用於生物反應系統的包被的基底的製作方法

2023-09-24 03:32:20 7

用於生物反應系統的包被的基底的製作方法
【專利摘要】提供了用於生物反應的裝置。所述裝置包括基底和在所述基底中的多個反應位點。所述基底的表面被配置為具有第一親水性，且所述多個反應位點的每個表面被配置為具有第二親水性，以用樣品體積加載相當數量的反應位點。每個加載的反應位點的樣品體積基本上被限制於其各自的反應位點。所述樣品體積被配置為在反應位點內經歷生物反應。
【專利說明】用於生物反應系統的包被的基底
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年3月16日遞交的美國臨時專利申請第61/612, 005號、2012年 3月16日遞交的美國臨時專利申請第61/612, 087號、2012年11月7日遞交的美國臨時 專利申請第61/723,759號、2012年3月16日遞交的美國臨時專利申請第61/612, 008號、 2012年11月7日遞交的美國臨時專利申請第61/723, 658號和2012年11月7日遞交的美 國臨時專利申請第61/723, 738號的優先權，所有以上申請還均通過引用整體併入本文。
[0003] 發明背景
[0004] 本公開涉及處理用於生物反應系統的基底表面的方法，且更具體地，涉及對用於 生物反應系統的基底表面進行化學處理以防止生物分子粘附於該表面的方法。
[0005] 聚合酶鏈式反應（PCR)是擴增靶DNA序列的方法。以前，PCR通常在96或384孔 微板中進行。如果期望更高的產量，在微板中進行的常規PCR方法則不具成本效益或高效 性。而且，在增加通量方面，降低PCR反應體積可降低試劑的消耗，並從反應體積的熱質減 少而使得擴增次數減少。該策略可以陣列形式（m X n)實施，產生大量的較小反應體積。此 夕卜，採用陣列允許進行具有增加的定量靈敏度、動態範圍和特異性的可擴展高通量分析。
[0006] 陣列也已經被用於進行數字聚合酶鏈式反應（dPCR)。來自dPCR的結果可用於檢 測和定量稀有等位基因的濃度，以提供核酸樣品的絕對定量，並測量核酸濃度的低倍數變 化。通常，增加重複的數量能增加 dPCR結果的精確度和再現性。
[0007] 大多數定量聚合酶鏈式反應（qPCR)平臺中的陣列形式被設計用於基於樣品的分 析（sample-by-assay)的實驗，其中PCR結果需為可尋址的以用於運行後分析。然而，對於 dPCR，每個PCR結果的具體位置或小井可能是不重要的，且可僅分析陽性和陰性重複的數 目。
[0008] dPCR的讀數，也即，陽性反應數目和陰性反應數目與模板的濃度呈線性比例關係， 而qPCR讀數（信號相對於循環）與模板濃度的對數成比例。因而，對於dPCR，可取的是使 樣品體積最小化。
[0009] 然而，持續降低反應體積會導致例如對涉及將樣品體積加載至陣列並維持所述樣 品體積的物理分離的置信度的挑戰。換句話說，將樣品體積加載至儘可能多的小井或通孔 並減少小井或通孔之間的交叉串擾非常重要。
[0010] 發明概述
[0011] 在一個示例性實施方案中，提供了用於生物反應的裝置。所述裝置包括基底和在 所述基底中的多個反應位點。基底的表面被配置為具有第一親水性，且所述多個反應位點 的每個表面被配置為具有第二親水性，以用樣品體積加載相當數量的反應位點。每個加載 的反應位點的樣品體積基本上被限制於其各自的反應位點。所述樣品體積被配置為在反應 位點內經歷生物反應。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 圖1為根據本文教導的各種實施方案的示例性包被的基底；
[0013] 圖2顯示了根據本文教導的各種實施方案的後退和前進接觸角；
[0014] 圖3顯示了根據本文教導的各種實施方案，通過樣品加載器加載反應位點；
[0015] 圖4的流程圖顯示了根據本文教導的各種實施方案的示例性方法；
[0016] 圖5顯示了包被根據本文教導的各種實施方案的基底的基底表面的步驟；
[0017] 圖6顯示了包被根據本文教導的各種實施方案的基底的垂直面的步驟；
[0018] 圖7顯示了包被根據本文教導的各種實施方案的基底的基底表面的另一步驟；
[0019] 圖8顯示了包被根據本文教導的各種實施方案的基底的垂直面的另一步驟；和
[0020] 圖9的方框圖顯示了可使用根據本文教導的各種實施方案包被的基底的示例性 聚合酶鏈式反應儀。
[0021] 發明詳述
[0022] 為了提供對本發明更充分的理解，以下描述列舉了很多具體細節如具體結構、參 數、實例等。然而，應認識到這樣的描述並非旨在限制本發明的範圍，而是旨在提供對示例 性實施方案的更好描述。
[0023] 同時進行幾個生物反應可能需要具有多個反應位點的基底，各反應位點具有加載 的樣品。應認識到，反應位點可為但不限於，例如通孔、凹口或小井。而且，為增加每個實驗 的反應數目，可增加基底上的反應位點密度，同時也降低樣品區大小。例如，在15_xl5mm 的基底上可包含10, 〇〇〇個反應位點。然而，如果在15mmxl5mm的基底包含30, 000個反應 位點，樣品區可隨著基底上的反應位點密度不斷增大而變得更小。
[0024] 根據本文描述的各種實施方案，提供了可用樣品體積充分加載的裝置。基底特定 區域的表面特性如疏水性和/或親水性可有助於將液體樣品加載至反應位點。如上所述， 疏水性/親水性的水平可基於影響加載基底的多個反應位點的便利性和效率的各種因素。
[0025] 例如，影響反應位點加載的一個因素為反應位點的物理幾何形狀，並且/或者基 底可能有助於加載所述樣品。例如基於反應位點深度（晶片厚度）和反應位點直徑的反應 位點之間的縱橫比，可為確定充分加載所述反應位點所需特性的因素。反應位點深度（芯 片厚度）與直徑的比率被稱為縱橫比。例如，如果反應位點深度等於反應位點直徑，則縱橫 比為1。在另一實例中，當反應位點深度為反應位點直徑的10倍時，縱橫比為10。反應位 點的直徑影響毛細管力，其使得能夠/有助於用液體反應媒介加載反應位點。在一些實施 方案中，直徑越小，毛細管力越大，且更利於/便於加載反應位點。
[0026] 根據各種實施方案，影響用樣品體積加載反應位點的另一因素為期望的加載效率 和/或一致性。期望的效率是大於或等於90%的反應位點被加載。在其他實施方案中，期 望的效率可為90%的反應位點被加載，且反應位點之間的差異最多為10%。
[0027] 根據各種實施方案，影響用樣品體積加載反應位點的另一因素為在反應位點內材 料與期望的反應的相容性。在一些實施方案中，所述期望的反應可為擴增反應。更具體地， 所述擴增反應可為聚合酶鏈式反應（PCR)。根據各種實施方案，裝置接觸例如參與反應的樣 品體積、酶或試劑的部分，不應該與樣品體積、酶或試劑發生化學相互作用。例如，接觸反應 的材料不應該將可能干擾反應的離子洩露到所述反應位點。
[0028] 根據各種實施方案，影響加載反應位點的又一因素為被加載至反應位點後所需的 樣品體積的限制。換句話說，需要有足夠的力來防止從每個反應位點洩漏樣品體積，以防止 從一個反應位點溢出至另一反應位點，並防止樣品體積在反應位點外的任何積聚。
[0029] 考慮到上述因素，能滿足這些目標的裝置可被設計和用於在包含小體積的多個反 應位點中進行反應。
[0030] 為使表面產生足夠的疏水/親水特性，可將該表面包被另一種材料。根據本文教 導的各種實施方案，基底表面的部分的塗層具有親水特性，且反應位點表面的部分的塗層 具有親水特性。儘管兩種表面均具有親水特性，所述反應位點可通過例如毛細管作用來加 載。根據各種實施方案，所述親水塗層可為相同的塗層。根據各種實施方案，所述塗層可通 過氣相沉積來包被。
[0031] 另一方面，根據本文教導的各種實施方案，基底表面的部分的塗層具有疏水特性， 且反應位點表面的部分的塗層具有疏水特性。儘管兩種表面均具有疏水特性，所述反應位 點可通過例如毛細管作用來加載。根據各種實施方案，所述疏水塗層可為相同的塗層。根 據各種實施方案，所述塗層可通過氣相沉積來包被。
[0032] 而且，根據本文描述的其他實施方案，基底的包被方法包括包被基底表面的部分 以具有疏水特性，並包被基底表面的部分以具有親水特性，這可能會有助益。而且，根據一 些實施方案，包被樣品區表面以具有親水性，並包被基底的其他表面以具有疏水性。以這種 方式，所述疏水性/親水性有助於將液體樣品加載至反應位點。所述反應位點可通過例如 毛細管作用來加載。
[0033] 此外，根據各種實施方案，具有疏水/親水表面可減少反應位點之間液體樣品的 交叉汙染。所述疏水區可有助於將每個液體樣品保持在反應位點內其各自的樣品區。根據 各種實施方案，連續或完全的塗層也可防止或減少從基底洩漏可能會干擾反應的離子。 [0034] 根據各種實施方案，塗層相比其他塗層具有增加的物理和化學穩定性且為生物相 容的。其可防止或減少吸附以及隨後用於生物反應的活性生物化學物質和材料的抑制作 用。這些可包括例如酶、探針和DNA。尤其是對於數字PCR應用，重要的是使反應化學物質 和組分被吸附至不期望的表面減至最小。
[0035] 某底
[0036] 根據本文描述的各種實施方案，基底材料可為例如矽、氧化矽、玻璃、金屬、陶瓷或 塑料。玻璃可為光敏玻璃。然而，本領域技術人員應認識到，根據本文教導的各種實施方案， 可包被生物相容且不幹擾螢光檢測的任何材料。
[0037] 如以上所述，減少反應體積可允許更高密度的反應體積，從而可在給定的區域內 進行更多的反應。例如，基底上由300 iim直徑的通孔組成的陣列可含有約30nL的反應體 積。例如，通過將陣列中每個通孔的大小降低至直徑60-70 ii m，每個反應體積可為100pL。 根據本文描述的各種實施方案，反應體積的範圍可為約IpL至30nL。在一些實施方案中，反 應位點陣列可由各種不同體積的反應區域組成以增加動態範圍。
[0038] 圖1顯示了根據本文描述的各種實施方案的晶片100,其包含具有反應位點104的 陣列的基底1〇〇。晶片1〇〇可稱為例如物件、裝置、消耗品、陣列、滑片（slide)或壓板。
[0039] 晶片100包括基底100。基底102可為各種材料，包括但不限於，例如金屬、玻璃、 陶矽和氧化矽。
[0040] 晶片100還包括多個反應位點104。所述多個反應位點104可為例如小井、空腔或 通孔。每個樣品區也可具有多種橫截面幾何形狀，例如圓形、三角形或六邊形。具有其他幾 何形狀可允許更緊密地裝填反應位點，以進一步增加在給定區域中的反應數目。而且，反應 位點的幾何形狀也可有助於將液體樣品加載至反應位點。
[0041] 圖1中晶片100的橫截面圖顯示了多個通孔104。每個通孔104從基底102第一表 面的開口延伸至基底102第二表面的開口，每個通孔104被配置為通過毛細管作用提供足 夠的表面張力以容納待處理或檢測的各個含有生物樣品的液體樣品。晶片100可具有如以 下任一申請中所公開的通用形式或結構：美國專利第6, 306, 578、7, 332, 271、7, 604, 983、 7, 682, 565、6, 387, 331或6, 893, 877號，其通過引用整體併入本文，如同其在本文被充分地 陳述。
[0042] 根據各種實施方案，通孔104可具有約1. 3納升的容積。可選擇地，例如，通過減 小通孔104的直徑和/或基底102的厚度，每個通孔的容積可小於1. 3納升。例如，每個通 孔104具有的容積可為小於或等於1納升、小於或等於100皮升、小於或等於30皮升，或小 於或等於10皮升。在其他實施方案中，一些或所有通孔104的容積範圍可為1-20納升。
[0043] 在某些實施方案中，通孔104的密度可為至少50個通孔/平方毫米。在其他實施 方案中，通孔的密度可能更高。例如，晶片100內通孔104的密度可大於或等於150個通孔 /平方毫米、大於或等於200個通孔/平方毫米、大於或等於500個通孔/平方毫米、大於或 等於1，000個通孔/平方毫米、大於或等於10, 000個通孔/平方毫米。
[0044] 晶片100的其他實施方案還描述於以下文獻中：2012年3月16日遞交的第 61/612, 087號臨時申請（案件編號LT00655 PRO)和2012年11月7日遞交的第61/723, 759 號臨時申請（案件編號LT00655 PRO 2)，為所有目的將其併入本文。
[0045] 如上所述，減少樣品區域的大小可導致與將液體樣品加載至每個樣品區有關的挑 戰。根據本文描述的各種實施方案，施用至基底表面的塗層可有助於將液體樣品加載至反 應位點，以及使反應位點之間的串擾減至最小。
[0046] 根據本文描述的實施方案，在包被之前，可清潔和水化所述基底以使其準備用於 隨後的化學反應。清潔以去除在運輸和儲藏期間可能發生的任何可能的汙染，例如，從而確 保包被過程的一致性。
[0047] 應認識到，本文件描述的方法和方案為根據本文描述的各種實施方案的實例。可 修改所述方案以用於高縱橫比晶片和/或低縱橫比晶片。在一些實施方案中，當水接觸角 為60-100度時，可產生充分的加載。在其他實施方案中，當水接觸角為75-90度時，可產生 充分的加載。
[0048] 而且，如各種實施方案所描述，雙塗層和單塗層均可實現包被。而且，根據各種實 施方案的包被方法可包括例如液體包被方法以及氣相沉積方法。
[0049] 親水性方法
[0050] 如以上所述，根據本文教導的各種實施方案，可使用基底表面以及反應位點表面 的親水塗層以便製備用於生物反應的反應位點陣列。同樣，如以上所述，基底可稱為晶片， 而反應位點可為，但不限於，例如通孔、凹口或小井。根據各種實施方案，基底表面和反應位 點的塗層可為相同的材料。在其他實施方案中，基底表面和反應位點的塗層可為不同的材 料。基底表面和反應位點表面可通過氣相沉積方法來包被。
[0051] 儘管根據各種實施方案，基底表面和反應位點表面均可能具有親水特性，可基於 毛細管作用來加載液體樣品。換句話說，液體樣品和反應位點壁之間的粘附力將把所述液 體樣品拉入反應位點。從以下等式中可知，可被拉入每個反應位點的液體樣品的量，取決於 反應位點的半徑。
[0052] 液柱的高度h通過下式給出：
[0053]

【權利要求】
1. 用於生物反應的裝置，所述裝置包括： 基底；和 在所述基底中的多個反應位點， 其中所述基底的表面被配置為具有第一親水性，且所述多個反應位點的每個表面被配 置為具有第二親水性，以用樣品體積加載相當數量的反應位點， 其中每個加載的反應位點的樣品體積基本上被限制於其各自的反應位點，和 其中所述樣品體積被配置為在反應位點內經歷生物反應。
2. 如權利要求1所述的裝置，其中所述第一親水性產生60-100度的水前進接觸角。
3. 如權利要求1所述的裝置，其中所述第一親水性產生75-90度的前進接觸角。
4. 如權利要求1所述的裝置，其中所述第一親水性與所述第二親水性相同。
5. 如權利要求2所述的裝置，其中水後退接觸角為60-100度。
6. 如權利要求5所述的裝置，其中所述水前進接觸角和所述後退接觸角之間的差異為 〇度。
7. 如權利要求5所述的裝置，其中所述水前進接觸角和所述後退接觸角之間的差異為 〇-30 度。
8. 如權利要求5所述的裝置，其中所述水前進接觸角和所述後退接觸角之間的差異為 10-15 度。
9. 如權利要求1所述的裝置，其中通過用相同的材料包被所述基底的表面和所述多個 反應位點的每個表面，所述基底的表面被配置為具有第一親水性，且所述多個反應位點的 每個表面被配置為具有第二親水性。
10. 如權利要求9所述的裝置，其中所述材料為六甲基二矽氮烷（HMDS)。
11. 如權利要求9所述的裝置，其中通過氣相沉積方法來包被所述基底的表面和所述 多個反應位點的每個表面。
12. 如權利要求1所述的裝置，其中所述相當數量的反應位點為90% -100%的所述多 個反應位點。
13. 如權利要求1所述的裝置，其中加載至所述多個反應位點的液體樣品體積最多為1 納升。
14. 如權利要求1所述的裝置，其中所述基底由下述材料之一組成：矽、氧化矽、玻璃和 塑料。
15. 如權利要求1所述的裝置，其中所述多個反應位點為通孔。
16. 如權利要求1所述的裝置，其中所述生物反應為擴增反應。
17. 如權利要求1所述的裝置，其中所述第一和第二親水性產生足夠的表面張力以將 樣品體積基本上限制在每個加載的反應位點內。
18. 如權利要求1所述的裝置，其中毛細管作用決定加載至每個反應位點的液體樣品 的體積，其中毛細管作用的量是基於每個反應位點的容積。
19. 設計具有多個反應位點的基底的方法，所述方法包括： 用第一材料確定液體樣品的水前進接觸角； 用所述第一材料確定液體樣品的水後退接觸角；以及 如果所述水後退接觸角在所述水前進接觸角的15度以內，則用所述第一材料包被基 底的第一表面和所述多個反應位點的每個反應位點表面。
【文檔編號】B01L3/00GK104334273SQ201380023031
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月15日 優先權日:2012年3月16日
【發明者】艾裡奧道·陳丘, 埃文·福斯特, 西奧多·斯特勞博, 麥可·C·帕拉斯 申請人:生命技術公司