高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法及化合物的製作方法
2023-09-24 12:50:40 1
專利名稱：高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法及化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種利用「點擊化學」構建三氮唑化合物並高通量篩選單胺氧化酶抑 製劑的方法，以及篩選到的三氮唑類化合物。
背景技術：
點擊化學(Click chemistry)，又譯為「連結化學」、「動態組合化學」(Dynamic Combinatorial Chemistry)、「速配接合組合式化學」，是由化學家巴裡·夏普萊斯在2001 年引入的一個合成概念，主旨是通過小單元的拼接，來快速可靠地完成形形色色分子的化 學合成。它尤其強調開闢以碳-雜原子鍵(C-X-C)合成為基礎的組合化學新方法，並藉助 這些反應(點擊反應)來簡單高效地獲得分子多樣性。點擊化學的概念對化學合成領域有 很大的貢獻，在藥物開發和分子生物學的諸多領域中，它已經成為目前最為有用和吸引人 的合成理念之一。
發明內容
本發明目的是提供一種利用「點擊化學」構建三氮唑化合物並高通量篩選單胺氧 化酶抑制劑的方法，以及篩選到的新的具有單胺氧化酶抑制活性的三氮唑類化合物。本發明採用的技術方案是一種高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法，所述方法包括(1)利用「點擊化學」方法，構建三氮唑類化合物庫，所述三氮唑類化合物構建方法 如下以等摩爾量的式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應底 物，在CU+/CU2+存在下，於叔丁醇的水溶液中，38 32°C搖床反應24h以上，反應結束後，進 行質譜分析，如果炔和疊氮類化合物的峰消失，出現新的符合相應的三氮唑的峰，則認為反 應完全，生成了式(I)所示三氮唑類化合物，進行下一步操作； 式⑴ (III)中:R和R1為取代或未被取代的苯環類、雜環類或鏈烴類取代基；上述取代基R和R1 並不是本發明要求保護的內容，本發明只是提供一個利用點擊化學構建三氮唑類化合物並 以此篩選單胺氧化酶抑制劑的途徑，具體選擇何種取代基，本領域普通技術人員可在篩選 過程根據實際情況進行取捨篩選。目前有多種方法檢測單胺氧化酶的活性分光光度法、放射性法、高效液相法以及 螢光探針法等。分光光度法、放射性法、高效液相法等都不適合高通量的篩選而螢光探針 具有很高的靈敏度和專一性，並且樣品不需要複雜的提純，因此螢光探針法被廣泛應用於 生物醫學和生物學。
本發明點擊化學法構建三氮唑類化合物的方法有以下幾個優點①在室溫條件下 就可反應，反應條件溫和；②反應溶劑為叔丁醇和水不影響單胺氧化酶的酶活；③反應完 全，沒有副產物，同時硫酸銅和抗壞血酸對單胺氧化酶的酶活幾乎沒有影響。有了這些優點 再結合螢光探針的特點就可以不經提純直接檢測酶活，粗篩出活性結構。(2)採用螢光探針法檢測三氮唑類化合物的單胺氧化酶活性取步驟(1)含三氮 唑類化合物的反應液，以水稀釋至濃度為50 100 μ Μ,吸取稀釋液加入96孔板的反應孔 中，再加入ΡΗ8. 4硼酸緩衝液和BSA，加入適量MAO-A或ΜΑ0-Β，混合物在38°C反應3h，然後 加入螢光探針，再在38°C反應2h，用全功能螢光分光光度計Uex/Xem = 365/460nm)進行 檢測；根據螢光值的高低判斷三氮唑類化合物對單胺氧化酶抑制活性的高低螢光強度越 強，則抑制活性越弱；反之其抑制活性就越強。所述螢光探針為下列之一 (1)4-甲基-7-(3_氨基丙基)_香豆素、(2)苯丙胺、 (3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氫吡啶-4-氧基)_香豆素。上述螢光探針反應機理以4-甲基-7-(3-氨基丙基)_香豆素為例該化合物其本 身並無螢光，但經與單胺氧化酶作用，3-氨基丙基轉化為醛，接著發生消除反應後，生成了 具有強烈螢光性能的4-甲基-7-羥基香豆素。因此通過檢測螢光的變化就可檢測MAO的 活性。優選的，所述步驟(1)中叔丁醇與水體積用量之比為1 1。所述鏈烴類取代基包括甲基、甲氧基、乙氧基、羥基、滷素、吡啶基、苯甲氧基、硼酸 基、二甲氨基、羥乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、嘧啶基，醚、乙醯基、乙醯氧 基等。這些鏈烴長度為2 5個碳，可以是直鏈也可以含有支鏈，支鏈數目為1 5個。所述苯環或鏈烴上的取代基包括(1)烷烴類取代基包括甲基、乙基；(2)烯烴類 取代基包括苯乙烯基，其中苯乙烯基的苯環上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、 滷素、羧基、硝基、乙醯氧基等基團，這些基團位於取代基的苯環的2 5號位，數目為0 5 個，取代基可以是相同的也可以是不同的；(3)滷素類取代基包括氟、氯、溴、碘；醚類取代 基包括甲氧基、乙氧基、苯甲氧基，其中苯甲氧基的苯環上可以含有甲基、乙基、甲氧基、乙 氧基、羥基、滷素、羧基、硝基、乙醯氧基等基團，這些基團位於取代基的苯環的2 5號位， 數目為0 5個，取代基可以是相同的也可以是不同的；(4)芳烴類取代基包括苯基、帶有 取代基的苯基，其中苯基的取代基可以是甲基、甲氧基、乙氧基、羥基、滷素、吡啶基、苯甲氧 基、硼酸基、帶有取代基的苯基、二甲氨基、羥乙基甲氨基、硝基、羧基、苯乙烯基、二苯氨基、 嘧啶基，醚、乙醯基、乙醯氧基等。這些取代基團位於苯環的2 5號位，取代基的數目0 5個，這些取代基可以是相同的也可以是不同的；(5)有機含氮類取代基包括硝基、二甲氨 基、二苯氨基、羥乙基甲氨基；(6)雜環類取代基包括吡啶、嘧啶等。所述雜環類取代基包括呋喃、吡唑、蒽環、吲哚、喹啉、苯並吡喃-4-酮等。雜環上 的取代基包括甲基、甲氧基、羥基、硝基、滷素、羧基等。取代基的數目0 5個，可以是相 同的也可以是不同的。優選的，所述步驟(1)中所述三氮唑類化合物構建方法如下將所述炔類和疊氮 類化合物分別溶解在叔丁醇中，製成濃度IOmM的溶液1和溶液2 (也可將炔類和疊氮類化 合物同時溶解在叔丁醇中)；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在水中，製成硫酸銅濃度0. ImM的 溶液3、抗壞血酸濃度ImM的溶液4，取等體積的溶液1、2、3和4混合，38 32°C搖床反應24h以上，反應結束後，進行質譜分析。本發明還涉及一種上述方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結構如式(I-I)所示 本發明還涉及一類按上述方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結構如下式所示 優選的，所述三氮唑類化合物為下列之-本發明的有益效果主要體現在(1)所構建的篩選單胺氧化酶抑制劑的方法，方 法新穎，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，並且所得到的單胺氧化酶抑制劑性 質很穩定，純度也很高(99%以上)；(2)與以前所研究的單胺氧化酶抑制劑的方法相比，快 速高效，節約成本和時間，所篩得的新型三氮唑類單胺氧化酶抑制劑，結構簡單，其抑制活 性、對MAO-A和MAO-B選擇性都有很大的提高，具有高通量篩選的特點。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於
此 實施例1 方法
(1)將所述炔類(III)和疊氮類化合物(II)分別溶解在叔丁醇中，製成炔類化 合物濃度IOmM的溶液1、疊氮類化合物濃度IOmM的溶液2 ；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在 水中，製成硫酸銅濃度0. ImM的溶液3、抗壞血酸濃度ImM的溶液4。Iml的小瓶中分別加 入上述溶液 1(10 μ 1，lequiv)、溶液 2(10 μ 1，lequiv)、溶液 3(10 μ 1，1% equiv)和溶液 4(10μ 1，10% equiv)混勻。將上述小瓶放在30°C的搖床中反應24h。時間結束後，用質 譜分析，如果炔和疊氮化合物的峰消失，出現新物質的峰符合相應的三氮唑，則認為反應完 全，產生了所述三氮唑類化合物(I)；(2)將步驟(1)構建的三氮唑的反應用水衝淡到濃度為100 μ M，吸取4 μ 1加入96 孔板，然後加入 MA0-A(20mg/ml)或 MAO-B (20mg/ml) 4 μ 1，硼酸緩衝液(ρΗ = 8. 4)400 μ 1， 4μ 1 BSA(20mg/ml)，混合物在38°C反應3h，然後加入探針4-甲基_7_ (3-氨基丙基)-香 豆素2μ l(10mmOl/ml)，三氮唑最終濃度在1(Γ2πιπι01/1以下，混合物再在38°C反應2h，用全 功能螢光分光光度計(λ ex/ λ em = 365/460nm)進行檢測。按照上述方法，得到的部分活性較好的三氮唑類化合物的結構及其對MAO-A和 MAO-B的抑制活性見表1 表 1 實施例2 :1-(4_吡啶)_基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(I-I)的製備合成路線如下 50ml圓底燒瓶中加入4_疊氮吡啶(0. 8ml)，丙炔胺(0. 47ml)和t_Bu0H/H20(共 2ml，1 1，ν/ν)，溶解完全後，加入硫酸銅(0.017g，l%mol)，再加入抗壞血酸(0. 12g,10% mol)，室溫攪拌24h，3*20ml 二氯甲烷萃取，NaHCO3飽和溶液洗，無水硫酸鎂乾燥，過濾，抽乾，柱層析純化，得到黃色固體，產率91%。化合物表徵=1H-NMR(D2O) δ 8. 55-8. 54 (m, 2H, CH)，7. 71-7. 70 (m, 2H, CH)，8. 35 (s, 1H, -CH = C),3. 85 (s,2H, CH2). ESI-MSm/z 176. 1(M+1)+.實施例3 :1-苯基-4-甲胺基-IH-[1，2，3]三氮唑(1-2)的製備合成路線如下 具體操作過程參考實施例2。化合物表徵=1H-NMR(D2O) δ 8. 02 (s, 1H，-CH = C)， 7. 44-7. 43 (m, 2H, CH)，7. 37-7. 31 (m, 3H, CH)，3. 75 (s, 2H, CH2) · ESI-MSm/z 175. 1 (M+1) +·實施例4 :4-(4-甲胺基_[1，2，3]-三氮唑)基苯甲酸(1-3)的製備合成路線如下 50ml圓底燒瓶中加入4-羧基苯基疊氮(0. 3g)，丙炔胺(0.13ml)和t_BuOH/ H2O(共6ml，1 1，ν/ν)，溶解完全後，加入硫酸銅溶液(0. Iml,0. 045Μ，0· 1% mol)和抗壞 血酸(0. 2ml, 0. 32M，10% mol)，室溫攪拌0. 5白色固體析出，繼續反應24h，蒸去叔丁醇，加 入水15ml衝淡，鹽酸酸化，過濾，正己烷洗，乾燥，得到白色固體，產率91 %。化合物表徵 1H-NMR(DMSO) δ 8. 95 (s, 1H, -CH = C),8. 18-8. 16(d，2H，J = IOHz，CH)，8. 06-8. 04(d，2H， J= IOHz，CH)，4. 25 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1 (M+1)+·實施例5 :3-(4-甲胺基-[1，2，3]_三氮唑)基苯甲酸(1-4)的製備合成路線如下 具體過程參考實施例4。化合物表徵=1H-NMR(DMSO) δ 8. 87 (s，1H，-CH = C)， 8.33(s，lH，CH)，8· 02-8. 02(d，2H，J = 10Hz, CH)，7· 69 (s，1H，CH)，4· 21 (s，2H，CH2). ESI-MSm/z 219. 1(M+1)+。
權利要求
一種高通量篩選三氮唑類單胺氧化酶抑制劑的方法，所述方法包括(1)利用「點擊化學」方法，構建三氮唑類化合物庫，所述三氮唑類化合物構建方法如下以等量的式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應底物，在Cu+/Cu2+存在下，於叔丁醇的水溶液中，38～32℃搖床反應24h以上，反應結束後，進行質譜分析，如果炔和疊氮類化合物的峰消失，出現新的符合相應的三氮唑的峰，則認為反應完全，生成了式(I)所示三氮唑類化合物，進行下一步操作；式(I)～(III)中R和R1為取代或未被取代的苯環類、雜環類或鏈烴類取代基；(2)採用螢光探針法檢測三氮唑類化合物的單胺氧化酶活性取步驟(1)含三氮唑類化合物的反應液，以水稀釋至濃度為50～100μM，吸取稀釋液加入96孔板的反應孔中，再加入pH8.4硼酸緩衝液和BSA，加入適量MAO-A或MAO-B，混合物在38℃反應3h，然後加入螢光探針，再在38℃反應2h，用全功能螢光分光光度 計(λex/λem＝365/460nm)進行檢測，根據螢光值的高低判斷三氮唑類化合物對單胺氧化酶抑制活性的高低螢光強度越強，則抑制活性越弱；反之其抑制活性就越強。FDA0000023143590000011.tif
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述螢光探針為下列之一(1)4-甲 基-7_(3-氨基丙基)-香豆素、(2)苯丙胺、(3)4-甲基-7-(l-甲基-1，2，3，6-四氫吡 啶-4-氧基)_香豆素。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(1)中叔丁醇與水體積比為1 1。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(1)中所述三氮唑類化合物構建方 法如下將所述炔類和疊氮類化合物分別溶解在叔丁醇中，製成濃度IOmM的溶液1和溶液 2 ；硫酸銅和抗壞血酸分別溶解在水中，製成硫酸銅濃度0. ImM的溶液3、抗壞血酸濃度ImM 的溶液4，取等體積的溶液1、2、3和4混合，38 32°C搖床反應24h以上，反應結束後，進行 質譜分析。
5.一種按權利要求1方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結構如式(I-I)所示
6.一種按權利要求1方法篩選獲得的三氮唑類化合物，結構如下式所示 R2SH或羧基。
7.如權利要求6所述的三氮唑類化合物，其特徵在於所述三氮唑類化合物為下列之
全文摘要
本發明提供了一種利用「點擊化學」構建三氮唑化合物並高通量篩選單胺氧化酶抑制劑的方法，以及篩選到的三氮唑類化合物。本發明式(II)所示的疊氮類化合物和和式(III)所示的炔類化合物為反應底物，經點擊化學構建得到式(I)所述三氮唑類化合物，再以螢光檢測方法檢測單胺氧化酶抑制活性，方法新穎，操作過程簡便，原料來源都已商品化容易得到，並且所得到的單胺氧化酶抑制劑性質很穩定，純度也很高(99％以上)；與以前所研究的單胺氧化酶抑制劑的方法相比，快速高效，節約成本和時間，所篩得的新型三氮唑類單胺氧化酶抑制劑，結構簡單，其抑制活性、對MAO-A和MAO-B選擇性都有很大的提高，具有高通量篩選的特點。
文檔編號C07D401/04GK101881733SQ20101021947
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月8日 優先權日2010年7月8日
發明者朱勍, 賈朝 申請人:浙江工業大學