一種樟芝菌中腺苷的提取方法
2023-10-28 08:11:32
一種樟芝菌中腺苷的提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種樟芝菌中腺苷的提取方法。所述的提取方法包括以下步驟：先將樟芝菌接種於PDA培養基中進行菌種活化，再將活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，搖床培養得到搖床培養後的樟芝菌搖床培養，再取2%-5%的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中培養，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液，最後製備樟芝菌菌絲體乾粉，並將其溶於加有有機溶劑的水中在40-50°C的恆溫水浴鍋裡浸提40-60min，離心取沉澱用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。本發明中先對樣品進行預處理，在有機溶劑提取時，將提取溫度控制在40-5CTC，提取時間控制在40-60min,大大縮短了提取時間，同時也使腺苷,提取率明顯增加，還能維護腺苷結構的穩定性。
【專利說明】一種樟芝菌中腺苷的提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種真菌有效成份的提取，具體涉及一種樟芝菌中腺苷的提取方法。
【背景技術】
[0002] 樟芝Antrodia camphorata又稱牛樟芝或牛樟燕，是臺灣特有珍貴真菌。研究發 現樟芝成分複雜，含有很多生理活性物質具有多種生理活性，如抗氧化、保肝、抗癌、解毒、 消炎等，對食物中毒等危急病症具有神奇的療效。腺苷也是牛樟芝重要成分中的一種，其是 一種內源性嘌呤核苷酸，具有廣泛的生理活性，如可以減少心肌漏出酶，維持細胞膜完整， 降低冠狀動脈阻力和肺動脈壓，並能促進造血等功能。另外，腺苷在炎症中由大量ATP降解 而成，局部濃度可達1200nm 〇L/L，腺苷濃度在此水平時具抗炎作用。目前ATP已廣泛用於心 功能不全及血管動脈硬化等疾病的治療。目前，國內外對腺苷的提取方法主要包括超聲提 取、冷凝回流提取及水浴提取，提取介質主要包括水、甲醇、乙醇等，提取時採用的提取介質 不同、提取方法不同時，腺苷提取率也不同，但上述方法存在操作繁瑣或提取率低等缺點。 為此，本發明對水浴浸提的方法進行了進一步改進，提供一種操作簡單，腺苷提取率高的提 取方法。
【發明內容】
[0003] 針對上述現有技術的不足，本發明提供一種對樟芝菌中腺苷進行有效提取的方 法。
[0004] 本發明的技術方案如下： 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種於PDA培養基中，培養活化得到活化後的樟芝菌； (2) 搖床培養：將步驟（1)中得到的活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，搖床培 養得到搖床培養後的樟芝菌； (3) 發酵培養：取2%-5%的步驟（2)中得到的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中培 養，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液； (4) 樟芝菌乾粉製備：取步驟（3)中得到的深層發酵後的樟芝菌發酵液離心，取沉澱加 水洗滌，再次離心，洗滌，將洗滌液在45-55°C條件下真空冷凍乾燥，粉碎過篩，製得樟芝菌 菌絲體乾粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測定：將步驟（4)中製得的樟芝菌菌絲體乾粉溶於加有有機 溶劑的水中，在40-50°C的恆溫水浴鍋裡浸提40-60min，離心，棄上清液，取沉澱用水洗滌， 取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0005] 步驟（1)中所述的PDA培養基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營養液 5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白腖5-10%，酵母粉2-5%，瓊脂5%-8%，水餘量。
[0006] 步驟（1)中所述的PDA培養基的製成方法具體為：將5%_10%牛樟木萃取的營養 液，10-30%的葡萄糖，5-10%的蛋白腖，2-5%的酵母粉，5%-8%的瓊脂，水餘量，加熱融化，裝 試管，滅菌。
[0007] 所述的滅菌方法具體為：121°C條件下溼熱滅菌30_45min。
[0008] 優選的，步驟（1)中所述的培養溫度為25_28°C，培養時間為5-7d。
[0009] 步驟（2)中所述的液體種子培養基及步驟（3)中所述的發酵罐中的培養基均由以 下重量份的組分製成：牛樟木萃取的營養液5%_10%，葡萄糖10-30%，蛋白腖5-10%，酵母粉 2-5%，水餘量。
[0010] 優選的，步驟（2)中所述的搖床培養的培養溫度為25-28°C，培養時間為5-10d，搖 床速度為 150_180r/min。
[0011] 優選的，步驟（3)中所述的培養溫度為25-28°C，培養時間為3-5d，通氣量為lvvm。
[0012] 優選的，步驟（4)及步驟（5)中所述的離心速度為3000-5000r/min，離心溫度為 25-28°C ;所述的過篩為過60-80目篩。
[0013] 優選的，步驟（5)中所述的溶劑選自乙醇或甲醇中的一種；所述的溶劑與水的體 積比為（3-5) : (11-17) 本發明與現有技術相比，有益效果體現在以下幾點： 1.研究顯示，真菌中腺苷的提取溫度對腺苷的提取率具有顯著的影響，提取溫度在 40-50°C時，腺苷提取率有所增加，而當超過50°C時，腺苷提取率明顯下降，因此，本發明中， 在對腺苷進行恆溫水浴浸提時，將溫度控制在40-50°C，更加利於樣品中腺苷的有效提取， 此外，在溫度控制在40-50 °C時還有利於維護腺苷結構的穩定性。
[0014] 2.研究顯示，採用有機溶劑進行腺苷提取時，提取時間在2. 5h左右時，腺苷提取 率最高，本發明中，先對樣品進行預處理製得樟芝菌乾粉，在採用有機溶劑提取時，將溶劑 與水的體積比限定為（3-5) : (11-17)，在保證提取效果的基礎上，可明顯縮短提取時間。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合實施例對本發明做進一步說明。
[0016] 實施例1 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種於PDA培養基中，在25°C條件下培養5d，培養活化得到活 化後的樟芝菌； (2) 搖床培養：將步驟（1)中得到的活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，在 25°C，150r/min條件下搖床培養5d，得到搖床培養後的樟芝菌； (3) 發酵培養：取2%的步驟（2)中得到的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中在25°C 條件下培養3d，通氣量為lvvm，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液； (4) 樟芝菌乾粉製備：取步驟（3)中得到的深層發酵後的樟芝菌發酵液在25°C條件下 採用3000r/min離心，取沉澱加水洗滌，以3000r/min再次離心，洗滌，將洗滌液在45°C條件 下真空冷凍乾燥，粉碎過60目篩，製得樟芝菌菌絲體乾粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測定：將步驟（4)中製得的樟芝菌菌絲體乾粉溶於加有乙醇 的水中，乙醇與水的體積比為3:11，在40°C的恆溫水浴鍋裡浸提40min，在25°C條件下以 3000r/min離心，棄上清液，取沉澱用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0017] 步驟（1)中所述的PDA培養基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營養液5%， 葡萄糖10%，蛋白腖5%，酵母粉2%，瓊脂5%，水餘量。
[0018] 步驟（1)中所述的PDA培養基的製成方法具體為：將5%牛樟木萃取的營養液，10% 的葡萄糖，5%的蛋白腖，2%的酵母粉，5%的瓊脂，水餘量，加熱融化，裝試管，在121°C條件下 溼熱滅菌30min。
[0019] 步驟（2)中所述的液體種子培養基及步驟（3)中所述的發酵罐中的培養基均由以 下重量份的組分製成：牛樟木萃取的營養液5%，葡萄糖10%，蛋白腖5%，酵母粉2%，水餘量。
[0020] 實施例2 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種於PDA培養基中，在28°C條件下培養7d，培養活化得到活 化後的樟芝菌； (2) 搖床培養：將步驟（1)中得到的活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，在 28°C，180r/min條件下搖床培養10d，得到搖床培養後的樟芝菌； (3) 發酵培養：取5%的步驟（2)中得到的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中在28°C 條件下培養5d，通氣量為lvvm，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液； (4) 樟芝菌乾粉製備：取步驟（3)中得到的深層發酵後的樟芝菌發酵液在28°C條件下 採用5000r/min離心，取沉澱加水洗滌，以5000r/min再次離心，洗滌，將洗滌液在55°C條件 下真空冷凍乾燥，粉碎過80目篩，製得樟芝菌菌絲體乾粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測定：將步驟（4)中製得的樟芝菌菌絲體乾粉溶於加有甲醇 的水中，甲醇與水的體積比為5:17,在50°C的恆溫水浴鍋裡浸提60min，在28°C條件下以 5000r/min離心，棄上清液，取沉澱用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0021] 步驟（1)中所述的PDA培養基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營養液 10%，葡萄糖30%，蛋白腖10%，酵母粉5%，瓊脂8%，水餘量。
[0022] 步驟（1)中所述的PDA培養基的製成方法具體為：將10%牛樟木萃取的營養液， 30%的葡萄糖，10%的蛋白腖，5%的酵母粉，8%的瓊脂，水餘量，加熱融化，裝試管，在121°C條 件下溼熱滅菌45min。
[0023] 步驟（2)中所述的液體種子培養基及步驟（3)中所述的發酵罐中的培養基均由以 下重量份的組分製成：牛樟木萃取的營養液10%，葡萄糖30%，蛋白腖10%，酵母粉5%，水餘 量。
[0024] 實施例3 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種於PDA培養基中，在26°C條件下培養6d，培養活化得到活 化後的樟芝菌； (2) 搖床培養：將步驟（1)中得到的活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，在 26°C，160r/min條件下搖床培養8d，得到搖床培養後的樟芝菌； (3) 發酵培養：取3%的步驟（2)中得到的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中在26°C 條件下培養4d，通氣量為lvvm，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液； (4) 樟芝菌乾粉製備：取步驟（3)中得到的深層發酵後的樟芝菌發酵液在26°C條件下 採用4000r/min離心，取沉澱加水洗漆，以4000r/min再次離心，洗漆，將洗漆液在50°C條件 下真空冷凍乾燥，粉碎過80目篩，製得樟芝菌菌絲體乾粉； (5)腺苷提取及腺苷含量測定：將步驟（4)中製得的樟芝菌菌絲體乾粉溶於加有甲醇 的水中，甲醇與水的體積比為4:15,在45°C的恆溫水浴鍋裡浸提50min，在26°C條件下以 4000r/min離心，棄上清液，取沉澱用水洗滌，取洗滌液即為腺苷的提取液。
[0025] 步驟（1)中所述的PDA培養基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營養液8%， 葡萄糖20%，蛋白腖8%，葡萄糖12%，酵母粉3%，瓊脂6%，水餘量。
[0026] 步驟（1)中所述的PDA培養基的製成方法具體為：將8%牛樟木萃取的營養液，20% 的葡萄糖，8%的蛋白腖，3%的酵母粉，6%的瓊脂，水餘量，加熱融化，裝試管，在121°C條件下 溼熱滅菌40min。
[0027] 步驟（2)中所述的液體種子培養基及步驟（3)中所述的發酵罐中的培養基均由以 下重量份的組分製成：牛樟木萃取的營養液8%，葡萄糖20%，蛋白腖8%，酵母粉3%，水餘量。
[0028] 上述實施例僅為本發明的優選實施方式，並不應理解為對本發明的限定，本領域 技術人員根據本發明的揭示，不脫離本發明範疇所做出的改進和修改都應該在本發明的保 護範圍之內。
【權利要求】
1. 一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，包括以下步驟： (1) 菌種活化：將樟芝菌接種於PDA培養基中，培養活化得到活化後的樟芝菌； (2) 搖床培養：將步驟（1)中得到的活化後的樟芝菌接種於液體種子培養基中，搖床培 養得到搖床培養後的樟芝菌； (3) 發酵培養：取2%-5%的步驟（2)中得到的搖床培養後的樟芝菌接種於發酵罐中培 養，得到深層發酵後的樟芝菌發酵液； (4) 樟芝菌乾粉製備：取步驟（3)中得到的深層發酵後的樟芝菌發酵液離心，取沉澱加 水洗滌，再次離心，洗滌，將洗滌液在45-55°C條件下真空冷凍乾燥，粉碎過篩，製得樟芝菌 菌絲體乾粉； (5) 腺苷提取及腺苷含量測定：將步驟（4)中製得的樟芝菌菌絲體乾粉溶於加有有機 溶劑的水中，在40-50°C的恆溫水浴鍋裡浸提40-60min，離心，棄上清液，取沉澱用水洗滌， 取洗滌液即為腺苷的提取液。
2. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（1)中所述的 PDA培養基由以下重量份的組分組成：牛樟木萃取的營養液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白腖 5-10%，酵母粉2-5%，瓊脂5%-8%，水餘量。
3. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（1)中所述的 PDA培養基的製成方法具體為：將5%-10%牛樟木萃取的營養液，10-30%的葡萄糖，5-10%的 蛋白腖，2-5%的酵母粉，5%-8%的瓊脂，水餘量，加熱融化，裝試管，滅菌。
4. 根據權利要求3所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，所述的滅菌方法 具體為：121°C條件下溼熱滅菌30-45min。
5. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（1)中所述的 培養溫度為25-28°C，培養時間為5-7d。
6. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（2)中所述的 液體種子培養基及步驟（3)中所述的發酵罐中的培養基均由以下重量份的組分製成：牛樟 木萃取的營養液5%-10%，葡萄糖10-30%，蛋白腖5-10%，酵母粉2-5%，水餘量。
7. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（2)中所述的 搖床培養的培養溫度為25-28°C，培養時間為5-10d，搖床速度為150-180r/min。
8. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（3)中所述的 培養溫度為25-28°C，培養時間為3-5d，通氣量為lvvm。
9. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（4)及步驟 (5)中的所述的離心速度為3000-5000r/min，離心溫度為25-28°C ;所述的過篩為過60-80 目篩。
10. 根據權利要求1所述的一種樟芝菌中腺苷的提取方法，其特徵於，步驟（5)中所述 的溶劑選自乙醇或甲醇中的一種；所述的溶劑與水的體積比為（3-5) : (11-17)。
【文檔編號】C07H1/06GK104212856SQ201410471596
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】劉巴寧, 鄭安喬 申請人:中山安蕎生物科技有限公司