預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其製備方法

2023-10-18 06:58:09 1

專利名稱：預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於獸醫生物製品技術領域，具體涉及一種預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗 (細胞苗)及其製備方法。
背景技術：
養鴨業是我國水禽養殖業的重要組成部分，在我國的農業經濟中佔有著非常重要的地位，然而鴨病的肆虐不但制約著我國養殖業向規模化、集約化方向的邁進，而且影響著我國禽類產品的進出口等國際化多邊貿易的發展，同時會給國家和地區帶來巨大的社會、 經濟和人類生命財產損失。鴨病毒性肝炎是鴨群的常見疾病，對雛鴨有著較大的危害。鴨病毒性肝炎的防控直接影響著我國養鴨業的發展，一直以來都是我國畜牧業生產所關注的重中之重。鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis, DVH)簡稱鴨肝炎，是由鴨A型肝炎病毒 (Duck hepatitis A virus, DHAV，又稱鴨肝炎病毒)引起雛鴨的一種以肝臟呈現出血性炎症為特徵的急性烈性傳染病。本病的潛伏期為2-5d，人工感染時的潛伏期為Id。雛鴨發病時表現精神萎靡、縮頭、眼半閉呈瞌睡狀、不隨群走動、孤立於群外或行動呆滯、常蹲臥、共濟失調等，常在出現神經症狀後數小時或數天死亡。有些急性病例雛鴨沒有任何症狀，突然倒地死亡。少數病癒雛鴨生長緩慢，達不到正常的生長體重。鴨病毒性肝炎為小RNA病毒科Avih印atovirus病毒屬，無囊膜不分節段的正鏈 RNA病毒，無血凝性，對酸、熱有較強抵抗力。該病毒RNA全長77 7799，只有一個開放閱讀框，翻譯產生一個含22M個胺基酸殘基的多聚蛋白。因抗原性差異，DHAV可分為三個基因型，分別為DHAV-I，DHAV-2 (Taiwan)和DHAV-3 (Korea)，三個亞型之間無血清學交叉反應。目前鴨病毒性肝炎在世界多數養鴨國家均有發生和流行，我國許多養鴨的省市均有該病的流行。對鴨病毒性肝炎的防控中，目前採用康復鴨血清、高免鴨血清及免疫種鴨的卵黃抗體治療本病可較好地控制本病流行。另外，疫苗已研製成三種氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒苗(組織苗)、氫氧化鋁DHV雞胚化弱毒滅活苗(組織苗)及氫氧化鋁DHV雞胚化強毒滅活苗(組織苗)。從病原入手，進一步研究分子致病機理和病毒變異機理，開發相應疫苗是防控該病的關鍵。

發明內容
本發明的目的是提供一種預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其製備方法。本發明提供了鴨A型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株，是2010年10月，劉文軍、周遠成在北京市房山區某鴨場的發病鴨體內分離獲得的一株鴨病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，已於2010年12月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為 CGMCC No. 4457。鴨A型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS ^CGMCC No. 4457簡稱鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株。鴨A型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株是 2009 年 4 月，劉文軍、周遠成在山東省濰坊市鴨場的發病鴨體內分離獲得的一株鴨病毒性肝炎I型病毒(DHAV-I)，已於2010年4月21日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC No. 3746。 鴨A型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 簡稱鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株。本發明還保護鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株在製備鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)中的應用。本發明還保護鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株和鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株在製備鴨病毒性肝炎疫苗中的應用。本發明還保護將鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗 (細胞苗)。本發明還保護將鴨A型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 和鴨A型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV_SD 株 CGMCC No. 3746滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)。本發明還保護一種製備鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，得到的上清即為病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-I細胞。所述將鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收取上清，即為生產用種毒；②將生產用種毒接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細胞時MOI均可為0. 001，培養時間均可為48-72小時；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養時間優選為48小時；所述步驟 ③中，可通過5000rpm(Thermo legend RT離心機，角轉子#333 離心30_40min收集上清液。所述宿主細胞為BHK21細胞時，在所述接種前可先進行如下擴增培養(1)將凍存的BHK21細胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉澱；用細胞培養液懸浮沉澱，得到2X IO5細胞/ml的細胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養至每毫升含有1 X IO6 MM ； (2)在步驟(1)的基礎上消化細胞，然後重懸於細胞培養液中，使每毫升含有2X105 細胞，然後在如下條件下培養至每毫升含有IXlO6細胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、 37100轉/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號356907 ；攪拌杆貨號 356886)。所述細胞培養液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙抗(青黴素100U/ml，鏈黴素100U/ml)。本發明還保護一種製備鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)的方法，是將以上任一所述
4方法製備的所述病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為 0. 1%，37°C滅活M小時，得到滅活後病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、 1體積份水相和(質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01% (質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的製備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的製備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活後的病毒液混勻。本發明還保護另一種製備鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)的方法，包括如下步驟(1)將上述方法製備的鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到活性成分甲；(2)將鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到活性成分乙；(3)將活性成分甲和活性成分乙混合，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述滅活的方法具體如下在所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為 0. 1%，37°C滅活M小時，得到滅活後病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、 1體積份水相和(質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為0.01% (質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的製備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的製備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活後的病毒液混勻。本發明還保護另一種製備鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)的方法，包括如下步驟將上述方法製備的鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液混合後作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。所述鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株的病毒液可通過如下方法製備將鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-I細胞。所述將鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，收集上清液的方法可包括如下步驟①將鴨A型肝炎病毒1型DHAV-SD株接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收取上清，即為生產用種毒；②將生產用種毒接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收取上清，即為制苗用種毒；③將制苗用種毒接種所述宿主細胞，進行培養後通過凍融破碎細胞，收集上清液。所述步驟①、步驟②和步驟③中接種所述宿主細胞時MOI均可為0. 001，培養時間均可為48-72小時；所述步驟①、步驟②和步驟③中培養時間優選為48小時；所述步驟 ③中，可通過5000rpm(Thermo legend RT離心機，角轉子#333 離心30_40min收集上清液。所述宿主細胞為BHK21細胞時，在所述接種前可先進行如下擴增培養(1)將凍存的BHK21細胞37°C水浴融化，800rpm離心5min，取沉澱；用細胞培養液懸浮沉澱，得到2X IO5細胞/ml的細胞懸液，37°C,5% CO2靜置培養至每毫升含有1 X IO6MM ； (2)在步驟(1)的基礎上消化細胞，然後重懸於細胞培養液中，使每毫升含有2X105 細胞，然後在如下條件下培養至每毫升含有IXlO6細胞pH7.4，溶解氧飽和度為50%、 37100轉/min(Wheaton公司Micro-stir 磁力攪拌器，攪拌器貨號356907 ；攪拌杆貨號 3568860。所述細胞培養液具體可為95體積份的DMEM和5體積份的胎牛血清混合，加入雙抗(青黴素100U/ml，鏈黴素100U/ml)。所述滅活的方法具體如下在混合後的所述病毒液中加入甲醛，使甲醛的體積百分含量為0. 1%，37°C滅活M小時，得到滅活後病毒液。所述乳化的方法具體如下將3體積份油相、1體積份水相和(質量百分含量)硫柳汞水溶液混合，使硫柳汞的終濃度為 0.01% (質量百分含量)，得到鴨病毒性肝炎疫苗；所述油相的製備方法如下將94體積份白油和6體積份司本-80混合，得到混合液，每100毫升混合液中加入1. 6 1. 8克硬脂酸鋁；所述水相的製備方法如下將4體積份吐溫-80和96體積份滅活後的病毒液混勻。本發明提供的疫苗免疫雛鴨時，採用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為0. 2mL·本發明提供的疫苗免疫種鴨時，採用單次免疫的方式，推薦免疫劑量為1ml。本發明提供了一株有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株。將該毒株接種到敏感細胞上，收穫細胞液，滅活後乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗 (細胞苗)，有利於鴨病毒性肝炎的防控。本發明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發，同時簡化了生產工藝，可規模化生產並應用於臨床。


圖1為鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株PCR檢測結果；泳道1為陽性對照，2為鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株，3為Marker5000，4為陰性對照。
具體實施例方式以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的試驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複試驗，結果取平均值。實施例1、鴨肝炎病毒DHAV-FS毒株的發現和鑑定一、DHAV-FS 株的發現本發明的發明人從野外某鴨場(2010年10月，在北京市房山區的鴨場，由劉文軍、 周遠成發現)的發病鴨體內分離獲得了一株鴨病毒性肝炎3型病毒(DHAV-3)，將其命名為 DHAV-FS株，已於2010年12月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 4457。二、DHAV-FS 株的鑑定1、病毒形態DHAV-FS株的病毒粒子呈二十面體對稱，直徑約40nm。2、分子生物學鑑定提取DHAV-FS的RNA，經反轉錄後，根據GENBANK發表的DHAV全基因序列(GU250782)設計的一對特異性引物(Pl和P2)，進行RT-PCR擴增，擴增產物為250bp的目的條帶。PCR產物的電泳圖見圖1。測序結果如序列表的序列1所示。PCR擴增產物的序列與現有DHAV具有很高的同源性，但也有序列差異。結果表明DHAV-FS毒株為DHAV陽性。
上遊引物 DHV-PGRl :5，-GGAGGTGGTGCTGAAA-3，；
下遊弓丨物 DHV-PCR2 5，-CCTCAGGAACTAGTCTGGA-3，。3、血凝性DHAV-FS株對雞、兔、豬、豚鼠紅細胞均不凝集。4、對細胞的半數感染量(TCID5tl)DHAV-FS 株第 16 代的細胞毒為 107_2TCID5(1/ml、27 代的細胞毒為 107 °4TCID5(1/ml。5、對雞胚的半數感染量(EID5tl)DHAV-FS 株第 13 代的滴度為 107· 18EID5(l/0. 2mL·6、對雛鴨的致病力測定DHAV-FS 株 3 代對雛鴨的致病力測定，滴度為 104 25ID5(1/ml，103 8°LD5(1/ml。ID50 為半數感染量，LD50為半數致死量。7、穩定性將DHAV-FS株在細胞傳32代，每0. Iml病毒含量均為IO7TCID5tl以上，DHAV-FS毒株在32代以內是穩定的，可以作為疫苗生產用種毒。8、免疫原性DHAV-FS株F1 !^32均具有良好的免疫原性，利於疫苗的研究。9、特異性將DHAV-FS株稀釋至104TCID5(1/ml，與等量抗鴨肝炎病毒特異性血清混合，室溫放置1小時後，接種SPF雞胚10個，觀察120小時。在M 120小時內不引起特異性死亡， 且至少存活8個。實施例2、鴨病毒性肝炎疫苗(細胞苗)的製備一、雞胚成纖維細胞系DF-I的培養雞胚成纖維細胞系DF-I 購自北京中原公司(ATCC細胞系編號為CRL_12203)。細胞培養液9體積份的DMEM和1體積份的FBS混合，加入雙抗(青黴素100U/ ml，鏈黴素 100U/ml)。1、細胞復甦將DF-I細胞凍存管從液氮中取出，迅速在37°C水浴鍋中加溫，使細胞液融化。將凍存管在臺式離心機中SOOrpm離心5min，棄上清。將細胞沉澱在3ml培養基中吹打均勻 (6em直徑培養皿中)，放入(X)2恆溫培養箱中，37 °C、5% CO2靜置培養。2、細胞傳代使用電動吸引器，沿培養皿壁吸去廢液。PBS清洗1-2次，吸去廢液。沿培養皿壁加入胰酶，37°C消化。待到細胞形態變圓，吸去胰酶，用DMEM培養基吹打細胞，使細胞均勻懸浮於培養基中，得到細胞懸液。將細胞懸液均勻分為幾份，加入到新的培養皿中，加入新的DMEM培養基，置於37°C培養。3、細胞凍存將細胞培養液置於離心管中，SOOrpm離心5min。小心棄上清，用細胞凍存液重懸細胞。將重懸好的細胞分裝，每隻凍存管不超過1.5ml。凍存管先置於4°C、30min，然後-20°C、2h，然後-80°C過夜，然後放入液氮罐中保存。二、病毒液的製備和TCID5tl的測定1、病毒液的製備鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株接種DF-I細胞；細胞病變達80%以上時(約48 小時)，收穫細胞液，反覆凍融3次，收取上清(病毒液)。2、病毒液的TCID5tl測定(1)準備細胞取生長良好的DF-I細胞，消化後用10% FBS DMEM製備細胞懸液；調整細胞濃度為5 X IO5個/ml，然後加入96孔細胞培養板，0. Iml/孔。37°C、5 % CO2培養使其鋪滿單層。(2)準備病毒將步驟1製備的病毒液進行10倍梯度稀釋。(3)病毒液的TCID5tl測定96孔板中細胞長滿單層後，將培養液吸出，加入病毒稀釋液，每個梯度8-16孔，每孔0. lml,37°C,5% CO2培養96小時後觀察病變孔數並記錄。各個稀釋度的CPE結果見表 1。表1各個稀釋度的CPE結果
權利要求
1.鴨A型肝炎病毒3型(Duckhepatitis A virus type 3) DHAV-FS株，其保藏號為 CGMCC No. 4457。
2.鴨A型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 在製備鴨病毒性肝炎疫苗中的應用。
3.鴨A型肝炎病毒3型(Duck h印atitis A virus type 3)DHAV-FS株CGMCC No. 4457 和鴨A型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCC No. 3746 在製備鴨病毒性肝炎疫苗中的應用。
4.將鴨A型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗。
5.將鴨A型肝炎病毒3 型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS 株 CGMCCNo. 4457 和鴨A型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD ^ CGMCCNo. 3746滅活得到的鴨病毒性肝炎疫苗。
6.製備鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液的方法，包括如下步驟將鴨A型肝炎病毒 3 型(Duck hepatitis A virus type 3) DHAV-FS 株 CGMCC No. 4457 在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細胞為BHK21細胞或DF-I 細胞。
7.一種製備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，是將權利要求6所述方法製備的鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
8.一種製備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步驟(1)將權利要求6所述方法製備的鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到活性成分甲；(2)將鴨A型肝炎病毒1 型(Duck hepatitis A virus type 1)DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746的病毒液作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到活性成分乙；(3)將活性成分甲和活性成分乙混合，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
9.一種製備鴨病毒性肝炎疫苗的方法，包括如下步驟將權利要求6所述方法製備的鴨A型肝炎病毒3型DHAV-FS株病毒液和鴨A型肝炎病毒1型(Duck hepatitis Avirus type 1)DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液混合後作為制苗用病毒液依次進行滅活和乳化，得到鴨病毒性肝炎疫苗。
10.如權利要求8或9所述的方法，其特徵在於所述鴨A型肝炎病毒1型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD株CGMCC No. 3746的病毒液是通過如下方法製備的 將鴨A型肝炎病毒 1 型(Duck hepatitis A virus type 1) DHAV-SD 株 CGMCCNo. 3746 在宿主細胞中進行培養後破碎細胞，收集上清液，該上清液即為病毒液；所述宿主細胞為BHK21 細胞或DF-I細胞。
全文摘要
本發明公開了一種預防鴨病毒性肝炎的滅活疫苗及其製備方法。本發明提供了鴨A型肝炎病毒3型(Duck hepatitis A virus type 3)DHAV-FS株，CGMCC No.4457。本發明提供的毒株為具有優良免疫原性的鴨肝炎病毒強毒株。將該毒株接種到敏感細胞上，收穫細胞液，滅活後乳化，可以得到一種安全、有效、可控的鴨病毒性肝炎滅活疫苗(細胞苗)，有利於鴨病毒性肝炎的防控。本發明可以有針對性的防治鴨病毒性肝炎的感染與爆發，同時簡化了生產工藝，可規模化生產並應用於臨床。
文檔編號C12N7/00GK102174476SQ201010611929
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月29日 優先權日2010年12月29日
發明者劉文軍, 周遠成, 孫蕾, 李晶, 畢玉海 申請人:中國科學院微生物研究所