李斯特菌未檢出的計數單位是什麼（動物源性食品中細菌的檢測）

2023-10-09 23:40:03

李斯特氏菌在環境中無處不在，絕大多數食品中都存在該菌。肉類、蛋類、海產品、乳製品、蔬菜等都已被證實是李斯特氏菌的感染源。目前國際上公認的李斯特氏菌共有7個菌株：單核細胞增生李斯特氏菌、綿羊李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、威爾斯李斯特氏菌、西爾李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌、默氏李斯特氏菌7個種。其中單核細胞增生李斯特氏菌對人類致病性強，綿羊李斯特氏菌對人類也有一定致病性，其餘的李斯特氏菌無致病性。

單核細胞增生李斯特氏菌是一種人畜共患病的病原菌。它能引起人、畜的李氏特氏菌病，感染後主要表現為敗血症、腦膜炎和單核細胞增多。它廣泛存在於自然界中，食品中存在的單核細胞增生李斯特氏菌對人類的安全具有危險，該菌在4℃的環境中仍可生長繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一，檢測該菌具有重要的公共衛生意義。

1 病原學特徵

李斯特氏菌為兩端鈍圓、稍彎曲的小桿菌，大小為（0.4～0.5）μm×（0.5～2）μm，有時呈弧形（圖2-7）。多單在，有時排成V形或柵狀。R型菌落中的細菌呈長絲狀，長達50～100μm。在20～25℃下可形成4根周身鞭毛，能運動；但在37℃下可形成更少甚至1根鞭毛。該菌無莢膜，無芽孢。革蘭氏染色陽性，培養時間長的菌體有時可脫色為陰性。常呈兩極染色，無抗酸性。在感染動物的組織內呈球桿菌狀。

該菌為需氧及兼性厭氧菌，在普通瓊脂上可生長，但在含血或血清瓊脂上生長更好。在血瓊脂上生長時，菌落周圍有狹窄溶血環（圖2-8）；在血清瓊脂上可形成圓形、光滑、透明、淡藍色小菌落，直徑為1～2mm。肉湯培養呈均勻渾濁，有顆粒狀沉澱，不形成菌環及菌膜。該菌不產生硫化氫及靛基質，不還原硝酸鹽，石蕊牛乳在24h內變酸，但不凝固。MR試驗及VP試驗均為陽性。該菌在麥康凱培養基上不生長，菌體不分枝，過氧化氫酶陽性。

李斯特氏菌為腐生菌，生存能力強，能耐受培養基中含有0.04%的亞碲酸鉀、0.025%的鉈酸、3.75%硫氰酸鉀、10%氯化鈉和40%膽汁；能在2～42℃下生存（在0℃下能緩慢生長），能在冰箱冷藏室內較長時間生長繁殖；在酸性、鹼性條件下都適應。短時間的高溫巴氏消毒可以殺死李斯特氏菌。

2 流行病學特徵

單核細胞增生李斯特氏菌廣泛存在於自然界中，土壤、地表水、汙水、廢水、植物、青貯飼料、爛菜中均有該菌存在，多種動植物食品、人畜排洩物、汙水和青貯飼料中均可檢出。人和多種動物均可成為其宿主。動物很容易食入該菌，並通過口腔-糞便的途徑進行傳播。人主要通過食入軟奶酪、未充分加熱的雞肉、未再次加熱的熱狗、鮮牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、捲心菜色拉、芹菜、西紅柿、法式餡餅、凍豬舌等而感染，有85%～90%的病例是由食入被汙染的食品而感染的。

該菌可通過眼及破損皮膚、黏膜進入體內而造成感染，孕婦感染後通過胎盤或產道感染胎兒或新生兒，棲居於陰道、子宮頸的該菌也引起感染，性接觸也是李斯特氏菌病傳播的可能途徑，且有上升趨勢。

3 危害

單核細胞增生李斯特氏菌是近年來已被重視的病原菌。食品作為傳播單核細胞增生李斯特氏菌的媒介亦漸被重視。WHO關於單細胞增生李斯特氏菌食品中毒報告指出，4%～8%的水產品、5%～10%的乳及乳製品、30%以上的肉製品及15%以上的家禽均被該菌汙染。由於該菌在4℃冰箱保存的食品中也能生長繁殖，其危害性進一步增大。

1981年加拿大沿海發生的單核細胞增生李斯特氏菌暴發性流行經證實是由於單核細胞增生李斯特氏菌汙染的捲心菜色拉所致。1983年6月美國的麻薩諸塞州發生單核細胞增生李斯特氏菌中毒，經流行病學調查發現是由於飲用了含有單核細胞增生李斯特氏菌的巴氏消毒奶，調查結果表明為存在於患病奶牛所產奶細胞內部的單核細胞增生李斯特氏菌有很強的耐熱力所致。1999年底，美國發生了歷史上因食用帶有單核細胞增生李斯特菌的食品而引發的最嚴重的食物中毒事件，據美國疾病控制與預防中心資料顯示，在美國密西根州有14人因食用被該菌汙染的熱狗和熟肉而死亡，在另外22個州97人患該病，6名婦女流產。

1992—1995年在法國出產的奶酪及豬肉中發現單核細胞增生李斯特氏菌，自2001年11月以來，我國質檢部門多次從美國、加拿大、法國、愛爾蘭、比利時、丹麥等20多家肉類加工廠進口的豬腰、豬肚、豬耳、小排等30多批近千噸豬副產品中檢出單核細胞增生李斯特氏菌。

4 檢測方法

包括病原的分離鑑定及分子生物學方法、免疫學方法等。

4.1 細菌分離鑑定

（1）樣品處理將樣品保存於4℃冰箱中，若條件適宜，單核細胞增生李斯特氏菌會緩慢生長，若樣品已被冷凍，則應在檢測前解凍。

（2）預增菌與增菌取25g樣品放入225mL的李氏增菌肉湯（BLEB）中，混勻，進行預增菌培養。30℃培養4h後，加入放線菌酮或匹馬菌素等選擇性試劑，繼續30℃增菌培養48h。巴氏消毒奶、奶製品、酸奶酪、冷凍水產品等含有較少的酵母菌和較少黴菌，因此不需加入抗真菌劑。但生乳、幹的海產品或新鮮產品則需加入抗真菌劑。

（3）分離純化取增菌培養液劃線接種於含七葉苷的選擇分離培養基上：PALCAM瓊脂平板、（改良）牛津瓊脂平板或加入七葉苷和三價鐵的LPM瓊脂平板。以上含七葉苷的培養基根據具體要求而選用。（改良）牛津瓊脂平板、PALCAM瓊脂平板接菌後放置於35℃培養24～48h，含七葉苷和三價鐵的LPM瓊脂平板接菌後放置於30℃培養24～48h。在含七葉苷的培養基上，李斯特氏菌呈黑色，菌落周圍具有黑色的環。從這些培養基上挑取5個可疑菌落劃線接種到胰蛋白腖大豆腖培養基上，分離純化單菌落。同樣也可劃線接種到BCM李斯特氏菌顯色培養基上，單核細胞增生李斯特氏菌呈藍色，而綿羊李斯特氏菌在食品中不常見。單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌在ALOA李斯特氏菌顯色培養基上都呈藍色且在菌落周圍有酯酶環。在傳統的檢測方法中，利用胰蛋白腖大豆腖培養基進行菌落純化是必須的，因為選擇性培養基上分離出的菌落仍有可能包涵其他細菌。至少挑取5個菌落進行鑑定，因為在同一樣品中可能含有幾種李斯特氏菌，而利用BCM和ALOA李斯特氏菌顯色培養基可以減少挑取的菌落數。運用商業的Confirmatory培養基，或傳統的木糖/鼠李糖發酵肉湯或瓊脂，可以區別單核細胞增生李斯特氏菌和綿羊李斯特氏菌。胰蛋白腖大豆腖瓊脂平板需在30℃培養24～48h，若不需觀察運動，也可在35℃培養。對於這些認可的方法，可以用選擇性瓊脂分離李斯特氏菌，也可以輔助使用推薦的新的單核細胞增生李斯特氏菌Ｇ綿羊李斯特氏菌分離培養基。

（4）鏡檢從30℃或低於30℃培養的平板上挑取生長良好的典型菌落，塗於潔淨載玻片上，用0.85%生理鹽水製成懸浮液，壓上蓋玻片於相差顯微鏡的油鏡下觀察。李斯特氏菌為短杆狀，有輕微的旋轉和翻滾運動。而大的杆狀或快速運動的杆狀細菌則不是李斯特氏菌。應用陽性的李斯特氏菌做對照。革蘭氏染色試驗：將培養16～24h的培養物進行染色，李斯特氏菌呈短杆狀陽性菌。但若培養時間過長，染色會發生變化。

（5）生化鑑定

過氧化氫酶試驗：李斯特氏菌陽性反應。

溶血試驗：將7%羊血瓊脂平板底面劃分為20～25個小格，從胰蛋白腖大豆腖瓊脂平板上挑取菌落刺種到血瓊脂平板上，每格刺種一個菌落，於35℃培養24～48h，穿刺時儘量接近底部，但不要觸到底面，同時避免瓊脂破裂。於明亮處觀察潔淨的血瓊脂平板，單核細胞增生李斯特氏菌和西爾李斯特氏菌在刺種點周圍產生狹小的透明溶血環，英諾克李斯特氏菌無溶血環，綿羊李斯特氏菌產生大的透明溶血環。注意：不應據此來區別李斯特氏各種菌，這僅僅是一種溶血現象。用CAMP試驗來確證李斯特氏各種菌。注意：當血瓊脂平板的厚度比通常的5mm更薄時，非常容易觀察到溶血環，另外這可以通過覆蓋一層1～2mm血瓊脂來實現。

硝酸鹽還原試驗：只有默氏李斯特氏菌能降解硝酸鹽，可以此區分格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌。用胰蛋白腖大豆腖肉湯培養物接種到硝酸鹽肉湯中，35℃培養5d，加入0.2mL試劑A（磺胺酸冰醋酸溶液，將對氨基苯磺酸0.8g溶解於2.5mol/L乙酸溶液100mL中），再加入0.2mL試劑B（α-萘胺乙醇溶液，將α-萘胺0.5g溶解於2.5mol/L乙酸溶液100mL中），混勻，如出現紫紅色，則表明降解了硝酸鹽，存在亞硝酸鹽。如無顏色變化，則加入少量鋅粉，放置1h，如出現紅色，表明仍有硝酸鹽存在，未被細菌降解。

動力試驗：將胰蛋白腖大豆腖肉湯培養物接種到SIM（硫化物、吲哚、動力）培養基或改良塞耶-馬丁（MTM）培養基，室溫培養7d，逐日觀察，李斯特氏菌有動力，呈傘狀生長。在MTM培養基上形狀尤為突出，可以明顯觀察到傘形。另外，通過相差顯微鏡，可觀察30℃胰蛋白腖大豆腖培養基上的培養物的翻滾運動。

糖發酵試驗：將胰蛋白腖大豆腖瓊脂平板上培養物接種於含以下0.5%糖的紫色肉湯中（可加入小倒管）：葡萄糖、七葉苷、麥芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖。35℃培養7d。陽性反應是產酸，不產氣。所有李斯特氏菌對葡萄糖、七葉苷、麥芽糖都是陽性反應。除格氏李斯特氏菌和默氏李斯特氏菌外，其餘的李斯特氏菌對甘露醇呈陰性反應。若不同選擇性培養基上的純化物著色是確定的，則七葉苷發酵試驗可省略。

（6）小鼠毒力試驗檢測李斯特氏菌致病性的傳統試驗是Anton相交試驗，既小鼠注射試驗和雞胚注射試驗。小鼠抵抗力測定試驗是將細菌從腹腔注入，該實驗有很高的敏感性，可了解單核細胞增生李斯特氏菌對動物的致病性。

將4mgCarageenan（sigma typeⅡ）溶解在蒸餾水中，注射到18～20g體重的小鼠體內，24h後，李斯特氏菌開始表現毒性。小鼠體內的Carageenan（sigma type II）注射量應依據小鼠的體積而定，一般注射量為每1kg體重注射200mg。分離物在胰蛋白腖大豆腖中35℃培養24h後，再轉移到兩個管中，35℃培養24h，然後再將10mL的肉湯培養物轉移到離心管中，1600r/min離心30min，棄上清液，用1mL滅菌生理鹽水製成菌懸液，此時菌濃度為1×1010CFU/mL，稀釋成1×105CFU/mL，將0.1mL菌懸液注射到16～18g體重的Swiss小鼠體內，約注入104個菌，觀察5d內小鼠的死亡情況。非致病菌不會致小鼠死亡。用致病菌、非致病菌、Carageenan（sigma typeⅡ）處理的小鼠及未注射的小鼠做對照試驗。每組試驗用5隻小鼠，Carageenan（sigma typeⅡ）處理的小鼠應該能夠忍受0.1mL的PBS。

4.2 分子生物學鑑定

（1）DNA模板的製備取增菌液1mL於1.5mL離心管中，4000～5000r/min離心5min，棄上清液，向菌沉澱中加入50μL滅菌純水製成菌懸液，混勻後100℃煮沸10min，12000r/min離心5min，取上清2μL作為PCR模板。

（2）引物設計

引物1：上遊引物為5′-TATGTGCGATACCGCTTGAA-3′；下遊引物為5′-GAAACTAACGGＧGATAAAACC-3′，擴增片段長度為511bp。

引物2：上遊引物為5′-TTATGATGACGAAATGGCTTAC-3′；下遊引物為5′-ATGGACGATＧGTGAAATGAGC-3′，擴增片段長度為789bp。

（3）PCR擴增 PCR反應體系25μL，具體成分見表2-7。