一種水溶性的金納米簇螢光材料、製備方法及應用與流程

2023-10-28 15:32:50 1

本發明屬於金納米簇螢光材料合成技術領域，具體涉及一種水溶性的金納米簇螢光材料、製備方法及應用。

背景技術：

藥物運輸與生物成像作為一種先進的現代技術，在生命科學領域中有著對分析生物樣本以及疾病治療的手段，它提供了可視化信息小區狀況和疾病的分析，一直是人們致力於研究的內容。目前在細胞成像方面運用最多的是無機量子點、稀土材料、有機螢光小分子、聚合物分子以及螢光蛋白(gfp)標記法等，但是兩者都存在自身的弱點，例如量子點的毒性以及螢光蛋白自身的光漂白性等，使得其用於更廣泛的領域有一定的局限性。

自組裝是一種普遍存在的組裝構築基團之間的有序排列的行為，自組裝蛋白材料是一種近幾年興起的綠色生物納米組裝，通過人為的設計與控制組裝基元可以得到許多不同類型的蛋白自組裝材料。作為量子點以及有機螢光小分子的替代品，貴金屬(金、銀)納米粒子以及納米簇以其獨特的光學性質而受到關注，尤其是超小型的金銀納米簇已經被用於生物成像和對於某些目標分子在分析調查檢測螢光標記的傳感器。

鑑於現有傳統合成方法合成工藝複雜以及合成材料發光波長單一問題，應用受到限制，因此，有必要開發一種運用蛋白質、胺基酸、金雜化自組裝、且低細胞毒性的納米材料，並將其生物成像的領域。

技術實現要素：

本發明提供的一種水溶性的金納米簇螢光材料、製備方法及應用，解決了傳統合成方法合成工藝複雜以及合成材料發光波長單一等問題。

本發明提供了一種水溶性的金納米簇螢光材料的製備方法，包括以下步驟：

步驟1，將胺基酸、牛血清蛋白、氯金酸和雙蒸水混合均勻，得到原料混合液，並使原料混合液中胺基酸的濃度為100mmol/l、牛血清蛋白的濃度為5mg/ml、氯金酸的濃度為1.6mg/ml；

所述胺基酸為甘氨酸或者組氨酸；

步驟2，調節原料混合液的ph，然後於37℃震蕩反應10-14h，得到熱處理混合物；

步驟3，將熱處理混合物置於10kda截留分子量的透析袋中，用超純水透析4-8h，收集透析袋內的透析液，即為水溶性的金納米簇螢光材料。

優選的，上述水溶性的金納米簇螢光材料的製備方法中，步驟2中調節原料混合液的ph至1.5時，步驟3相應的得到水溶性的綠色螢光金納米簇螢光材料；

步驟2中調節原料混合液的ph至5.5時，步驟3相應的得到水溶性的藍色螢光金納米簇螢光材料；

步驟2中調節原料混合液的ph至7.5時，步驟3相應的得到水溶性的黃色螢光金納米簇螢光材料；

步驟2中調節原料混合液的ph至12.5時，步驟3相應的得到水溶性的紅色螢光金納米簇螢光材料。

優選的，上述水溶性的金納米簇螢光材料的製備方法中，調節原料混合物的ph時採用的是1mol/l的氫氧化鈉溶液或者1mol/l的鹽酸溶液。

本發明還提供了由上述任一種製備方法製備而成的水溶性的金納米簇螢光材料。

本發明還提供了上述水溶性的金納米簇螢光材料在生物成像中的應用。

本發明還提供了上述水溶性的金納米簇螢光材料在多色細胞成像、細胞標記或者細胞定位中的應用。

本發明還提供了上述水溶性的金納米簇螢光材料作為藥物遞送載體的應用。

與現有技術相比，本發明的水溶性的金納米簇螢光材料具有以下有益效果：

1、設計了一個蛋白組裝與原位合成金納米簇同時進行的組裝雜化材料，運用蛋白質、胺基酸、金雜化自組裝，該材料使用金納米簇、牛血清白蛋白和胺基酸作為構建模塊自組裝形成的，通過對形貌的觀測發現其同時具有有機生物籠子的潛質。同時該材料具有高度生物相容性、低的細胞毒性，並且可以容易地內化進入不同類型的細胞。

2、在組裝該材料的過程中，由於ph變化以及金的存在導致了自由基的產生，引發了自由基的聚合反應組裝，並且在組裝過程中首先形成環狀結構，最後形成類似核殼狀的組裝體。

3、本發明所述的金納米簇螢光材料是在有蛋白質與胺基酸摻雜的前提下合成的，與其它的金納米簇螢光材料相比具有合成相對簡單、環境友好型汙染小，且材料可以發出至少四種顏色的光，能夠用於細胞成像等領域，由於本發明的螢光探針具有多種發光顏色，因此還能夠用於多色細胞成像、細胞標記和細胞定位等，同時該材料具有有機生物籠子的潛質，作為藥物遞送的載體。

附圖說明

圖1為金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；

其中，1a為藍色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1b為綠色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1c為黃色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1d為紅色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；

圖2為製備金納米簇螢光材料過程中，不同震蕩反應時間下藍色螢光金納米簇螢光材料的形貌圖；

其中，圖2a-2i分別代表反應時間為0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h時藍色螢光金納米簇螢光材料的形貌圖；

圖3為製備藍色螢光金納米簇螢光材料過程中，震蕩反應2h、12h時的電子自旋共振譜儀檢測結果圖；

圖4不同顏色螢光金納米簇螢光材料的光漂白實驗結果圖；

圖中，橫坐標1為羅丹明6g材料，橫坐標2為bsa-auncs金簇材料，橫坐標3為藍色螢光金納米簇螢光材料，橫坐標4為綠色螢光金納米簇螢光材料，橫坐標5為黃色螢光金納米簇螢光材料，6為紅色螢光金納米簇螢光材料；

圖5不同顏色螢光金納米簇螢光材料的毒性試驗結果圖；

圖6不同顏色螢光金納米簇螢光材料的細胞成像標記結果圖；

其中，圖6a、6e、6i、6m分別是藍色、綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的螢光影像，圖6b、6f、6j、6n分別是藍色、綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的經溶菌酶染料標記後的細胞螢光影像，圖6c、6g、6k、6o分別是藍色、綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後在明場下的細胞螢光影像；圖6d是圖6a和圖6b的疊加效果，圖6h是圖6e和圖6f的疊加效果，圖6l是圖6i和圖6j的疊加效果，圖6p是圖6m和圖6n的疊加效果。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明，但不應理解為本發明的限制。下列實施例中未註明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件操作，由於不涉及發明點，故不對其步驟進行詳細描述。

當實施例給出數值範圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值範圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本技術領域的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。

本發明提供的一種水溶性的金納米簇螢光材料，包括以下實施例：

實施例1

一種水溶性的金納米簇螢光材料，具體按照以下步驟製備：

步驟1，將甘氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和雙蒸水混合均勻，得到原料混合液，並使原料混合液中甘氨酸的濃度為100mmol/l、牛血清蛋白的濃度為5mg/ml、氯金酸的濃度為1.6mg/ml；

步驟2，用1mol/l的鹽酸溶液調節原料混合液的ph至1.5，然後於37℃震蕩反應12h，得到熱處理混合物；

步驟3，將熱處理混合物置於10kda截留分子量的透析袋中，用超純水透析4h，以除去未反應的小分子，收集透析袋內的透析液，即為水溶性的綠色螢光金納米簇螢光材料。

實施例2

一種水溶性的金納米簇螢光材料，具體按照以下步驟製備：

步驟1，將組氨酸、牛血清蛋白、氯金酸和雙蒸水混合均勻，得到原料混合液，並使原料混合液中組氨酸的濃度為100mmol/l、牛血清蛋白的濃度為5mg/ml、氯金酸的濃度為1.6mg/ml；

步驟2，調節原料混合液的ph至5.5，然後於37℃震蕩反應10h，得到熱處理混合物；

步驟3，將熱處理混合物置於10kda截留分子量的透析袋中，用超純水透析8h，以除去未反應的小分子，收集透析袋內的透析液，即為水溶性的藍色螢光金納米簇螢光材料。

實施例3

一種水溶性的金納米簇螢光材料，具體按照以下步驟製備：

步驟1，將1mmol的甘氨酸、50mg的牛血清蛋白、16mg的氯金酸混合，然後用雙蒸水定容至10ml，混合均勻，得到原料混合液，最終原料混合液中甘氨酸的濃度為100mmol/l、牛血清蛋白的濃度為5mg/ml、氯金酸的濃度為1.6mg/ml；

步驟2，調節原料混合液的ph至7.5，然後於37℃震蕩反應14h，得到熱處理混合物；

步驟3，將熱處理混合物置於10kda截留分子量的透析袋中，用超純水透析6h，以除去未反應的小分子，收集透析袋內的透析液，即為水溶性的黃色螢光金納米簇螢光材料。

實施例4

一種水溶性的金納米簇螢光材料，具體按照以下步驟製備：

步驟1，將10mmol的甘氨酸、500mg的牛血清蛋白、160mg的氯金酸混合，然後用雙蒸水定容至100ml，混合均勻，得到原料混合液，最終原料混合液中甘氨酸的濃度為100mmol/l、牛血清蛋白的濃度為5mg/ml、氯金酸的濃度為1.6mg/ml；

步驟2，調節原料混合液的ph至12.5，然後於37℃震蕩反應14h，得到熱處理混合物；

步驟3，將熱處理混合物置於10kda截留分子量的透析袋中，用超純水透析6h，以除去未反應的小分子，收集透析袋內的透析液，即為水溶性的紅色螢光金納米簇螢光材料。

需要說明的是，上述水溶性的金納米簇螢光材料的製備方法實施例中，調節原料混合物的ph時採用的是1mol/l的氫氧化鈉溶液或者1mol/l的鹽酸溶液。

需要說明的是，上述本發明的製備方法及實施例1-4中，製備的水溶性的綠色螢光金納米簇螢光材料、水溶性的藍色螢光金納米簇螢光材料、水溶性的黃色螢光金納米簇螢光材料、水溶性的紅色螢光金納米簇螢光材料，可以直接將液體於4℃保存半年，或者凍幹成粉末後-20℃長期保存。

下面，我們對水溶性的金納米簇螢光材料為例進行一系列的表徵與應用。

一、整體形貌

我們利用掃描電鏡對製備而成的金納米簇螢光材料的整體形貌進行觀察，結果如圖1所示，所述金納米簇螢光材料具有四種顏色，1a為藍色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1b為綠色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1c為黃色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；1d為紅色螢光金納米簇螢光材料在掃描電鏡下的整體形貌圖；每種顏色金納米簇螢光材料的顆粒大小和形狀均較均勻且清晰可辨。

二、形貌特徵與振蕩反應時間之間的關係

為了探索金納米簇螢光材料的形貌特徵與振蕩反應時間之間的關係，我們利用掃描電鏡分別觀察了反應時間為0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h時藍色螢光金納米簇螢光材料的形貌圖，結果如圖2所示，其中，圖2a-2i分別代表反應時間為0min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h時藍色螢光金納米簇螢光材料的形貌圖，材料首先聚集成球殼結構，隨著時間的推移，殼球變小，最終形成球狀結構。

三、反應類型

為了鑑定金納米簇螢光材料製備過程中的反應類型，我們以藍色螢光金納米簇螢光材料為例，利用電子自旋共振譜儀檢測了震蕩反應2h、12h時的自由基的變遷過程，結果如圖3所示，根據epr數據處理公式g的計算方法：g＝hμ/hβ，可以得到反應兩小時的時候g＝2.07，反應12小時的時候g＝2.11，再結合圖3的結果，可以確定金納米簇螢光材料的生成是一個高分子自由基聚合式反應。

四、光漂白實驗

為了檢測金納米簇螢光材料的抗光漂白特性，我們進行了光漂白實驗，具體操作步驟如下：

分別製備羅丹明6g材料(對圖4中應橫坐標1，作為對照)、bsa-auncs金簇材料(對圖4中應橫坐標2，作為對照)、藍色螢光金納米簇螢光材料(對應圖4中橫坐標3)、綠色螢光金納米簇螢光材料(對應圖4中橫坐標4)、黃色螢光金納米簇螢光材料(對應圖4中橫坐標5)、紅色螢光金納米簇螢光材料(對應圖4中橫坐標6)的水溶液，需要說明的是，本發明的金納米簇螢光材料均為水溶性材料，其中羅丹明6g材料的濃度為1μmol/l，本發明的金納米簇螢光材料均為水溶性材料，以金的濃度計算溶液的濃度均為50μmol/l。

將上述樣品的水溶液沉積在石英載玻片上並照射5min(λex＝355nm；3.5mw)。將照射前後的螢光強度標準化以進行比較，記錄螢光強度值，結果參圖4，通過對比可以看出，橫坐標3-6的螢光強度值較高，即藍色螢光、綠色螢光、黃色螢光和紅色螢光的金納米簇螢光材料抗光漂白性比較強。

五、細胞毒性檢測

金納米簇螢光材料的細胞毒性是利用大腸桿菌的生長曲線來進行評估的。具體的操作過程是：

s1、將大腸桿菌dh5α菌落接種到lb培養基中，在37℃(150rpm)的恆溫振蕩器中溫育過夜(12小時)，直到大腸桿菌的od600達到約3.5。

s2、通過離心收穫細菌，並使用pbs緩衝液洗滌3次，並用新鮮lb培養基重懸至od600＝0.3，得到重懸細胞。

s3、將上述重懸細胞與0.2mm的金納米簇螢光材料混合；或者將上述重懸細胞與pbs緩衝液(pbs緩衝液與金納米簇螢光材料的體積相等)混合；上述混合後的細胞樣品在37℃、150rpm的恆溫振蕩器中進一步溫育，每隔一段時間測量od600，直到細胞達到穩定生長。其中每組實驗都平行重複三次。

分別記錄大腸桿菌的生長曲線，結果如圖5所示，圖5中blank為對照組，pghms-r對應的是實驗組紅色螢光金納米簇螢光材料，pghms-y對應的是實驗組黃色螢光金納米簇螢光材料，pghms-g對應的是實驗組綠色螢光金納米簇螢光材料，pghms-b對應的是實驗組藍色螢光金納米簇螢光材料。

實驗組與對照組的大腸桿菌生長曲線趨勢接近，區別不大，說明四種螢光顏色金納米簇螢光材料對大腸桿菌的生長曲線的影響都比較小，證明本發明的金納米簇螢光材料的細胞毒性比較小。

六、應用

為了驗證本發明的金納米簇螢光材料在細胞成像方面的應用，我們利用四種螢光顏色金納米簇螢光材料進行了細胞成像實驗，具體操作如下：

hela細胞在含有10％(v/v)胎牛血清的dmem培養基中培養，培養基中含有100u/ml的青黴素和100mg/ml的鏈黴素。將大約5×104的細胞接種到24孔板的每一個孔中，在co2濃度為5％的37℃培養箱中培養過夜。第二天，將培養基更換為200μl的含pghm(0.2mm)的dmem培養基中在37℃孵育6h後，然後與溶酶體紅色螢光探針或溶酶體綠色螢光探針孵育另外10分鐘。並用pbs緩衝液(ph7.4)洗滌兩次。通過高通量成像螢光顯微鏡(lsm710來自德國)檢測細胞形態結構。所有共聚焦螢光顯微鏡(cfm)固定的激發波長為405nm，結果圖6所示。

圖6a藍色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的螢光影像，圖6b藍色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的經溶菌酶染料標記後的細胞螢光影像，圖6c藍色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後在明場下的細胞螢光影像，圖6d是圖6a和圖6b的疊加效果；

圖6e、6i、6m分別是綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的螢光影像，圖6f、6j、6n分別是綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後的經溶菌酶染料標記後的細胞螢光影像，圖6g、6k、6o分別是綠色、黃色、紅色螢光金納米簇螢光材料進入hela細胞內後在明場下的細胞螢光影像；圖6h是圖6e和圖6f的疊加效果，圖6l是圖6i和圖6j的疊加效果，圖6p是圖6m和圖6n的疊加效果。

從圖6的結果可以看出，不同顏色螢光金納米簇螢光材料均可呈現明顯的細胞影像，細胞圖像清晰可辨，有機生物籠子的潛質，在細胞成像方面、在多色細胞成像、細胞標記或者細胞定位方面、作為藥物遞送載體的應用方面均具有良好的應用前景。

儘管已描述了本發明的優選實施例，但本領域內的技術人員一旦得知了基本創造性概念，則可對這些實施例作出另外的變更和修改。所以，所附權利要求意欲解釋為包括優選實施例以及落入本發明範圍的所有變更和修改。

顯然，本領域的技術人員可以對本發明進行各種改動和變型而不脫離本發明的精神和範圍。這樣，倘若本發明的這些修改和變型屬於本發明權利要求及其等同技術的範圍之內，則本發明也意圖包含這些改動和變型在內。