皮膚剝脫症候群新的致病基因及其編碼蛋白質和應用的製作方法

2023-09-23 21:42:40

皮膚剝脫症候群新的致病基因及其編碼蛋白質和應用的製作方法
【專利摘要】本發明鑑定了與皮膚剝脫症候群相關的新的隱性致病基因。具體地，發明人以皮膚剝脫症候群患病家係為研究對象，對該家系中的患病個體和非患病個體進行了外顯子組測序和比較，在CAST基因中發現一個移碼突變(c.607_608insAfs)，該突變造成CAST蛋白質翻譯提前中斷。在此基礎上，本發明提供了突變的CAST基因及其編碼蛋白質和應用，包含突變的CAST基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。利用該突變的CAST基因，可以對皮膚剝脫症候群進行分子診斷和患病風險評價。該突變基因及其編碼蛋白質還可作為治療皮膚剝脫症候群的藥物靶點。
【專利說明】皮膚剝脫症候群新的致病基因及其編碼蛋白質和應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種人體變異的基因，尤其涉及一種皮膚剝脫症候群新的致病基 因-CAST基因。本發明還涉及突變的CAST基因及其編碼蛋白質和應用，包含突變的CAST 基因的載體、宿主細胞以及試劑盒。

【背景技術】
[0002] 皮膚剝脫症候群（peeling skin syndrome, PSS)是一組罕見的遺傳性皮膚病，臨 床表現以持續性皮膚角質層或者表皮淺層剝脫、鱗屑、紅斑為主要特徵，類似"蛻皮"現象。 PSS分為肢端型和系統型兩種不同類型，其中肢端型僅累及手、足末端，表現為手、足反覆脫 屑及紅斑；系統型可累及全身皮膚，根據是否合併炎症性改變及過敏性症狀分為炎症型及 非炎症型。肢端型通常合併其他疾病，而系統型可以合併過敏性鼻炎、哮喘等其他疾病。患 者的"蛻皮"症狀可以隨季節發生變化，夏重冬輕。組織病理學表現為角化過度，以及角質層 與顆粒層，或者顆粒淺層出現裂隙。本病導致可患者皮膚出現明顯瘙癢、外觀嚴重受損，以 及合併各種過敏性疾病。既往研究認為，PSS為常染色體隱性遺傳，主要致病基因為TGM5、 ⑶SN、CSTA或者CHST8,這些基因在表皮終末分化過程中起到重要的作用。
[0003] 最近，外顯子組測序（exome sequencing)被成功地應用於發現稀有單基因疾病的 致病基因，如Freeman - Sheldon綜合症的MYH3基因，Schinzel-Giedion症候群的SETBPl 基因，以及嚴重大腦畸形的WDR62突變等。全外顯子測序技術已被證明為降低稀有單基因 疾病候選基因甚至發現其致病基因的有力、有效手段，僅通過對幾個很少的個體（包括患 者及正常對照）的全外顯子進行測序來篩選與疾病相關的變異，其成功率大為提升。


【發明內容】

[0004] 本發明的主要目的在於鑑別皮膚剝脫症候群（PSS)的新的致病基因，定位出該疾 病的基因突變位點。在此基礎上，提供PSS致病基因及其編碼蛋白質和應用，包含PSS致病 基因的載體、宿主細胞以及試劑盒，以對皮膚剝脫症候群進行分子診斷和患病風險評價，為 進一步治療該病提供設計藥物的靶點，同時為闡明該病的致病機制提供理論基礎。
[0005] 因此，一方面，本發明提供了突變的CAST基因，所述突變的CAST基因序列與SEQ ID NO: 1相比具有至少1個非沉默突變，且所述突變的CAST基因導致皮膚剝脫症候群的發 生；所述非沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
[0006] 在一個優選的實施方案中，所述非沉默突變為SEQ ID NO: 1的第607位和608位 之間插入A，其序列如SEQ ID N0:2所示。該突變屬於移碼插入突變，使得CAST基因編碼的 胺基酸序列第203位的異亮氨酸變成了天冬醯胺，第203位以後的胺基酸序列也發生改變， 直至第210位穀氨酸密碼子突變為終止密碼子，使得多肽鏈合成中斷。
[0007] 第二方面，本發明還提供了 SEQ ID N0:2序列編碼的蛋白質，該序列從203位發生 變化，到第210位出現終止，所述蛋白質只有209個胺基酸，其胺基酸序列如SEQ ID NO:3 所示。而野生型的CAST蛋白具有750個胺基酸，因此該突變型的CAST蛋白質的結構與功 能不同於野生型的CAST蛋白，無法在機體中起到正常的作用
[0008] 在本發明的第三方面，提供了含有上述突變CAST基因的載體。
[0009] 在本發明的第四方面，提供了被上述載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述突變 的CAST基因直接轉化或轉導的宿主細胞。
[0010] 在本發明的第五方面，提供了上述的突變的CAST基因在作為治療皮膚剝脫綜合 徵的藥物靶點或製備皮膚剝脫症候群疾病診斷試劑盒中的應用。
[0011] 在本發明的第六方面，提供了一種用於診斷皮膚剝脫症候群的試劑盒，所述試劑 盒包含能夠特異性擴增CAST基因的引物，或能夠特異性檢測CAST基因突變的探針。
[0012] 在一個優選的實施方案中，所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2所示的序列 中第607位或第608位前後15?30bp長的序列。
[0013] 在本發明的第七方面，提供了一種抗體，所述抗體與上述突變型的CAST蛋白質特 異性結合，且不作用於正常的CAST基因所編碼的蛋白質。
[0014] 在本發明的第八方面，提供了一種皮膚剝脫症候群治療劑，所述治療劑包含上述 所述的抗體。
[0015] 本發明通過外顯子組測序技術首次發現了 CAST基因突變可以導致皮膚剝脫綜合 徵的發病。一方面，通過檢測受試者是否攜帶有CAST基因致病突變，可以早期篩查皮膚剝 脫症候群突變基因攜帶者，提供優生優育指導；也可為皮膚剝脫症候群患者提供分子診斷 依據。特別地，本發明所提供的診斷試劑盒可用於快速、有效地預測或診斷皮膚剝脫綜合 徵。另一方面，CAST基因首次在人類疾病中被認識，為複雜的皮膚角質化生理過程提供全 新通路；第三方面，本發明可以為治療皮膚剝脫症候群提供可能的藥物靶點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是某六代常染色體皮膚剝脫症候群家系圖，其中正方形表示男性，圓圈表示 女性；帶斜線為死亡,實心為患病個體,空心為正常個體。
[0017] 圖2是PSS患者症狀圖。
[0018] 圖3是PSS患者CAST基因的突變位點序列圖。
[0019] 圖4為PSS患者和正常對照的CAST基因的mRNA表達qRT-PCR結果。
[0020] 圖5為透視電鏡法檢測鈣蛋白酶抑制蛋白結果。
[0021] 圖6為CAST基因在體內的表達和功能研究分析結果。

【具體實施方式】
[0022] 以下結合實施例對本發明進行更為詳細的描述，但是以下描述僅用於對本發明進 行解釋性說明，並不對本發明的保護範圍進行任何的限制，本發明的保護範圍以權利要求 書限定的範圍為準。
[0023] 在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術 人員所通常理解的含義。並且，本文中所用的分子遺傳學、核酸化學和分子生物學相關術語 和實驗室操作步驟均為相應領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本 發明，下面提供相關術語的定義和解釋。
[0024] 在本發明中，"CAST(calpastatin)基因"為蛋白酶抑制蛋白的革巴基因，它是f丐蛋白 酶水解系統成員之一。其編碼的蛋白質為鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST)是內源性專一抑制鈣 蛋白酶（CAPN)活性的蛋白質，可專一識別CAPN與鈣結合引起的構象變化，並能與之結合。 活性CAST含有5個結構域，第一個結構域即L結構域，其功能還不是很清楚。第2?5個 結構域是4個結構相似的重複單位。
[0025] 在本發明中，術語"外顯子"是指在成熟mRNA中被保留下的部分，即成熟mRNA對 應於基因中的部分。內含子是在mRNA加工過程中被剪切掉的部分，在成熟mRNA中不存在。 外顯子和內含子都是對於基因而言的，編碼的部分為外顯子，不編碼的為內含子，內含子沒 有遺傳效應。
[0026] 在本發明中，術語"外顯子捕獲"與"晶片雜交"可互換使用，指的是探針對文庫中 外顯子區域的DNA片段進行特異性選擇和結合的過程。DNA分子正常情況下是雙鏈，因此捕 獲之前，DNA分子必須變為單鏈，一般是通過加熱使其變性而達到解鏈目的，解鏈的DNA分 子被迅速冷卻，即保持單鏈狀態。文庫變性後在雜交平臺與晶片進行捕獲雜交。含有外顯 子區域的DNA片段與固定在晶片上的探針之間在嚴格的條件下進行分子雜交。較佳地，芯 片上探針分子的濃度要遠遠高於靶分子濃度。待雜交完畢後，通過變性等方法收集捕獲的 序列並純化，得到來自捕獲後的序列混合物。
[0027] 在本發明中，"高通量測序"是指採用三種第二代測序平臺進行高通量測序： 454FLX(Roche 公司）、Solexa Genome Analyzer(Illumina 公司）和 Applied Biosystems 公司的SOLID等。這些平臺共同的特點是極高的測序通量，相對於傳統測序的96道毛細管 測序，高通量測序一次實驗可以讀取40萬到400萬條序列，根據平臺的不同，讀取長度從 25bp到450bp不等，因此不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取IG到14G不等的鹼基數。
[0028] 在本發明中，術語"DNA文庫"是指對基因組的目的片段進行打斷，獲得一組具有一 定大小的DNA片段混合物。DNA文庫的製備方法為本領域技術人員所熟知。在一個優選例 中，還可以對打斷產物、末端修復產物、接頭產物和富集產物進行純化。對反應的條件進行 一定的變化或優化也在本領域技術人員能力範圍之內。
[0029] 在本發明中，術語"突變"是指野生型的CAST多核苷酸序列發生改變，成為變異 體，變異體可以是天然發生的或非天然發生的。變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入 變異體。在本發明中，某一種變異體可以通過多種方式實現，例如，要得到野生型基因編碼 不完全的變異體，可以通過在野生型基因序列中插入鹼基，使某個密碼子變為終止密碼子， 或者直接缺失部分序列的方式實現。在本發明中，術語"非沉默突變"是指除了沉默突變以 外的基因突變，包括但不限於錯義突變、無義突變和移碼突變等。
[0030] 本發明還涉及與所述的CAST核苷酸雜交且兩個序列之間具有至少80%，較佳地 至少90%，更佳地至少95%，至少99 %同源性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下 與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。
[0031] 本發明野生型或突變型CAST核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對於PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤 其是開放閱讀框序列來設計引物，並用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方 法所製備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組 法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從 增殖後的宿主細胞中分尚得到有關序列。
[0032] 本發明中，"載體"包括但不限於克隆載體和表達載體。在一個優選的實施方案中， 所述載體是例如質粒，粘粒，噬菌體，柯斯質粒等等。在一個優選的實施方案中，所述載體是 商購可得的。在一個優選的實施方案中，所述載體包含與上述突變的CAST基因可操作地連 接的表達控制序列，例如但不限於啟動子，增強子和終止子。在一個優選的實施方案中，所 述載體任選地還包含選擇標記。
[0033] 包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用於轉化適 當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。此類宿主細胞包括但不限於，原核細胞例如大腸杆 菌細胞，以及真核細胞例如酵母細胞，昆蟲細胞，植物細胞和動物細胞（如哺乳動物細胞， 例如小鼠細胞、人細胞等）。本發明的宿主細胞還可以是細胞系。
[0034] 本發明還涉及到CAST突變蛋白質，由於在SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列中第607 位和第608位的核苷酸之間插入了 A (圖3)，使得CAST基因編碼的胺基酸序列第203位的 異亮氨酸變成了天冬醯胺，第203位後的胺基酸序列也發生改變，並致使第210位的穀氨酸 密碼子突變為終止密碼子，本發明的CAST突變蛋白質具有SEQ ID NO:3所示的序列，與野 生型CAST胺基酸序列的不同之處為：只有209個胺基酸，缺失了後部分的541個胺基酸， 因此不具有CAST蛋白質正常的功能。本發明的CAST突變蛋白質可以是重組蛋白質、天然 蛋白質、合成蛋白質，優選重組蛋白質，即使用重組技術從原核或真核宿主（例如，細菌、酵 母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞）中產生。
[0035] 在本發明中，CAS T突變蛋白質還涉及具有與CAST突變蛋白質相同功能的、SEQ ID NO. 3序列的變異形式。變異形式包括：同源序列、保守性變異體、誘導突變體等。發明 還涉及CAST突變蛋白質類似物。這些類似物膚與CAST突變蛋白質的差別可以是胺基酸序 列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。
[0036] 本領域技術人員公知，致病基因具有多方面的用途。因此，本發明提供的突變CAST 基因的用途包括但不限於：用作治療皮膚剝脫症候群的藥物靶點；製備皮膚剝脫症候群的 診斷試劑盒中；用於產生疾病動物模型；為治療皮膚剝脫症候群提供新的藥物作用途徑。
[0037] 本發明所述的"試劑盒"是指本領域技術人員以CAST野生型或突變型核苷酸為基 因探針，根據基因雜交的原理，可以檢測生物樣本中是否存在與該探針序列互補的核苷酸 序列，因此使用這種試劑盒可以檢測出樣本中是否存在著本發明的基因突變位點。試劑盒 一般包括：引物、探針、核酸晶片、說明書等，還可能包括與活性成分相容的緩衝液、載體或 媒介等。
[0038] 在本發明中，"引物"指用於在PCR反應中擴增靶標核酸的多核苷酸片段，其通常為 寡核苷酸，例如含有至少 5 個鹼基，例如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、30、35、40、45、50個或者更多個鹼基的多核苷酸片段。引物不必與待擴增 的目的基因或其互補鏈完全互補，只要其能夠特異性擴增目的基因。如本文中所使用的，術 語"特異性擴增"是指引物能夠通過PCR反應擴增目的基因，而不擴增其他基因。例如，特 異性擴增CAST基因是指，在PCR反應中引物只擴增CAST基因，而不擴增其他基因，此類引 物的設計是本領域技術人員公知的。
[0039] 在本發明中，術語"特異性檢測CAST基因突變的探針"是指探針能夠區分出含有 突變的CAST基因基因與不含有突變的CAST基因。一般而言，可以通過控制雜交條件的嚴緊 性，使得探針能夠區分出含有突變的基因與不含有突變的基因。例如，在高度嚴緊條件下， 與CAST基因精確互補的探針可以與不含有突變的CAST基因基因雜交，而不與甚至只包含 一個點突變的突變的CAST基因雜交，從而將二者區分開。同樣，還可以設計與突變的CAST 基因基因精確互補的探針，從而其在高度嚴緊條件下與突變的CAST基因雜交，而不與不含 有突變的CAST基因雜交。在分子生物學領域中，探針的設計和雜交技術是熟知的。
[0040] 本發明涉及對突變的CAST蛋白質具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其 是單克隆抗體。這裡，"特異性"是指抗體能結合於突變的CAST蛋白質。較佳地，指那些能 與突變的CAST蛋白質產物或片段結合但不識別和結合於野生型的CAST蛋白質相關抗原分 子的抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體 片段，如Fab，或（Fab) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子或嵌合抗 體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行製備。
[0041] 本發明的突變的CAST蛋白質抗體可以用來鑑定突變的CAST蛋白質。例如，可以 用一種可檢測的分子例如螢光素異硫氰酸（FITC)來標記突變的CAST蛋白質特異抗體，然 後讓突變的CAST蛋白質特異抗體與樣品接觸，再用螢光顯微鏡或流式細胞儀檢測出與突 變的CAST蛋白質特異抗體結合的樣品，從而為預測或診斷患者是否存在特發性皮膚剝脫 症候群提供依據和指導。
[0042] 本發明的突變的CAST蛋白質抗體還可以用來中和突變的CAST蛋白質。如果有足 夠的數據表明某個體的PSS與本發明突變CAST蛋白質的存在相關，可以考慮用突變的CAST 蛋白質特異性抗體中和這些致病突變CAST蛋白質分子，從而緩解患者的病症。
[0043] 實施例1 :樣本獲取
[0044] 發明人發現並鑑定了一個常染色體隱形遺傳的皮膚剝脫症候群家系（如圖1所 示）。患者（圖1中黑色實心所示個體）來自近親婚育的家族中，父母表型正常，患者除了 典型PSS症狀以外，患者還合併出現淺表性水皰、白甲、掌蹠角化、乾燥性唇炎以及指節墊 損害，組織病理學表現為表皮角化過度，顆粒層及棘細胞層上部角質形成細胞松解（如圖2 所示）。患者未合併其他系統異常，神經系統及智力發育正常。
[0045] 發明人以這位患者及其父母作為研究樣本，並採集每位研究對象的外周血作為研 究樣品，加入EDTA抗凝，-80°C保存。所有血樣均籤屬知情同意書，並獲得倫理委員會批准。
[0046] 實施例2 :樣本DNA製備
[0047] 採集皮膚剝脫症候群患者及其父母的外周血，採用OMEGA Blood DNA Midi Kit全 血DNA提取試劑盒從外周血樣品中提取DNA，提取步驟如下：
[0048] (1)取 2ml 全血樣本，加入 150ul OB Protease，2. Iml Buffer BL 和 20ul RNase A,最大速度漩渦1分鐘,徹底混勻。
[0049] ⑵65攝氏度水浴15-20分鐘，並在水浴過程中漩渦5次。
[0050] (3)加入2. 2ml無水乙醇，最大速度漩潤30秒，徹底混勻。
[0051] (4)將3. 5ml裂解液移入帶過濾柱的15ml離心管，4000轉離心5分鐘，取出過濾 柱,倒掉過濾液體,放回過濾柱。
[0052] (5)將第3步剩餘裂解液加入帶過濾柱的15ml離心管，4000轉離心5分鐘，取出 過濾柱，倒掉過濾液體，放回過濾柱。
[0053] (6)加入3ml HB Buffer，洗滌過濾柱，4000轉離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾 液體，放回過濾柱。
[0054] (7)加入3ml DNA Wash Buffer，4000轉離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾液體， 放回過濾柱。
[0055] (8)再次加入3ml DNA Wash Buffer，4000轉離心5分鐘，取出過濾柱，倒掉過濾液 體，放回過濾柱。
[0056] (9)4000轉離心15分鐘，甩幹過濾柱。
[0057] (10)將過濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul 70攝氏度的Elution Buffer， 室溫靜置5分鐘，4000轉離心5分鐘，收集含有DNA的過濾液。
[0058] (11)再次將過濾柱移至新的15ml離心管，加入500ul 70攝氏度的Elution Buffer，室溫靜置5分鐘，4000轉離心5分鐘，收集含有DNA的過濾液。
[0059] (12)利用分光光度計測量DNA的濃度及純度，所得的每個標本基因組DNA的 0D260/0D280均位於1. 7?2. 0之間，濃度不少於200ng/ul，總量不少於30μ g。
[0060] 實施例3 :外顯子捕獲與測序
[0061] 發明人用NimbleGen SeqCap EZ Exome (64M)結合Solexa高通量測序技術對選取 的實施例1的患者的外顯子組序列進行了測序，具體如下：
[0062] 1)將基因組DNA隨機打斷成200-300bp左右的片段，隨後在片段兩端分別連接上 接頭製備雜交文庫（參見http://www. illumina.com/提供的Illumina/Solexa標準建庫 說明書）。
[0063] 2)文庫經純化後經過連接介導PCR(ligation-mediated PCR(LM-PCR))的線性擴 增與Biotinylated DNA Library進行雜交富集，再經過LM-PCR的線性擴增後進行上機測 序。測序平臺為Illumina Hiseq 2000,讀取長度為90bp，每個樣本的平均測序深度最少為 50X〇
[0064] 3)測序後獲得的原始數據由 Illumina basecalling Software 1. 7 進 行處理，經過過濾去汙染、使用SOAPaligner 2.20#比對參考基因組（可參考Li Rj Li Yj KristiansenKj et al，SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008,24(5):713-714 ；Li RjYu CjLi Yjet al,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25 (15):1966-1967， 通過參考的方式將其全文併入本文），以便獲得比對到基因組上的唯一比對序列。然後利 用 SOAP snp (可參見：Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing· Genome Res 2009, 19(6) : 1124-1132,通過參考的 方式將其全文併入本文）確定革E區域的基因型。Indel (insertion-deletion，插入/缺失 標記）米用BWA (通過Burrows-Wheeler變換比對）（version 0· 5. 9_r 16)比對到參考基因 組 Hgl9(snpl32)，然後利用 GATK (Genome Analysis Toolkit) (version vl. 0.4705)確定 indel 的類型。（可參見 Li HjDurbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics 2010 ;26(5) :589-595 ;McKenna，A，Hanna Mj Banks Ej et al. The genome analysis toolkit:a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Research 2010 ；20(9):1297-1303)〇
[0065] 結果，在樣本中分別發現患者有130437個單核苷酸多態性（SNPs)和10738處的 插入 / 缺失（indel);隨後通過 dbSNP 資料庫（http://www.ncbi.nlm. nih.gov/projects/ SNP/snp_summary. cgi)，千人基因組資料庫（www. IOOOgenomes. org/)、HapMap 資料庫 (http://hapmap. ncbi. nlm. nih. gov/)等公共資料庫的過濾，去掉所有已知的且在資料庫 中等位基因頻率大於0. 005的變異。通過比對正常樣本，去掉所有已知變異、同義突變以及 非編碼區的變異，影響蛋白功能較小的位點，包括intron、intergenic、UTR、同義突變，並利 用SIFT軟體進行SNP功能預測.
[0066] 然後根據遺傳模式是常染色體隱性且假設為全外顯率的情況，結合近親結婚純 合區域定位方法，發明人最終確定了該例患者的致病基因為C A S T基因，其突變位點為 c. 607_608insAfs，p. I203Nfs*8(如圖3所示），即在該基因的第607位和第608位之間插 入了一個鹼基A，該位點在家族中符合與疾病共分離（父母為雜合子）。在定位方法中，利 用外顯子數據檢測純合片段區域，選擇在dbsnpl35中記錄的SNPs或者reference (參考位 點）作為makers (標記），參考等位基因或者變異等位基因的reads支持率大於等於95% 的位點被考慮為純和markers,非參考等位基因 reads支持率在30?70%之間的位點考慮 為雜合markers,非參考等位基因 reads支持數在5%?30%或者70%?95%的位點被丟 棄。對於純合markers,要求位點的覆蓋度大於等於10X，對於雜合markers要求位點的覆 蓋度大於等於5X。以上。我們採用包含500個markers作為一個滑動窗口，每個滑動窗口 允許2個以內的雜合makers,允許makers間的最大間距為500Kb。合併所有合格的滑動 窗口，如果該區段大於等於IM的長度，則認為該區域為純合區域。通過real-time PCR方 法，發明人確定了患者的CAST基因的mRNA表達較正常患者明顯減少（如圖4所示）。通過 透視電鏡法，發明人確定了患者缺乏鈣蛋白酶抑制蛋白（如圖5所示）。因此，發明人預測 CAST是PSS的致病基因。
[0067] 實施例4 :致病突變基因 Sanger法驗證
[0068] 由於外顯子組測序存在一定程度的假陽性，因此我們進一步驗證，對實施例1中 的PSS患者及其正常父母、另一家族的PSS患者和200位無關正常個體的CAST基因進行檢 測，具體步驟如下：
[0069] I. DNA 提取
[0070] 根據實施例2中所述的方法分別採集實施例1中的患者及其父母、另一家族的PSS 患者和200位無關正常個體的外周血，提取基因組DNA。
[0071] 2.弓丨物設計及PCR反應
[0072] 引物設計參考人類基因組序列資料庫hgl9/build36. 3,具體見下。
[0073] 對步驟1所提取的樣本基因組DNA進行CAST基因突變位點（c. 607_608insAfs，p. I203Nfs*8)檢測，針對該位點設計引物，引物設計方案符合本領域引物設計的一般原則即 可，可採用Primer Premier或Oligo等常用引物設計軟體。
[0074] PCR反應體系：
[0075]

【權利要求】
1. 一種突變的CAST基因，其特徵在於：所述突變的CAST基因序列與SEQ ID NO: 1相 比具有至少1個非沉默突變，且所述突變的CAST基因導致皮膚剝脫症候群的發生；所述非 沉默突變選自插入、缺失和置換中的一種或多種。
2. 如權利要求1所述的突變的CAST基因，其特徵在於：所述非沉默突變為SEQ ID NO: 1 的第607位和608位之間插入一個鹼基A，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
3. -種如權利要求2所述的突變的CAST基因編碼的蛋白質，其特徵在於：所述蛋白質 的胺基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4. 一種載體，其特徵在於：所述載體含有如權利要求1或2所述的突變的CAST基因。
5. -種遺傳工程化的宿主細胞，其特徵在於：所述宿主細胞為權利要求4所述的載體 轉化或轉導的宿主細胞。
6. 如權利要求1或2所述的突變的CAST基因在作為治療皮膚剝脫症候群的藥物靶點 或製備皮膚剝脫症候群疾病診斷試劑盒中的應用。
7. -種用於診斷皮膚剝脫症候群的試劑盒，其特徵在於：所述試劑盒包含能夠特異性 擴增CAST基因的引物，或能夠特異性檢測CAST基因突變的探針。
8. 如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於：所述引物或探針序列為SEQ ID NO: 1或2 所示的序列中第607位或第608位前後15?30bp長的序列。
9. 一種抗體，其特徵在於：所述抗體與權利要求3所述的蛋白質特異性結合，且不作用 於正常的CAST基因所編碼的蛋白質。
10. -種皮膚剝脫症候群治療劑，所述治療劑包含權利要求9所述的抗體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293813SQ201410510241
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優先權日:2014年9月28日
【發明者】戴蘭蘭, 張建國, 諶於藍, 楊勇, 林志淼, 趙嘉惠, 汪慧君, 徐訊 申請人:深圳華大基因科技有限公司