真菌快速檢測試劑盒及其檢測方法

2023-10-28 19:29:42 1

專利名稱：真菌快速檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明屬於臨床微生物鑑定技術領域，具體涉及一種快速鑑定臨床樣本真菌的試 劑盒及檢測方法。
背景技術：
隨著腫瘤的放射治療、化學治療、廣譜抗生素以及免疫製劑的廣泛應用，系統性、 機會性真菌感染日益增加，特別是在血液系統惡性疾病、腫瘤和骨髓移植及器官移植中。例 如18% 50%的病人在骨髓移植後發生侵染性真菌感染；器官移植受者和惡性腫瘤患者 中真菌感染的患病率高達20% 40%。據我國醫院感染檢測網分析，醫院真菌感染從90 年代前期的13. 9%上升至90年代末期的17. 24.4%，隨著真菌感染日益增多，抗真菌 藥的使用導致真菌耐藥性也逐漸增加。侵染性真菌病多發生在有嚴重基礎疾病的患者，其 預後差、病死率高，念珠菌病病死率為30 % 40 %，麴黴菌病病死率高達50 % 100 %。在 大器官移植患者中侵染性真菌感染已成為患者死亡的重要因素之一。據近年有關文獻報導，真菌感染上升速度如此之快，主要原因可能有以下幾點1 廣譜及超廣譜抗生素不加控制的使用，破壞了人體正常微生態平衡而引起真菌感染；2免 疫低下人群比例增加，如ICU病房患者，腫瘤、血液病、愛滋病及老年患者均為高危病房，高 危病種，高危人群；3介入性治療和外科手術的改進提高了病人的生存率，同時也為侵入性 真菌感染創造了條件。而各種抗真菌藥物的濫用，更加劇了真菌感染的復發和增加了治療 難度。因此，對臨床上建立快速真菌分離培養、鑑定顯得尤為重要，可大大改善臨床治療效^ ο真菌病的診斷目前主要依靠常規直接鏡檢及培養和形態學鑑定發現和確認病原 菌，其操作繁瑣、費時、並且需要高度的專業知識。尤其對於那些生長條件特殊、形態相似的 菌株要通過傳統的表型特徵鑑定方法來加以鑑別顯得非常困難。直接鏡檢操作簡便、快速、 實用，陽性結果可以確定真菌感染，但檢測陽性率很低，陰性結果不能排除感染，需與培養 法結合使用，如在無菌體液的直接鏡檢中發現真菌成分常可確立深部真菌病的診斷，但在 有菌部位則只有發現大量真菌菌絲才具有診斷意義。培養檢查法可進一步提高陽性率，但 其操作複雜，費時費力，培養時間一般為4周，個別生長緩慢的菌則需要更久，而且培養法 的陽性檢出率也不高。免疫學技術診斷臨床真菌感染因抗體檢測交叉反應嚴重、特異性抗 原檢測同樣存在的假陰性和假陽性問題限制了其應用。基因晶片技術雖然能夠同時進行多 種真菌的鑑定，但涵蓋的菌種面窄，對非常見菌、突變菌或者新菌種無能為力，成本過高也 是制約其發展的重要因素，雜交方式固有的局限性影響了其特異性。今年來，質譜技術以其 快速準確的優點被用於微生物鑑定，由於質譜鑑定必須是培養後分純的單克隆菌落，而且 設備昂貴，操作難度高等限制了其應用。其實在現實研究工作中，基於對rDNA-ITS的長度多態性和序列多態性的序列分 析，由於可以從不太長的核酸序列中獲得相對足夠的信息用來反應生物親緣關係與分類情 況，因而成為真菌分類及鑑定研究的熱點，目前已廣泛應用於真菌的屬種間及部分種內組群水平的系統學研究。真菌核糖體DNA(rDNA)上的保守序列廣泛，有著不同的進化水平的 區域序列，可用於不同等級的真菌分類鑑定。核糖體DNA上的內轉錄間隔區ITS是存在於 18S rDNA、5. 8S rDNA和28S rDNA之間的區域，該區域受外界環境因素的影響小，與編碼區 相比具有進化速度快的特點，在種內的不同菌株之間高度保守，而在真菌種間存在極大的 變化，表現出極大的序列多態性，可以為真菌學的研究提供豐富的遺傳信息。因此以真菌 rDNA序列分析為基礎，基於內轉錄間隔區序列標記具有的保守特性，滿足臨床病原真菌的 鑑定，在較短時間內就可以對病原真菌進行分類鑑定，鑑定未知或難培養真菌，便於對臨床 病症進行早期診斷並實施有效治療。焦磷酸測序(Pyrosequencing)技術是新一代DNA序列分析技術，該技術無須進行 電泳，DNA片段也無須螢光標記，操作極為簡便。焦磷酸測序技術是由4種酶催化的同一反 應體系中的酶級聯化學發光反應，在每一輪測序反應中，只加入一種dNTP，若該dNTP與模 板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中並釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。PPi可 最終轉化為可見光信號，並由Pyrogram TM轉化為一個峰值。每個峰值的高度與反應中摻 入的核苷酸數目成正比。然後加入下一種dNTP，繼續DNA鏈的合成。焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，通量高、操作方便，便於 構建標準化操作流程，因此廣受研究者青睞，並在很多方面已應用於臨床微生物的分型鑑 定。Gharizaden等(2004)第一次用焦磷酸測序技術通過rDNA_ITS中的一對通用引物測定 酵母菌18S RNA異變區的40個鹼基序列來對酵母菌進行分型。Jason等(2005)以ITS2區 通用引物，通過實時定量PCR用焦磷酸測序技術對231例真菌性陰道炎進行測序分析，在測 序的第一個循環就可以鑑定出絕大多數致病菌。Leaw等(2006)利用內轉錄間隔區通過焦 磷酸測序分析鑑定醫學重要的酵母菌屬致病真菌，通過兩組不同特異性引物成功擴增ITSl 和ITS2區，經測序成功鑑定標準菌株和醫學致病菌到種的水平，該研究還發現ITS1區比 ITS2區在種內鑑定水平上更具有特異性，因此，該方法還能將將具有高度保守的近平滑念 珠菌I-III群區分開來。Bobby等(2007)通過焦磷酸測序技術應用rDNA ITS2區段基因檢 測假絲酵母致病菌，結果與生化和形態學檢測比較，顯示了 100% —致性。Andrew等(2008) 同樣利用焦磷酸測序技術快速鑑定出非常見治病真菌，並且能鑑定出引起混合型感染的真 菌。Kang等(2009)根據ITS核苷酸序列區域特異性鹼基的不同，將新生隱球菌3個變種進 一步分為8個基因型。本研究通過設計軟體對常見臨床真菌測序引物隨後40bp的序列進行了排列組 合，產生了多重不同真菌感染的焦磷酸測序虛擬模式資料庫，臨床樣品經DNA抽提、通用引 物擴增，然後用通用引物作為測序引物，測序結果與焦磷酸測序虛擬模式資料庫比對判斷 型別。該方法能一次測序區分常見臨床真菌，可用於真菌感染的臨床診斷及耐藥監測。採用 的空白對照可以在型別判斷中有效扣除可能發生的汙染，解決了高的靈敏度必然帶來難以 控制的汙染難題。快速可靠鑑定痰、尿液、分泌物等臨床樣本中真菌種屬的重要意義在於 1)合理應用抗生素，避免無效用藥；2)改善預後；3)減緩獲得耐藥；4)減少醫療費用5)高 度的特異性和敏感性，6)大大縮短了檢出時間。不合適抗生素應用常常導致治療失敗，而 使住院期延長，併發症，耐藥以及檢驗費用增加等後果。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速可靠的真菌快速檢測試劑盒。本發明還要解決的技術問題是提供上述試劑盒的檢測方法。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下一種真菌快速檢測試劑盒，它包括(1)擴增真菌18S，5. 8S內轉錄間隔區ITSI的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO 2所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO :1在其5，端標記生物素；在一次檢測中共同使用。上述真菌快速檢測試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取試劑Buffer I, Buffer II, Buffer III ；Buffer TE;其中，BufferI 為 9g/LNaCl 水溶液；其中，BufferII 為 10g/L SDS，2 % (v/v)Triton Χ-100，100mmol/L NaCl, IOmmolTris-HCl (ρΗ 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；其中，BufferIII 為飽和 NaCl 水溶液(約 6mol/L)；其中，BufferTE 為 10mmol/L Tris-HCl (ρΗ 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；(2)反應液PCR Buffer，通用引物SEQ ID NO :1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ L Taq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為0· 1 % (ν/ν) ΝΡ-40，0· 02 % (ν/ν)明膠，0. 06 % g/mL BSA,0. 1% (v/v)Tween-20,0. 06M pH8. 9 Tricine0(3)單鏈純化試劑75% (v/v)乙醇溶液，0· 2M NaOH，IOmM ρΗ 7.6 Tris-Acetate 溶液，結合緩衝液，退火緩衝液；其中，結合緩衝液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl, ImM EDTA,0. 1 % (v/v) Tween-20 ；退火緩衝液具體為20mM ρΗ 7.6 Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，螢光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。一種真菌快速檢測試劑盒，它包括上述的所有核苷酸序列的鹼基互補序列，也就 是包括(1)擴增真菌18S，5.8S之間內轉錄間隔區ITSl的通用引物其核苷酸序列如 SEQID NO 4和SEQ ID NO 5所示引物對；由上海英俊生物科技有限公司合成。(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO :6所示；由上海英俊生物科技有限公司 合成。(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ ID NO 4在其5』端標記生物素；由上海英俊生物科技有限公司合成。在一次檢測中共同使用。上述真菌快速檢測試劑盒，具體包括如下試劑(I)DNA 提取試劑Buffer !,Buffer II, Buffer III ；Buffer TE;
其中，BufferI 為 9g/LNaCl 水溶液；其中，BufferII 為 10g/L SDS, 2 % (v/v) Triton X-100，100mmol/L NaCl, IOmmolTris-HCl (pH 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；其中，BufferIII 為飽和 NaCl 水溶液(約 6mol/L)；其中，BufferTE 為 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；(2)反應液PCR Buffer，通用引物 SEQ ID NO :3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs，2U/ μ L Taq DNA聚合酶；其中，PCRBuffer 具體為0. 1% (ν/ν)NP-40,0. 02% (ν/ν)明膠，0· 06% (w/v) g/ mL BSA,0. 1% (v/v)Tween-20,0. 06Μ ρΗ8· 9 Tricine0(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液，0· 2 MNaOH，IOmM pH 7.6 Tris-Acetate 溶液，結合緩衝液，退火緩衝液；其中，結合緩衝液具體為10mMTris_HCl，2M NaCl，ImM EDTA，0. 1 % (v/v) Tween-20 ；退火緩衝液具體為20mM pH 7.6 Tris-Acetate，2mM 醋酸鎂。(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物 APS，螢光素和 dNTP(dNTP 即 dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)。本發明所檢測的真菌為狹義的真菌菌，包括念珠菌屬、隱球菌屬、球孢子菌屬、組 織胞漿菌屬、芽生菌屬、麴黴菌屬、毛黴菌屬、根黴菌屬。上述真菌快速檢測試劑盒的檢測方法包括如下步驟(1)提取臨床樣本中真菌DNA ；(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用通用引物進行真菌18S，5. 8S的內轉錄間隔 區ITSl的PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產物進行焦磷酸測序；(5)測序結果與資料庫比對判斷真菌種屬。步驟(2)中，所述的PCR擴增體系為10 X PCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO :10· 3μ L， SEQ ID NO :20. 3 μ L, Template DNA 2μ L,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA聚合酶2U，加無 菌水至 50μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ;40 個循環，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。或者將SEQ ID NO :4替換上述SEQ ID NO :1，同時將SEQID NO :54替換上述SEQ ID NO :2，其它PCR擴增體系和條件相同。有益效果本發明的試劑盒利用焦磷酸測序技術測定的ITSl反向區段的序列和 資料庫比對判斷真菌種屬。應用此試劑盒能一次測序鑑定臨床樣本真菌種屬。可用於臨床 診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強的 優點。本發明方法可以使臨床樣本真菌種屬鑑定時間大大縮短(本發明方法檢測時間約 4 5小時)，另外，通過序列比對鑑定真菌是菌種鑑定的終極方法，特別是對一些難鑑定 菌，序列比對鑑定更具優勢。


圖1為1例陰性標本檢測結果圖，測序結果為陰性。圖2為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果為GAAAGTTTTG
7ACTATTTAGTAATAATCTGG TG,與資料庫比對判定為白假絲酵母菌。圖3為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果為GAAAGTTTT GAAGTTGTTTTCATAT CATAAAAAGAAATTCGTTTGG，與資料庫比對判定為光滑假絲酵母。圖4為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果GAAAGTTTTGACTATTGTAATAATAAAT CAAGTTTG，與資料庫比對判定為熱帶假絲酵母。圖5為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果為GAAAGTTTT ATTATTGTTATAATAAGATT ACATTC,與資料庫比對判定為新型隱球菌。圖6為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果為GAAAGTTTTGATTTAGTTTGTTAGAA TAAAATTTATTTTG，與資料庫比對判定為葡萄牙假絲酵母。圖7為1例真菌感染標本檢測結果圖，測序結果為 GAAGTTTTGACTATTAGTTAATCAAGTTGAC,與資料庫比對判定為近平滑假絲酵母。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 試劑盒的製備方法。(I)DNA 提取試劑Buffer I 為 9g/L NaCl 水溶液；Buffer II 為 10g/L SDS,2 % (v/v)Triton X-100，100mmol/L NaCl,IOmmol Tris-HCl (pH 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；Buffer III 為飽和 NaCl 水溶液(約 6mol/L)；Buffer TE 為 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)，lmmol/L EDTA，溶劑為水；其中NaCl (購於上海試四赫維化工有限公司)，SDS (購於美國Sigma公司)， EDTA(購於杭州化學試劑有限公司)，Tris-HCl (Tris-base購於美國Sigma公司，鹽酸購於 杭州化學試劑有限公司)，Triton X-100 (購於美國Sigma公司)(2)反應液PCRBuffer 0. 1% (ν/ν) NP-40 (購於美國 Sigma 公司),0. 02% (ν/ν)明膠(購於 美國 Sigma 公司)，0.06% g/mL BSA (購於美國 Sigma 公司)，0. 1 % (v/v) Tween-20 (購於 美國 Sigma 公司)，0. 06M pH8. 9Tricine (購於德國 Merck 公司)，通用引物SEQ ID NO :1 2或SEQ ID NO 4 5，由上海英俊生物科技有限公司 合成。MgCl2 購於美國Sigma公司，0. 2mM dNTPs 購於上海鼎國生物技術有限公司，2U/y L Taq DNA 聚合酶購自美國 Fermentas 公司。(3)單鏈純化試劑75% (ν/ν)乙醇溶液購於杭州長徵化學試劑有限公司，0. 2Μ NaOH:購於上海試四赫維化工有限公司，IOmM Tris-Acetate (pH 7.6) :Tris_base 購於美國 Sigma 公司，無水乙酸購於杭 州化學試劑有限公司，
結合緩衝液由IOmM Tris-HCl (Tris-base購於美國Sigma公司，鹽酸購於杭州化 學試劑有限公司)，2M NaCl (購於上海試四赫維化工有限公司)，ImM EDTA(購於杭州化學 試劑有限公司)，0. (v/v) Tween 20 (購於美國Sigma公司)組成，退火緩衝液由20mM Tris-Acetate (pH 7. 6) (Tris-base 購於美國 Sigma 公司，無水 乙酸購於杭州化學試劑有限公司)，2mM醋酸鎂(購於上海試四赫維化工有限公司)組成。親和素標記的磁珠(購於 GE healthcare Bioscience AB)。(4)測序試劑DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶購於QIAGEN公司，底物APS和螢光素購於QIAGEN公司，四種 dNTP (dATP S, dTTP, dCTP, dGTP)購於 QIAGEN 公司。測序引物SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :6，由上海英俊生物科技有限公司合成。實施例2 檢測方法。儀器Bio-RadS1000 PCR儀，Beckman Microfuge 22R 臺式微量冷凍離心機，北京 六一瓊脂糖凝膠電泳儀、上海培清凝膠成像系統，QIAGEN PyroMark Q96ID測序儀。(1)提取真菌DNA，以臨床尿液樣本為例，具體包括如下步驟(Ia)取臨床尿液樣本2ml於離心管中，12000rpm高速離心IOmin ；(Ib)棄上清，加入800ul BufferI，漩渦震蕩30秒；(Ic) 12000rpm 高速離心 5min ；(Id)棄上清，儘量倒置吸乾，加入300ul Buffer II，高速振蕩器震蕩IOmin ；(Ie)將離心管內加入300ul Buffer III，漩渦震蕩30s ；(If) 4000rpm 離心 15min ；(Ig)將(If)所得上清液，置於另一乾淨離心管中，加入2倍體積無水乙醇，上下輕 輕翻轉混勻，靜置2min ；(Ih) 12000rpm 離心 IOmin ；(Ii)棄上清，將沉澱烘乾，加IOOul TE 65°C孵育30min，作為PCR模板。(2)以步驟⑴所得DNA為模板，利用通用引物進行真菌18S，5. 8S內轉錄間隔區 ITSl的PCR擴增；其中，所述的PCR 擴增體系為10XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ IDNO :20. 3 μ L, Template DNA 2μ 1,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水 至 50 μ L ；PCR擴增條件為:94°C 5min ；40 個循環(94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s) ；72°C 5min。(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化 在使用前，保證所有溶液都達到室溫； 在 PSQ 96 板中加入 45μ1 annealing buffer，然後每孔加入 SEQ ID NO :2 測 序引物(IOuM)O. 5uL ； 使用Vertex混勻S印harose beads，將需要使用的s印haroe beads總量(每樣 本 3yL)轉移至Ij 一個 Eppendorf■管中，在 s印harose bead 中力口入 47ulbinding buffer，使 得平均每個樣品約有50 μ L的體積，將混合物混勻； 將以上混合物加入PCR產物(50 μ L反應體積)中，每樣本50 μ L，將PCR產物常 溫下震蕩混勻10分鐘，使得beads與生物素結合；
在Vacuum prep workstation中，四個樣品板中依次加入180mL高純水、70%乙 酉享、washing buffer 禾口 120ml Denaturation buffer ；^iTJFvacuum prep workstation 的慄，vacuum prep tool 在高純水中i青洗 30
vacuum prep tool PCR , MM sepharose beads, vacuum prep tool 放入70%乙醇中5秒,然後移到denatureation buffer中5秒，再移到washing buffer中 清洗10秒，把吸頭放在相應含有測序引物的板孔的上方，不要接觸液面，關掉泵，將vacuum prep tool放入含有測序引物的板中，搖動，釋放s印harose beads ； 使用高純水清洗vacuum pap tool。將放有樣品的PSQ 96板放在ThermoPlate上加熱到85°C 2分鐘，再冷卻到室溫後 放入測序儀中。(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產物進行焦磷酸測序；(5)測序結果與美國國家生物信息技術中心(NCBI)資料庫比對判斷真菌種屬。將本發明方法用於7例臨床培養陽性標本的鑑定，測序圖如圖2-7所示，其中圖1 為1例陰性表表鑑定結果。本發明方法鑑定結果與經微生物培養、致病菌分純後用法國生 物梅裡埃的微生物鑑定系統做比對，結果一致。
權利要求
一種真菌快速檢測試劑盒，其特徵在於它包括(1)擴增真菌的內轉錄間隔區ITS1的通用引物其核苷酸序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示引物對；(2)測序引物其核苷酸序列如SEQ ID NO3所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ IDNO1在其5』端標記生物素；在一次檢測中共同使用。
2.根據權利要求1所述的真菌快速檢測試劑盒，其特徵在於它包括如下試劑(1)DNA提取試劑Buffer I, Buffer II, Buffer III ；Buffer TE;(2)反應液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:1 2，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs,2U/y L Taq DNA聚合酶；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0. 2MNa0H，IOmM pH 7.6 Tris-Acetate溶液， 結合緩衝液，退火緩衝液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
3.一種真菌快速檢測試劑盒，其特徵在於它包括(1)擴增真菌的內轉錄間隔區ITSl的通用引物其核苷酸序列如SEQID NO :4和SEQ ID NO :5所示引物對;(2)測序引物其核苷酸序列如SEQID NO 6所示；(3)親和素標記的磁珠；其中，SEQ IDNO 4在其5，端標記生物素；在一次檢測中共同使用。
4.根據權利要求3所述的真菌快速檢測試劑盒，其特徵在於它包括如下試劑(1)DNA提取試劑Buffer I, Buffer II, Buffer III ；Buffer TE;(2)反應液PCRBuffer，通用引物 SEQ ID N0:3 4，2mM MgCl2,0. 2mM dNTPs,2U/y L Taq DNA聚合酶；(3)單鏈純化試劑75%(ν/ν)乙醇溶液，0· 2MNa0H，IOmM pH 7. 6Tris_Acetate 溶液， 結合緩衝液，退火緩衝液；(4)測序試劑DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，螢光素酶，三磷酸腺苷雙磷酸酶，底物APS，熒 光素和dNTP。
5.一種真菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於它包括如下步驟(1)提取臨床樣本中真菌DNA;(2)以步驟(1)所得DNA為模板，利用通用引物進行真菌18S，5.8S的內轉錄間隔區 ITSl的PCR擴增；(3)將步驟(2)得到的PCR擴增產物與親和素標記的磁珠結合進行單鏈純化；(4)將步驟(3)得到的單鏈純化產物進行焦磷酸測序；(5)測序結果與資料庫比對判斷真菌種屬。
6.根據權利要求5所述的真菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於步驟(2)中所 述的 PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 10. 3 μ L，SEQ ID NO 20. 3μ L,Template DNA 2μ L,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ;40 個循環，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。
7.根據權利要求5所述的真菌快速檢測試劑盒的檢測方法，其特徵在於步驟(2)中所 述的 PCR 擴增體系為10 XPCR buffer 5 μ L, SEQ ID NO 40. 3μ L, SEQ ID NO 50. 3μ L, Template DNA 2μ L,0. 2mM dNTPs,2mM MgCl2, Taq DNA 聚合酶 2U，加無菌水至 50 μ L ;PCR 擴增條件為94°C 5min ;40 個循環，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ；72°C 5min。
全文摘要
本發明涉及臨床微生物鑑定領域，提供了一種真菌快速檢測試劑盒及其檢測方法。該試劑盒包括2條通用引物擴增真菌18S，5.8S的內轉錄間隔區ITS1，1條測序引物測定內轉錄間隔區ITS1反向區段的序列，親和素標記的磁珠，測序結果與資料庫比對判斷種屬。應用此試劑盒能通過一次測序區分臨床樣本中的真菌，可用於臨床診斷。不僅為臨床診療贏得了寶貴的搶救時間，而且具有成本低廉，操作方便，特異性強的優點。
文檔編號C12Q1/04GK101974640SQ20101054711
公開日2011年2月16日 申請日期2010年11月16日 優先權日2010年11月16日
發明者任緒義, 張玉娥, 虞閏六 申請人:杭州迪安醫學檢驗中心有限公司