一種提高綿羊克隆效率的方法
2023-10-09 23:59:04 1
專利名稱：一種提高綿羊克隆效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高綿羊克隆效率的方法，尤其是一種通過提高胚胎移植產羔率和成活率以提高克隆效率的方法，屬於胚胎移植領域。
背景技術：
目前克隆胚胎移植後的出生率平均不到10%，胎兒異常、流產和圍產期死亡率高， 出生後一周的死亡率最高可達 100 % (ffesthusin, Μ. E.，C. R. Long, Τ. Shin. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology, 2001, 55 :35-49)。Wilmut 米用乳腺上皮細胞、胎兒成纖維細胞體內培養、胎兒成纖維細胞體外培養，獲得的克隆綿羊出生率分別為 3.4%，5. 9%禾口 16. 6% (ffilmut I.，Schnieke A. E. , Mcwhir J.，et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385 :810-813)。對於體細胞核移植克隆綿羊出生率和成活率很低的情況很多文獻都有研究，研究大都偏重於體外培養對胚胎基因突變、基因組時空表達引起胎兒生長調節失控和發育異常的影響(Farin P. W. ,Croiser A. E. and Farin C. Ε. Influence of in vitro systems on embryo survival and fetal development in cattle.Theriogenology,2001，55 151-107 ；Thompson J. G. Comparison between in vivo—derived and in vitro—produced preelongation embryos from domestic ruminants. Reprod Fertil Dev 1997 ;9 :341-54)，但因移植，接產，保育工作不到位而導致克隆羊妊娠率和成活率降低的情況不容忽視。由於體細胞核移植克隆綿羊出生率和成活率很低，沒有大量的事實作為依據來制定一套切實可行的體細胞核移植克隆綿羊的胚胎移植、接產、保育方案，目前的文獻對於體細胞核移植克隆綿羊的胚胎移植、接產、保育工作並沒有詳盡的描述，特別是出生後羔羊的接產和保育工作更是一大空白，從2007年本實驗室出生了中國首例體細胞克隆綿羊至今，一直在進行體細胞核移植克隆綿羊的研究工作，技術水平不斷提高，摸索出了一套行之有效的克隆綿羊胚胎移植及接產保育方案。目前，本實驗室的克隆綿羊產羔率已從最初的5. 88%，提高到了 31.67%， 成活率達63%，且克隆羊具有正常的繁殖能力。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種提高綿羊克隆效率的方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案為將綿羊早期優質克隆胚胎移植入同期發情母羊體內，術後連續4個情期不返情的母羊視為妊娠母羊，加強妊娠母羊的飼養管理，對過大胎兒進行破腹產手術，對接產後的羔羊嚴格控制環境溫度在21-23°C，及時飼餵健康母羊初乳。具體實施步驟為1、受體母羊的同期處理選取2-4歲營養狀況良好的健康經產母羊，放孕酮陰道栓日記為第0天，第8天上午每隻羊注射200-250IU孕馬血清促性腺激素(PMSG)，第9天下午每隻羊注射1. 0-1. 2ml氯前列烯醇(PG)，第11天上午撤栓，第12-13天試情，每批移植挑選三隻同期發情的母羊自然交配作為「奶媽」，其他發情母羊準備作為受體母羊，手術當天空腹，母羊發情當天在實驗室進行卵母細胞的成熟。2、克隆胚胎的移植實驗室中製備優質體細胞核移植克隆胚胎，經過融合和激活後體外培養發育，胚胎移植時選取激活後24h-7a!卵裂均勻的胚胎，按每隻羊10-15枚胚胎分裝。將同期發情的母羊保定，術部消毒，在乳房前腹中線(兩條乳靜脈之間)切開皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，最後打開腹膜，將食指和中指由切口伸入腹腔，在與骨盆交界的前後位置觸摸子宮角，找到後用二指夾持，牽出創口外。創口要用被生理鹽水浸溼的紗布圍住，牽出的子宮角不與外皮接觸，循子宮角至該側輸卵管找到卵巢，不可觸摸，觀察排卵情況，用胚胎移植管按照保持液-空氣-胚胎-空氣-保持液的方法裝管，每段液柱長度不超過0. 5cm,空氣柱長度不超過0. 2cm，在排卵側，沿輸卵管傘部開口輕柔的將胚胎移植管插入到輸卵管狹部， 將胚胎推入，用手輕柔捋輸卵管防止胚胎及保持液倒流，縫合創面，注射80萬IU青黴素。手術過程中注意不能破壞卵巢上的血體，切記手術動作要輕柔，術後母羊單獨飼養。3、克隆羔羊的接產在術後第3個情期開始試情，加強妊娠母羊的飼養管理，及時將返情母羊從群體中剔出，連續4個情期不返情的母羊視為妊娠母羊，綿羊妊娠期為151-152天，妊娠母羊足月妊娠後，每日觀察母羊狀態，B超檢查胎兒大小，對於體形過大的胎兒，如果母羊出現分娩預兆，立刻準備剖腹產，對於能夠順產的母羊進行輔助生產，對於超過預產期5天的的代孕母羊實施剖腹產手術。觸摸懷孕母羊胎盤找到胎兒頭部，從胎兒頭頂部子宮切口，一隻手託舉胎兒後臀。另一隻手託住胎兒頭部取出胎兒。取出胎兒後立刻將胎兒氣管中的羊水擠出，剪斷並結紮臍帶，用消毒紗布清理胎兒口喉中的羊水，用吸痰器清理殘留在胎兒鼻腔內的羊水並刺激胎兒呼吸，迅速擦乾胎兒體表羊水，同時用碘酒給胎兒臍帶消毒，給體弱的羔羊吸氧1小時。剖腹產的母羊縫合後注射80萬IU的青黴素，2ml縮宮素，術後連續兩天注射青黴素，並人工輔助擠奶以保證乳汁正常分泌。4、克隆羔羊的保育對於克隆羔羊來說，出生後保溫很重要，迅速擦乾羔羊後將克隆羔羊放在21-23°C 的保育環境裡，飼養環境嚴格消毒，順產的母羊自然哺育克隆羔羊；對於剖腹產的羔羊，由於母羊術後用藥，胎衣一般M小時內脫落，要給克隆羔羊人工輔助哺乳，每隔4小時餵一次同期生產的「奶媽」的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆綿羊的體形都比正常交配生產的羔羊體型大，多數代孕母羊都需要接受剖腹產手術，此時「奶媽」的作用很重要，可以保證克隆羔羊吃到健康的初乳。本發明為克隆綿羊的胚胎移植、接產、保育提供一套科學有效的方法，有效的提高克隆綿羊的妊娠率、出生率和成活率。
具體實施例方式實施例1受體母羊的同期處理選取2-4歲營養狀況良好的健康經產母羊，放孕酮陰道栓記為第0天，第8天上午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)每隻羊注射200-250IU，第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每隻羊1.0-l.aiil，第11天上午撤栓，第12-13天試情，挑選三隻發情的母羊自然交配作為 「奶媽」，其他發情母羊準備作為受體母羊，手術當天空腹，母羊發情當天在實驗室進行卵母細胞的成熟。實施例2克隆胚胎的移植實驗室中製備優質體細胞核移植克隆胚胎，經過融合和激活後體外培養發育，胚胎移植時選取激活後24h-7a!卵裂均勻的胚胎，按每隻羊10-15枚胚胎分裝。將同期發情的母羊保定，術部消毒，在乳房前腹中線(兩條乳靜脈之間)切開皮膚和皮下組織，鈍性分離肌肉，最後打開腹膜，將食指和中指由切口伸入腹腔，在與骨盆交界的前後位置觸摸子宮角，找到後用二指夾持，牽出創口外。創口要用被生理鹽水浸溼的紗布圍住，牽出的子宮角不與外皮接觸，循子宮角至該側輸卵管找到卵巢，不可觸摸，觀察排卵情況，用胚胎移植管按照保持液-空氣-胚胎-空氣-保持液的方法裝管，每段液柱長度不超過0. 5cm,空氣柱長度不超過0. 2cm，在排卵側，沿輸卵管傘部開口輕柔的將胚胎移植管插入到輸卵管狹部， 將胚胎推入，用手輕柔捋輸卵管防止胚胎及保持液倒流，縫合創面，注射80萬IU青黴素。手術過程中注意不能破壞卵巢上的血體，切記手術動作要輕柔，術後母羊單獨飼養。實施例3克隆羔羊的接產在術後第3個情期開始試情，加強妊娠母羊的飼養管理，及時將返情母羊從群體中剔出，連續4個情期不返情的母羊視為妊娠母羊，綿羊妊娠期為151-152天，妊娠母羊足月妊娠後，每日觀察母羊狀態，B超檢查胎兒大小，對於體形過大的胎兒，如果母羊出現分娩預兆，立刻準備剖腹產，對於能夠順產的母羊進行輔助生產，對於超過預產期5天的的代孕母羊實施剖腹產手術。觸摸懷孕母羊胎盤找到胎兒頭部，從胎兒頭頂部子宮切口，一隻手託舉胎兒後臀。另一隻手託住胎兒頭部取出胎兒。取出胎兒後立刻將胎兒氣管中的羊水擠出，剪斷並結紮臍帶，用消毒紗布清理胎兒口喉中的羊水，用吸痰器清理殘留在胎兒鼻腔內的羊水並刺激胎兒呼吸，迅速擦乾胎兒體表羊水，同時用碘酒給胎兒臍帶消毒，給體弱的羔羊吸氧1小時。剖腹產的母羊縫合後注射80萬IU的青黴素，2ml縮宮素，術後連續兩天注射青黴素，並人工輔助擠奶以保證乳汁正常分泌。實施例4克隆羔羊的保育對於克隆羔羊來說，出生後保溫很重要，迅速擦乾羔羊後將克隆羔羊放在21-23°C 的保育環境裡，飼養環境嚴格消毒，順產的母羊自然哺育克隆羔羊；對於剖腹產的羔羊，由於母羊術後用藥，胎衣一般M小時內脫落，要給克隆羔羊人工輔助哺乳，每隔4小時餵一次同期生產的「奶媽」的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。一般克隆綿羊的體形都比正常交配生產的羔羊體型大，多數代孕母羊都需要接受剖腹產手術，此時「奶媽」的作用很重要，可以保證克隆羔羊吃到健康的初乳。通過改進實驗方案，目前本實驗室的克隆羊產羔率從最初的移植17隻受體羊，1隻妊娠，妊娠率為5. 88 %，產羔羊1隻，產羔率為5. 88 %，到現在移植60隻受體羊，妊娠18隻，妊娠率為30 %，產羔19隻，產羔率為31.67%。以上所述，僅為本發明的較佳實施例，並非對本發明作任何形式上和實質上的限制，凡熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案範圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發明的等效實施例；同時，凡依據本發明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬於本發明的技術方案範圍內。
權利要求
1.一種提高綿羊克隆效率的方法，其特徵在於包括如下步驟1)激素處理使受體母羊發情；2)將優質綿羊克隆胚胎移植入激素處理過的同期發情母羊；3)術後連續4個情期不返情的母羊視為妊娠母羊，加強妊娠母羊的飼養管理；4)對超過預產期5天和胎兒體形過大的代孕母羊實施剖腹產手術，對接產後的羔羊嚴格控制保育溫度，飼餵健康母羊的初乳。
2.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟2)所述克隆胚胎為移植激活後M-72小時胚齡的卵裂均勻胚胎，胚胎移植數量保證在10-15枚。
3.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟4)所述環境溫度為21-23°C。
4.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟1)所述的激素為孕酮、孕馬血清促性腺激素及氯前列烯醇。
5.權利要求1或5所述的方法，其特徵在於步驟1)所述的激素處理的方法為選取2-4 歲營養狀況良好的健康經產母羊，放孕酮陰道栓記為第0天，第8天上午注射孕馬血清促性腺激素(PMSG)每隻羊注射200-250IU，第9天下午注射氯前列烯醇(PG)每隻羊1. 0-1. 2ml, 第11天上午撤栓，第12-13天試情，挑選三隻發情的母羊自然交配作為「奶媽」，其他發情母羊準備作為受體母羊，手術當天空腹，母羊發情當天在實驗室進行卵母細胞的成熟。
6.權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟4)所述保育方法為羔羊出生後迅速擦乾體表，將克隆羔羊放在21-23°C的保育環境裡，順產的母羊自然哺育克隆羔羊，對於剖腹產的羔羊，由於母羊術後用藥，胎衣一般M小時內脫落，為避免藥物對羔羊的影響要給克隆羔羊人工輔助哺乳，每隔4小時餵一次同期生產的「奶媽」的初乳，直到代孕母羊可以自然哺乳。
全文摘要
本發明公開了一種通過提高胚胎移植產羔率和成活率以提高克隆效率的方法，屬於胚胎移植的方法領域。本發明將移植激活後24-72小時胚齡的卵裂均勻的胚胎移植入同期發情母羊體內，每隻羊移植10-15枚胚胎，對術後連續4個情期不返情的母羊進行妊娠管理，對超過預產期5天和胎兒體形過大的代孕母羊實施剖腹產手術，接產後的羔羊嚴格控制保育環境溫度在21-23℃，飼餵健康母羊初乳。採用本發明提供的方法，能顯著提高克隆綿羊的妊娠率、產羔率及羔羊成活率，嚴格參照本發明操作後，克隆綿羊的妊娠率達30％，產羔率達31.67％，成活率達63％，本發明公開的一種提高綿羊克隆效率的方法，具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61D19/02GK102318581SQ20111025592
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者劉羿羿, 周歡敏, 張東 申請人:內蒙古農業大學