納米免疫磁球、其製備方法及用途
2023-10-11 07:47:54 2
納米免疫磁球、其製備方法及用途
【專利摘要】本發明提供一種納米免疫磁球、其製備方法及用途，納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。其製備方法包括：納米磁球的活化；納米磁球的偶聯：將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為：偶聯溫度為4～37℃，偶聯時間為2～12小時；抗體的濃度為10～200μg/mL；保存。納米免疫磁球的粒徑遠小於常規的免疫磁球，是一種分散效果好、穩定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。
【專利說明】納米免疫磁球、其製備方法及用途
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種納米免疫磁球、其製備方法及用途。
【背景技術】
[0002]沙門氏菌是一種革蘭氏陰性短桿菌，不形成芽胞，是引起人類食物中毒的主要病原菌之一，臨床上可表現為胃腸炎、腸熱病、菌血症綜合症或局灶性疾病。據統計，在世界各國的種類細菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。
[0003]目前，我國絕大多數檢測機構對沙門氏菌檢測的常規方法為分離培養方法，必須進行增菌培養以提高檢出率，因而具有檢測周期長、程序複雜、所需試劑繁多、檢出率較低等缺點，從而遠遠不能滿足現代檢測要求。
[0004]免疫磁球是一種新型的功能材料，免疫磁球表面偶聯有抗體，在反應體系中，通過抗體與反應介質中特異性抗原結合形成抗原一抗體複合物，此複合物在磁場的作用下定向移動，從而達到分離或檢測抗原的目的。通過免疫磁球分離抗原，具有樣品分離速度快、特異性強、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備等特點，而且不影響被分離細胞的生物學性狀和功能，目前已在醫學和生物學的許多方面發揮了重要作用。
[0005]但是，現有的沙門氏菌免疫磁球分離技術中，所使用的免疫磁球產品粒徑較大，一般都在I μ m以上，因此，在分離微生物過程中，具有免疫磁球溶液穩定性差、容易沉澱聚集、不利於對分離目標物的有效捕獲、有可能對被分離的微生物造成損傷、對微生物的檢測靈敏度低等缺陷。
【發明內容】
[0006]針對現有技術存在的缺陷，本發明提供一種納米免疫磁球、其製備方法及用途，納米免疫磁球的粒徑遠小於常規的免疫磁球，是一種分散效果好、穩定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。
[0007]本發明採用的技術方案如下:
[0008]本發明第一目的為提供一種納米免疫磁球,所述納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。
[0009]優選的，所述納米免疫磁球的平均粒徑為180_450nm。
[0010]本發明第二目的為提供一種納米免疫磁球的製備方法，包括以下步驟:
[0011]SI,納米磁球的活化:
[0012]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌後，磁分離移除上清液；
[0013]以所述PBST為溶劑，分別配製I?10mg/mL的EDC溶液和I?10mg/mL的NHS溶液；向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，在振蕩器上振蕩活化後，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；其中，EDC溶液和NHS溶液所使用的溶劑PBST為:10mM磷酸根濃度、pH為6.0?6.4、含有0.05%聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯Tween-20的緩衝液。1mM含義為10mmol/L。
[0014]向離心管中加入所述PBST，用所述PBST洗滌納米磁球後，磁分離移除上清液；使用PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0015]S2，納米磁球的偶聯:
[0016]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為4?37°C，偶聯時間為2?12小時；抗體的濃度為
10?200 μ g/mL ；
[0017]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用所述PBST洗滌後，加入質量分數為I?5% BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4?37°C ;封閉磁球的時間為I?12小時；
[0018]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，磁分離移除上清液後PBS洗滌；
[0019]S5，保存:
[0020]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有I?10%的甘油、0.1?I %酪蛋白、10?20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0021]優選的，SI中，磷酸鹽吐溫緩衝液PBST為10mM、pH為6.0?6.4、含有0.05%Tween-20的緩衝液。
[0022]優選的，SI中，所述EDC溶液濃度為I?10mg/ml ;所述NHS溶液濃度為I?1mg/ml ο
[0023]優選的，SI中，所述在振蕩器上振蕩活化的條件為:22?25°C條件下震蕩活化30?60分鐘。
[0024]優選的，SI中，所述PBS的pH = 7.0?7.4。
[0025]本發明第三目的為提供納米免疫磁球的用途，所述的納米免疫磁球用於富集沙門氏國。
[0026]實驗結果證明，本發明製備得到的納米免疫磁球對沙門氏菌具有特異性和靈敏性。
[0027]本發明的有益效果如下:
[0028]本發明提供一種納米免疫磁球、其製備方法及用途，納米免疫磁球的粒徑遠小於常規的免疫磁球，是一種分散效果好、穩定性強的免疫磁球，從而能夠方便、快捷、高效的分離出樣品中的沙門氏菌。
【具體實施方式】
[0029]納米免疫磁球製備實施例一
[0030]製備方法:
[0031 ] SI,納米磁球的活化:
[0032]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用30 μ L、pH為6.0、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；其中，本發明中，Tween-20含義為吐溫20。
[0033]以PBST為溶劑，分別配製lmg/mL的EDC溶液15 μ L、以及，10mg/mL的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，22°C條件下在振蕩器上震蕩活化60分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0034]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.4的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0035]S2，納米磁球的偶聯:
[0036]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為37°C,偶聯時間為12小時；抗體的濃度為200 μ g/mL ；
[0037]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300μ L5%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為37°C ;封閉磁球的時間為12小時；其中，BSA為牛血清白蛋白。
[0038]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0039]S5，保存:
[0040]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有10%的甘油、I %酪蛋白、10%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0041]納米免疫磁球製備實施例二
[0042]製備方法:
[0043]SI,納米磁球的活化:
[0044]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用100 μ L、pH為6.4、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；
[0045]以PBST 為溶劑，分別配製 10mg/mL、pH = 6.0 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，lmg/mL、pH為6.4的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，25°C條件下在振蕩器上震蕩活化30分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0046]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.0的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0047]S2，納米磁球的偶聯:
[0048]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為4°C,偶聯時間為2小時；抗體的濃度為10 μ g/mL ；
[0049]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4°C ;封閉磁球的時間為I小時；
[0050]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0051]S5，保存:
[0052]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有I %的甘油、0.1 %酪蛋白、20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0053]納米免疫磁球製備實施例三
[0054]製備方法:
[0055]SI,納米磁球的活化:
[0056]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用60 μ L、pH為6.2、濃度為10mM、含有0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；
[0057]以PBST 為溶劑，分別配製 8mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，7mg/mL、pH為6.1的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，23°C條件下在振蕩器上震蕩活化45分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0058]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0059]S2，納米磁球的偶聯:
[0060]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為21°C,偶聯時間為10小時；抗體的濃度為ΙΟΟμ g/mL ；
[0061]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為25°C ;封閉磁球的時間為5小時；
[0062]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0063]S5，保存:
[0064]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有8%的甘油、0.7%酪蛋白、15%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0065]納米免疫磁球製備實施例四
[0066]製備方法:
[0067]SI,納米磁球的活化:
[0068]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用80 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；
[0069]以PBST 為溶劑，分別配製 4mg/mL、pH = 6.3 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，9mg/mL、pH為6.1的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，24°C條件下在振蕩器上震蕩活化40分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0070]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.2的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0071]S2，納米磁球的偶聯:
[0072]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為12°C,偶聯時間為9小時；抗體的濃度為50 μ g/mL ；
[0073]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300 μ L4%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為16°C ;封閉磁球的時間為8小時；
[0074]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0075]S5，保存:
[0076]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有6%的甘油、0.2%酪蛋白、17%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0077]納米免疫磁球製備實施例五
[0078]製備方法:
[0079]SI,納米磁球的活化:
[0080]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用60 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；
[0081]以PBST 為溶劑，分別配製 6mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，8mg/mL、pH為6.2的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，24°C條件下在振蕩器上震蕩活化50分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0082]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0083]S2，納米磁球的偶聯:
[0084]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為26 °C,偶聯時間為8小時；抗體的濃度為150μ g/mL ；
[0085]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300 μ L4%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為32°C ;封閉磁球的時間為6小時；
[0086]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0087]S5，保存:
[0088]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有9%的甘油、0.3%酪蛋白、16%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0089]納米免疫磁球製備實施例六
[0090]製備方法:
[0091 ] SI,納米磁球的活化:
[0092]取未活化的納米磁球原料到離心管中，用80 μ L、pH為6.3、濃度為10mM、含有
0.05% Tween-20的磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌3次後，磁分離移除上清液；
[0093]以PBST 為溶劑，分別配製 3mg/mL、pH = 6.2 的 EDC 溶液 15 μ L、以及，9mg/mL、pH為6.3的NHS溶液15 μ L ;向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，23°C條件下在振蕩器上震蕩活化50分鐘，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；
[0094]向離心管中加入PBST，用30 μ L PBST洗滌納米磁球3次後，磁分離移除上清液；使用PH = 7.3的PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球；
[0095]S2，納米磁球的偶聯:
[0096]將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為19°C,偶聯時間為12小時；抗體的濃度為170 μ g/mL ；
[0097]S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用PBST洗滌3次後，加入300 μ L3%的BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為21°C ;封閉磁球的時間為7小時；
[0098]S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；
[0099]S5，保存:
[0100]將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有5%的甘油、0.8%酪蛋白、13%血清和
0.1 %疊氮鈉的溶液中。
[0101]試驗例I
[0102]本試驗例用於考察納米免疫磁球製備實施例1-6製備得到的納米免疫磁球是否偶聯上抗體。
[0103]抗體均選用商品化羊抗沙門氏菌多克隆抗體、未活化的納米磁球原料的粒徑均選定為180nm,分別對納米免疫磁球製備實施例1_6製備得到的樣品1_6進行對目標菌的捕獲試驗，試驗條件為:向編號為1、2、3、4、5、6的離心管中分別加入ImL的細菌培養液，然後分別向離心管1、離心管2、離心管3、離心管4、離心管5和離心管6中加入製備得到的納米免疫磁球樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5和樣品6,置25°C搖床中孵育0.5小時後,將離心管放置到磁分離架上，PBS洗滌後磁分離移除上清液；最後，每個離心管用ImL PBS重懸磁珠後，灌營養瓊脂平皿，置於37°C培養箱中培養24小時後觀察。敏感性試驗結果見表1。
[0104]表1
【權利要求】
1.一種納米免疫磁球,其特徵在於,所述納米免疫磁球的平均粒徑為100-1000nm。
2.根據權利要求1所述的納米免疫磁球，其特徵在於，所述納米免疫磁球的平均粒徑為 180_450nm。
3.—種權利要求1-2任一項所述的納米免疫磁球的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: SI，納米磁球的活化: 取未活化的納米磁球原料到離心管中，用磷酸鹽吐溫緩衝液PBST洗滌後，磁分離移除上清液； 以所述PBST為溶劑，分別配製I?10mg/mL的EDC溶液和I?10mg/mL的NHS溶液；向離心管中加入配製的EDC溶液和NHS溶液，在振蕩器上振蕩活化後，將離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液； 向離心管中加入所述PBST，用所述PBST洗滌納米磁球後，磁分離移除上清液；使用PBS重懸磁球，得到活化後的納米磁球； S2，納米磁球的偶聯: 將用於特異性捕獲和分離抗原的抗體經稀釋後加入離心管中，抗體和活化後的納米磁球發生偶聯反應，使抗體偶聯到活化後的納米磁球表面，得到納米免疫磁球粗品；其中，偶聯反應的反應條件為:偶聯溫度為4?37°C，偶聯時間為2?12小時；抗體的濃度為10?200 μ g/mL ； S3，將經S2處理後的離心管放置到磁分離架上，待磁球完全被吸附後，磁分離移除上清液；使用所述PBST洗滌後，加入質量分數為I?5% BSA封閉磁球；其中，封閉磁球的溫度為4?37°C ;封閉磁球的時間為I?12小時； S4，將經S3處理後的離心管放置到磁分離架上，磁分離移除上清液後PBS洗滌； S5，保存: 將經S4處理後的納米免疫磁球保存在含有I?10%的甘油、0.1?1%酪蛋白、10?20%血清和0.1 %疊氮鈉的溶液中。
4.根據權利要求3所述的納米免疫磁球的製備方法，其特徵在於，SI中，磷酸鹽吐溫緩衝液PBST為10mM、pH為6.0?6.4、含有0.05% Tween-20的緩衝液。
5.根據權利要求3所述的納米免疫磁球的製備方法，其特徵在於，SI中，所述EDC溶液濃度為I?10mg/ml ;所述NHS溶液濃度為I?10mg/ml。
6.根據權利要求3所述的納米免疫磁球的製備方法，其特徵在於，SI中，所述在振蕩器上振蕩活化的條件為:22?25°C條件下震蕩活化30?60分鐘。
7.根據權利要求3所述的納米免疫磁球的製備方法，其特徵在於，SI中，所述PBS的pH=7.0 ?7.4。
8.一種納米免疫磁球的用途，其特徵在於，權利要求1-2任一項所述的納米免疫磁球用於富集沙門氏菌。
【文檔編號】G01N33/569GK104133065SQ201310157681
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年5月2日 優先權日:2013年5月2日
【發明者】鄧奕, 杜美紅, 許迪莘 申請人:北京市科學器材公司