～8h，取出複合膜清洗、乾燥，即得明膠-氨基矽烷-陽極氧化鋁複合膜。
2. 如權利要求l所述的親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於陽極氧化鋁膜的孔徑為0.1 0.8 pm。
3. 如權利要求1或2所述的親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法， 其特徵在於陽極氧化鋁膜的厚度為30 200 )Lim。
4. 如權利要求1或2所述的親和性的明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜的製備方法， 其特徵在於陽極氧化鋁膜的孔隙率為40% 85 %。
5. 如權利要求l所述的親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於環氧基矽烷溶液的溶劑為無水乙醇和pH5.0乙酸鈉一冰醋酸緩衝液的混合溶液，無水 乙醇與乙酸鈉一冰醋酸緩衝液的體積比為10 15 : 1。
6. 如權利要求l所述的親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於氨基矽烷為Y-氨丙基三乙氧基矽烷、Y-氨丙基三甲氧基矽烷、Y-氨丙基甲基二甲氧基矽 垸或Y-氨丙基甲基二乙氧基矽垸。
7. 如權利要求1所述的親和性的明膠一氨基矽烷一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於含有EDC'HC1的明膠HC1水溶液中EDOHC1的濃度為5 20 mg/ml。
8. 如權利要求l所述的親和性的明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於明膠HC1水溶液中明膠的濃度為2 8mg/ml。
9. 如權利要求1所述的親和性的明膠一氨基矽垸一陽極氧化鋁複合膜的製備方法，其特 徵在於明膠HC1水溶液的pH為3.0 5.0。
全文摘要
親和性的明膠—氨基矽烷—陽極氧化鋁複合膜的製備方法，涉及一種用於蛋白分離的親和膜的製備方法。提供具有較多活性基團(-NH2基、-COOH基)，良好親水性和生物相容性，可應用於親和分離，以氨基矽烷偶聯劑為活化劑的親和性的明膠—氨基矽烷—陽極氧化鋁複合膜的製備方法。以陽極氧化鋁膜為基膜，將基膜浸於氨基矽烷溶液中反應，取出膜清洗乾燥得帶有環氧基的陽極氧化鋁膜，再浸於含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)的明膠HCl水溶液中反應，取出複合膜清洗乾燥即得；或將帶有氨基的陽極氧化鋁膜浸於羰基二咪唑的丙酮溶液中反應，將膜置於明膠水溶液中反應，取出複合膜清洗乾燥即得。
文檔編號B01D69/00GK101254416SQ20071000996
公開日2008年9月3日 申請日期2007年12月7日 優先權日2007年12月7日
發明者張其清, 沈雨青, 巍 石, 葛東濤 申請人:廈門大學