一種止血劑及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-24 03:03:55 2

專利名稱：一種止血劑及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種止血材料相關技術領域，具體涉及一種止血劑及其製備方法和應用。
背景技術：
現有技術中明膠已經被廣泛用於止血，如強生醫療器材有限公司的Surgiflo 流體明膠，殼聚糖明膠(中國專利申請號200310121182. X)，改性明膠(中國專利申請號=200910244834. 6)以及其它用於止血的明膠，如中國專利02121201. 5,98117763. 8，03126852. 8,02104346. 9，01142070. 7 等；美國專利 6，652，840，，413，713，6，238，688，6，194，138 5，645，849,4, 596，788,4, 539，204等。明膠具有止血效果，可以用於外傷或者手 術止血。微生物穀氨醯胺轉胺酶(microbial transglutaminase,縮寫MTG)與凝血因子FACTOR XIII屬於同一個家族的酶，很多研究表明了其在凝血反應中的作用。利用MTG可以交聯明膠，形成良好的多空物或者網狀物，例如，它可以交聯I型膠原蛋白形成抗高溫的膠(Nomura Y, Toki S，Ishii Y, Shirai K. Biosci Biotechnol Biochem.2001 Apr;65(4) :982-5) ;MTG與明膠作用形成的膠不會受熱溶解(Chen T, Embree HD,Brown EM, Taylor MM, Payne GF. , Biomaterials. 2003 Aug; 24 (17) : 2831-41,美國專利5, 834，232)並可用於細胞固定(Chen T, Small DA, McDermott MK, Bentley WE,Payne GF. , Biomacromolecules. 2003 Nov-Dec; 4 (6) : 1558-63),生物支架(BroderickEP, 0』Halloran DM, Rochev YA, Griffin M, Collighan RJ, Pandit AS. J BiomedMater Res B Appl Biomater. 2005 Jan 15;72 (I):37-42. ；Chen RN, Ho HO, Sheu MT.Biomaterials. 2005 Jul; 26 (20) : 4229-35)。用MTG增強明膠的交聯，以提高其強度和黏性，用於製作止血材料、止血敷料或止血用密封材料(McDermott MK, Chen T, WilliamsCM, Markley KM, Payne GF. Biomacromolecules. 2004 Jul-Aug; 5 (4) : 1270-9 ;中國專利:200980131973. 6 和 200780051215. 4 ;美國專利8, 133，484 ;歐洲專利TO2012017415、W02011132153、BRPI0718328、ZA200904470、EP2303344、EP2303341 及 CN102124058)。現有技術所採用的MTG是指將穀氨醯胺酶原(PiO-MTG)切除前肽後所獲得的成熟的酶。在通常保存條件下MTG較易失活而不穩定，對溫度比較敏感，不穩定，且必須在較高純度條件下才能發揮交聯作用。MTG是成熟的酶，是穀氨醯胺酶原(pro-MTG)被切除前肽後所獲得的(RalfPASTERNACK, Simone D0RSCH, Jens T. 0TTERBACH, Isabella R. R0BENEK, Sabine WOLFand Hans-Lothar FUCHSBAUER, Eur. J. Biochem. 257，5702576 (1998))。在生物體內發生，能將酶原切割出活性MTG分子的蛋白酶有Streptomyces albogriseolus來源的SAM-P20、SAM-P26、SAMP45 和 SAP 以及 Sti^ptomyces mobaraensis 來源的內源性 TG 激活酶 TAP 和 Streptomyces hygroscopicus 中的絲氨酸蛋白酶等(Taguchi S，Arakawa K,Yokoyama K, et al. J Biosci Bioeng, 2002，94 (5) : 478-81. Zhang D, Wang M, Wu J,et al. J Agric Food Chem, 2008，56 (21) : 10261-4.)。但上述反應不能被用於成熟 MTG的工業應用。由於纖維蛋白和膠原蛋白的完整性是實現人體正常凝血功能的必要因素之一，而激活劑，如分散酶(dispase)，不僅會切割微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原，還會切割纖維蛋白和膠原蛋白(Stenn KS, Link R, Moellmann G, et al. J InvestDermatol, 1989，93(2) :287-90.)，因此，在止血類產品中通常不使用分散酶等激活劑，以防其對上述酶原及蛋白的切割作用。此外，熱處理的微生物穀氨醯胺轉胺酶原(pro-MTG)可以有效抑制MTG的活性(Christa Pfleiderer, Martina Mainusch, Johannes Weber,Microbiological Research160 (2005) 265— 271)，因此，如果反應過程中是需要利用成熟MTG活性的，通常要求先嚴格去除pro-MTG，以避免pro-MTG對MTG活性的抑制。

發明內容
本發明克服現有技術以上缺陷，提供了一種止血劑，可用於各類傷口止血、手術止血，創新提出了將激活劑用於止血劑的技術方案，不僅避免了激活劑分解所述酶原及蛋白的副作用，還顯著增強了止血效果。本發明提出了一種止血劑，包括明膠、微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原、以及所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的激活劑。其中，所述明膠、所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和所述激活劑的比例為100000:Γ200: Γ ΟΟο其中，所述明膠的強度不低於300布魯姆。其中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的純度不低於80%。優選地，其純度不低於99%。其中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原在被完全激活時的最小比酶活不低於20U/
mg ο其中，所述激活劑是分散酶(dispase)。本發明中，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原是微生物來源的，分子量大約為42kDa，包含376個胺基酸殘基，其序列為GenBank CAA77128. I。優選地是由茂源鏈黴菌(Streptomyces mobaraensis)發酵產生的。本發明中，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原沒有酶活性的，其所含有的前肽未被切割，不能催化蛋白質交聯。在常溫條件下，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原比MTG更加穩定，不容易受熱變性或被酶解。本發明不需要分離去除微生物穀氨醯胺轉胺酶原(pro-MTG)，仍可利用成熟MTG的活性，實現顯著良好的止血效果，其止血機制明顯不同於現有技術。本發明中，激活劑是指可以激活酶原產生成熟MTG或者使酶原具有催化蛋白質發生穀氨醯胺轉胺基反應從而導致蛋白質交聯的任何蛋白酶。本發明中，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的激活劑是一類蛋白水解酶，可以水解纖維連接蛋白、IV膠原蛋白等，特異性較好，對某些膠原蛋白的水解能力較差；在一定條件下可以催化微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原(pro-MTG)分解釋放出成熟的具有催化活性的MTG。本發明中，激活劑可以是各種能活化pro-MTG的各種蛋白酶，如TAP、SAP、胰蛋白酶、蛋白酶K、分散酶、SAM-P20、SAM-P26、SAMP45、絲氨酸蛋白酶等，這類蛋白酶在一定濃度時不會水解明膠或僅有輕微水解明膠。這類蛋白酶對人體沒有明顯的免疫刺激。本發明首次創造性地提出利用不具有酶活性的微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原，並在其中加入適量激活酶，例如，在酶原中加入O. 25-1倍酶原質量的激活酶，無需分離純化即可進一步催化明膠形成交聯從而實現止血目的。在本發明的條件下，pro-MTG不僅可以在被激活後進一步催化明膠蛋白交聯，而且不會抑制MTG活性。本發明內容至目前為止尚未見有任何文獻報導。本發明較現有技術具有更好穩定性和止血效果，有利於保存和維持活性，增加安全性和可靠性。本發明還提出了一種止血劑的製備方法，包括步驟將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原及所述激活劑溶解於生理鹽水中，形成混合液；然後，將所述明膠粉末加入前述混合液中，混合後得到所述止血劑；其中，所述生理鹽水的體積(ml)為所述明膠粉末重量(g)的1-4倍。本發明將微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和激活劑與明膠分別包裝，例如，置於不同的無菌針管中，在使用時將其混合溶於水後立刻使用。
本發明還提出了一種止血劑的應用，用於傷口止血、手術止血。本發明止血劑的各組成成分可以被人體部分或者完全被吸收，且幾乎不會引起炎症反應，可廣泛應用於各類傷口止血或手術止血。本發明止血劑可以注射、塗抹或其他方式使用。本發明止血劑具有良好的止血效果，其止血效果顯著優於單一成分的明膠以及明膠與穀氨醯胺轉胺酶的組合物。


圖I表明在不同發酵時間微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的表達量。圖2表明微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的純化電泳圖。圖3表明微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和微生物穀氨醯胺轉胺酶在不同溫度下作用I個小時後的相對酶活。圖4表明微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原經不同用量的分散酶處理30分鐘後的酶活。圖5表明本發明止血劑(明膠、微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和分散酶混合物)比相同用量的明膠和微生物穀氨醯胺轉胺酶的凝血效果比較。圖6表明不同純度的微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原在被分散酶切割不同時間後的比酶活(U/mg)。
具體實施例方式以下結合具體實施例和附圖進一步闡述本發明。以下實施本發明的過程及方法，包括統計或計算方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。實施例I微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的發酵
本實施例中穀氨醯胺轉胺酶酶原的生產菌株為茂源鏈黴菌(Streptomycesmobaraensis)ο本發明中，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原還可以來源於枯草桿菌、鏈黴菌、穀氨酸棒桿菌等發酵產生。
斜面培養基(g/L):澱粉20，KN03 1，MgS04*7H20 O. 5, Κ2ΗΡ04·3Η20 O. 5, NaClO. 5, FeS04*7H20 0.01，瓊脂20。發酵培養基(g/L):甘油20，酵母膏6，蛋白腖25，MgS04*7H20 2，Κ2ΗΡ04·3Η20 2 10。首先將菌落接種到斜面培養 基上，培養7天。收集所有微生物，接種到發酵培養基中，分別在8，12，16，20，24小時處取樣，用電泳方法測定pro-MTG的表達量。對產酶菌株發酵8,12,16, 20, 24小時後電泳,用灰度掃描方法進行測定相對含量，再根據上樣蛋白總量計算產酶的量，以時間為變量作圖，得到各不同取樣點穀氨醯胺轉胺酶酶原的表達量情況，實驗結果如圖I所示，在發酵16小時時，微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的表達已經達到了最高值。實施例2微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的分離純化
將上述實施例I中發酵20小時的發酵液離心去除菌體。收集上清，加入2倍體積的無水乙醇，攪拌30分鐘。離心收集沉澱。利用離子交換柱進行蛋白分離純化。填料為DEAE-825，平衡液為O. 05M的tris緩衝液，pH7. 4。流動相為ρΗ6· O的O. lmol/L磷酸二氫鈉緩衝液。收集各個組分，電泳檢測，得到純度較好的pro-MTG蛋白。將該組分脫鹽後凍幹保藏。如圖2電泳結果顯示，在離子交換後收集目標組分，電泳檢測目標蛋白純化後的純度在99%以上。將上述實驗條件下獲得的蛋白質用高效液相-質譜分析，檢測結果表明，pro-MTG的純度大於80%，最高純度可以達99%。實施例3微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原與穀氨醯胺轉胺酶的穩定性比較
將pro-MTG和MTG分別在不同溫度下放置處理I個小時，其中，酶原pro-MTG用分散酶處理，MTG直接加緩衝液處理。然後調節到37°C，分別加入等體積含50% (w/w) lipase或不含lipase的無菌水，30分鐘後，測定MTG的酶活，分別比較不同處理點與最初酶活，計算相對的殘餘酶活。與未處理前的酶活進行比較，I. O代表酶活100%，即沒有酶活損失。實驗結果如圖3所示，在70攝氏度下作用I小時後pro-MTG的酶活僅有輕微下降，而MTG的酶活已經減少了 50%。在90攝氏度下作用I小時後pro-MTG仍然保留了約75%的酶活，而此時MTG的酶活只剩20%左右。可見，與MTG相比較，在37度以上高溫條件下，本發明在激活劑作用下的pro-MTG體現出顯著良好的熱學穩定性。實施例4微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的激活
在含有0. lmg/mLpro-MTG的100 μ I微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原溶液中加入10 μ I含有5 μ g、2. 5 μ g、I μ g和O μ g分散酶溶液，37°C下作用30分鐘，然後測定反應後酶混合液的MTG活性。如圖4所示，在未加入分散酶溶液時，pro-MTG沒有表現出酶活性。但在加入I μ g分散酶溶液後，pro-MTG立即被激活且表現出很高活性。實驗結果還表明，本發明中即使有少量pro-MTG酶殘餘也不會完全抑制MTG活性。而現有技術中由於pro-MTG的存在會抑制MTG活性，因此現有技術對MTG純度要求嚴格。實施例5微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原與激活劑混合物用量對明膠的交聯 製備明膠溶液將含有20%低熔點明膠的溶液加熱至60°C並磁力攪拌器攪拌，然後將
溶液冷卻至37°C保溫過夜備用。製備微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原與激活劑的混合物將穀氨醯胺轉胺酶酶原按照5mg/mL濃度溶解於水中,往該溶液中加入分散酶至濃度為lmg/mL形成混合物。然後，按照下述用量將該混合物加入至明膠溶液中在50mL明膠溶液中分別加入lmL，0. 5mL,0. ImL,O. OlmL上述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原與激活劑的混合物，對得到的終溶液測定粘度。粘度測定在每次粘度計測試中，將上述加入混合物的明膠溶液置於燒杯中，追蹤混合的明膠-微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原-激活劑溶液經歷膠凝時的粘度。通過記錄每個測試組達到最大粘度的30%和90%所需時間來比較不同的測試組。最大粘度是指能夠在比速下且具有用於那個測試的特定轉子的粘度計記錄。本實驗採用具有T-E 「t-bar」轉子的DV II +PRO數字粘度計(Brolkf ield公司)，轉子最大可記錄粘度是IOX 106cP，因此，最大粘度的30%和90%點分別為3 X IO6CP和9 X 106cP,是指凝膠溶液粘度到達3 X IO6CP和9 X IO6cP所需的時間。整個反應過程測試溶液都浸沒在37攝氏度水浴中。大於10分鐘的點則不再測量(_表示)。表I可見，加入酶原-激活劑混合物過高時凝膠所需要的時間反而較長，可能是由於分散酶對明膠的水解對明膠凝聚產生幹擾。如表I所示，本實施例表明最佳濃度為每g 明膠中添加穀氨醯胺轉胺酶酶原O. 25mg、0. 05mg分散酶。表明本發明適當量的分散酶不僅不會影響明膠的交聯，而且促進明膠交聯並增強止血效果，見實施例6。本發明突破了現有技術所認為的因分散酶能切割明膠因此不能將其與明膠聯合用於製備大分子交聯明膠的局限。表I不同酶原-激活劑混合物添加量對凝膠時間的影響_
11別I酶原-激活劑混合物添加量 |30%點時間|90%點時間
ImL^ 204 秒599 秒
2O. 5mL—140 秒231 秒
3O. ImL—311 秒579 秒
40.05mL-512 秒-
5O. OlmL--
實施例6止血劑的使用
本實驗中，明膠可以是市售的醫用明膠或者是其他可以被允許的明膠。例如中國專利CN200780051215.4中製備的明膠。明膠可提取來源於魚類、哺乳動物等。選用的明膠強度不低於300布魯姆。明膠強度過低可能導致血壓過高時破壞止血劑的止血效果。將明膠凍幹置於IOmL無菌醫用注射器中，每管裝lg。將按實施例2製備獲得的微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原凍幹，與分散酶乾粉按照4 I比例混合，置於另一支IOmL無菌醫用注射器中，每管裝O. 25mg混合物。該穀氨醯胺轉胺酶酶原凍乾粉與分散酶乾粉的比例也可以是400: I。微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原純度為80%，優選地，還可以是99%。使用時，先用裝有O. 25mg穀氨醯胺轉胺酶酶原與分散酶混合物的注射器吸5mL生理鹽水，然後用連接管與另一支裝有Ig明膠的注射器連接。來回推動注射器5或15次使其充分混勻。取下空注射器和連接管，接上注射導管，將充分混勻後的止血劑直接塗抹於流血傷口處，用紗布按壓2-5分鐘。使用時，各組分明膠、穀氨醯胺轉胺酶酶原和分散酶均需要用生理鹽水混勻。優選地，生理鹽水體積(mL)為明膠重量(g)的2倍；還可以是生理鹽水體積(mL)為明膠重量(g) 4倍或10倍。一般地，當組分明膠、穀氨醯胺轉胺酶酶原和分散酶之間的比例關係放大時，所用生理鹽水也按同樣比例放大。將混合製備得到的本發明止血劑(含有明膠、穀氨醯胺轉胺酶酶原和分散酶，其比例為16 4 :1)均勻塗於出血部位，作為樣品組。以同樣方法製備不加穀氨醯胺轉胺酶酶原和分散酶的明膠溶液，作為對照組。取兩組大鼠，分別為樣品組和對照組，每組各3個大鼠。經麻醉後綁定，分別在左腿動脈處用手術刀割一個深度一致，約Icm長的傷口。待流血5分鐘後，用醫用棉花擦淨血塊。將樣品組大鼠傷口處均勻注射ImL本發明止血劑並用紗布按壓2分鐘；將對照組大鼠傷口處均勻注射未加酶原及分散酶的明膠溶液並用紗布按壓2分鐘。經2個小時後對比觀察，樣品組各大鼠的傷口已經止住血並開始結痂；而對照組各大鼠傷口均仍有滲血。實驗結果表明本發明止血劑具有良好止血效果。實施例7止血劑的安全性評價
用皮下多點注射辦法，將本發明止血劑(含有25%明膠、10%酶原、10%激活劑)0. 5mL注 射到6個6周齡的Balb/c小鼠背部皮下，為樣品組。將等量O. 5mL明膠溶液注射到小鼠，作為對照組。24小時後處死小鼠，取血，用流式細胞儀測定淋巴細胞的數量。T檢驗顯示兩組小鼠沒有顯著性差異，實驗結果如表2，表明與對照組相比較，本發明止血劑不會引起小鼠的免疫反應。表2小鼠血液中淋巴細胞的比率
權利要求
1.一種止血劑，其特徵在於，包括明膠、微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原、以及所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的激活劑。
2.如權利要求I所述的止血劑，其特徵在於，所述明膠、所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和所述激活劑的比例為100000: I 200: I 100。
3.如權利要求I所述的止血劑，其特徵在於，所述明膠的強度不低於300布魯姆。
4.如權利要求I所述的止血劑，其特徵在於，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的純度不低於80%。
5.如權利要求I所述的止血劑，其特徵在於，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原在被完全激活時的最小比酶活不低於20U/mg。
6.如權利要求I所述的止血劑，其特徵在於，所述激活劑是分散酶。
7.如權利要求I所述止血劑的製備方法，其特徵在於，將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原及所述激活劑溶解於生理鹽水中，形成混合液；然後，將所述明膠粉末加入前述混合液中，混合後得到所述止血劑；其中，所述生理鹽水的體積為所述明膠重量的1-4倍。
8.如權利要求I所述止血劑的應用，其特徵在於，其用於傷口止血。
全文摘要
本發明公開了一種止血劑，包括明膠、微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原以及所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原的激活劑；所述明膠、微生物穀氨醯胺轉胺酶酶原和激活劑的比例為100000:1~200:1~100。本發明還公開了該止血劑的製備方法及應用。本發明止血劑具有更好穩定性和止血效果，其安全性和可靠性增強。
文檔編號A61L15/44GK102727929SQ201210192240
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月12日 優先權日2012年6月12日
發明者劉明耀, 易正芳, 金明飛, 高紅亮 申請人:華東師範大學