利用人參皂苷調節營養物質吸收之方法
2023-10-18 04:02:44 1
專利名稱：利用人參皂苷調節營養物質吸收之方法
技術領域：
本發明涉及一種用於調節營養物質吸收之方法，特別涉及一種利用人參皂苷調節營養物質吸收之方法。
背景技術：
對人類消化系統之研究中，發現通過在胃腸道中分解和消化食物可取得相當多種營養物質。胃腸道為消化和吸收食物之重要路徑。就吸收而言，可沿著整個腸道通過擴散或通過特殊運輸過程來吸收營養物質，例如葡萄糖、胺基酸、維生素和其它較小分子。而且多數此等營養物質可通過緊密調節機制來運輸，取代自由地移經腸道內膜進入血流或淋巴中。基於目前對於細胞生物學和生理學之理解，營養物質可利用固著在細胞膜上之特定運輸蛋白和通道來運輸。
在葡萄糖運輸之實例中，幾乎所有細胞都具有載體媒介機制(carrier-mediated mechanism)，以從血液中運輸葡萄糖。對多數細胞而言，是通過使用易化葡萄糖轉運子家族中之一或多個葡萄糖轉運子蛋白(GLUT)之易化擴散作用來進行運輸。在上述這些案例中，因為葡萄糖內向化學梯度之結果而發生淨葡萄糖運輸。少數細胞類型(例如小腸黏膜和近側腎小管之細胞)可在所謂主動運轉機制中，利用葡萄糖梯度由細胞外溶液攝取葡萄糖，因此允許在組織腔室之葡萄糖淨吸收，其中組織腔室內的葡萄糖濃度可能低於血液中葡萄糖濃度。有兩種偶合能量流動和轉運子的方法，初級主動運輸需要三磷腺苷酶(ATPase)提供能量，次級主動運輸則提供了離子流從較高濃度區流到較低濃度區的能量。
根據上述之次級主動運輸模式，鈉離子(Na+)會結合細胞間腔上之運輸蛋白而造成運輸蛋白之構形改變，可開啟葡萄糖之結合位。然後，葡萄糖和運輸蛋白結合。與鈉離子(Na+)和葡萄糖兩者結合之運輸蛋白將進一步發生構形改變，使葡萄糖和鈉離子(Na+)能進入細胞。葡萄糖之主動運輸涉及鈉離子(Na+)與葡萄糖流之直接物理偶合，而帶有衍生來自鈉離子(Na+)內向梯度之過程能量。由於運輸過程包括電荷之淨移動(具有非電解質葡萄糖之陽離子性鈉(Na+)離子)，該攝取之驅動力包括鈉離子(Na+)之化學梯度及跨膜之電位差兩者。當葡萄糖逐漸累積在細胞中，其隨後通過易化擴散，通過葡萄糖濃度梯度運出至血管。同樣地，其它營養物質可利用上述運輸機制加以吸收。
三七(Panax notoginseng)作為傳統中藥，其主要用於滋補強化脾臟功能並可增加精力和耐力。根據目前對傳統中藥的認知，人參皂苷萃取自三七或人參，可幫助腦血管擴張、增進腦血流量、降低有機體之耗氧量、增進有機體對缺氧之抗性、降低腦血管阻力、增進有機體之免疫功能、預防出血所造成的中風及提供抗血栓、凝血及動脈硬化之功能。
然而，三七參尚未用於調節營養物質吸收和運輸。而且目前尚未有論文或研究專注於使用由中藥(特別是三七或人參)純化之人參皂素(saponin)化合物來調節營養物質之吸收。
發明內容
本發明提供調節受試者體內營養物質吸收之方法，其包含投予有效量由三七(Panax notoginseng)純化之人參皂苷化合物，用於調節運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
根據本發明之具體實例，提供一種用於提高受試者體內營養物質吸收之方法，其包括投予由三七純化之有效量的人參皂苷化合物之步驟，用於促進運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
根據本發明，提供一種用於抑制受試者體內營養物質吸收之方法，其包括投予由三七純化之有效量的人參皂苷化合物之步驟，用於減緩運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
根據本發明，人參皂苷化合物該人參皂苷化合物是式A之達馬烷型(Dammarane)化合物 式A其中R1可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃木糖基之其中一個所構成；R2可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L吡喃阿拉伯糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L畉喃阿拉伯糖基之其中一個所構成；R3可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基、O-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)--L-吡喃鼠李糖之其中一個所構成；R4可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基。
根據本發明，人參皂苷化合物較佳為由下列組成之群中選出，包括
式I之人參皂苷Rb1， 式I式II之人參皂苷Rg1， 式II
式V之三七皂苷R1， 式V式VII之化合物K， 式VII
式VIII之人參皂苷F1， 式VIII式III之人參皂苷Rh1， 式III
或式IX之20(S)-原人參三醇(protopanaxatriol)。
式IX根據本發明之具體實例，營養物質包括葡萄糖、胺基酸或維生素。特定而言，該胺基酸包括精氨酸和色氨酸。該維生素包括葉酸或其它物質。
本發明之其它特色和優點將在下列說明中分別提出，且可從說明中分別顯見，或可通過本發明之實行而得知，而通過所述之要素和組合將能了解並達成本發明之特色和優點。
應了解前述之發明內容和下列實施方式僅為示例和解釋，並非為本發明之限制。
當結合所附的附圖閱讀時，將更能了解前述之發明內容以及下列實施方式。就說明本發明之目的而言，在附圖具體實例中所顯示的，其為目前較佳之說明。然而應了解，本發明並不限於所示之嚴格的排列和器具。
在圖中圖1為線形圖，顯示當Caco2單層細胞以經選擇濃度之式I之純化的人參皂苷Rb1處理時，於Sink運輸穿越基側室所測量之葡萄糖吸收速率；圖2為線形圖，顯示當Caco2單層以經選擇濃度之式II純化的人參皂苷Rg1處理時，於Sink運輸穿越基側室所測量之葡萄糖吸收速率；圖3為線形圖，顯示當Caco2單層以經選擇濃度之式II純化的人參皂苷Rg1處理時，於Sink運輸穿越基側室所測量之精氨酸吸收速率；圖4為線形圖，顯示當Caco2單層以經選擇濃度之純化的人參皂苷-式VII之K化合物處理時，於Sink運輸穿越基側室所測量之色氨酸吸收速率；及圖5為線形圖，顯示以經選擇濃度之純化的人參皂苷-式VII之K化合物處理Caco2單層之葉酸吸收速率。
具體實施例方式
為了更佳了解本發明，本文中所使用之術語將另加以詳細說明。依照藥典之定義，人參皂苷為任一不同的植物葡萄糖苷，當其與水混合或攪拌時形成皂狀泡沫，用於清潔劑、起泡劑及乳化劑。人參皂苷乃定義為萃取自人參或三七之三萜皂素(triterpenoid saponin)化合物。
本文中所使用之術語「吸收」指營養物質經由一條穿越腸上皮進入血液或淋巴液之通路攝取營養物質。
本文中使用之術語「純化」指自粗製或天然形式分離重量純度約為至少90％，較佳逹100％，之純化合物或物質之化學過程。「腸道細胞」一般指包括腸細胞、黏膜細胞以及身體負責吸收營養物質之腸上皮細胞。
本發明提供調節受試者體內營養物質吸收之方法，包括投予由三七純化之有效量的人參皂苷化合物，以用於調節運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。該方法包括投予受試者有效量之人參皂苷化合物，用以調節運輸營養物質穿越胃腸道內襯之單層腸道細胞，使得受試者體內營養物質之吸收得到調節。投予受試者之有效量的人參皂苷化合物指可在腸道細胞中維持存活率並增加或抑制運輸營養物質穿越腸道細胞之細胞膜之濃度，且較佳為0.001至5μM。由於純化自三七之人參皂苷化合物可提高或抑制運輸營養物質穿越單層腸道細胞，因此依照所投予之人參皂苷化合物，可經調節該營養物質之吸收而維持受試者體內所需之營養物質吸收量。人參皂苷化合物可調配成液劑、錠劑、藥丸、膠囊和散劑，以口服投予患有營養物質吸收問題之個體。同時，人參皂苷化合物可視情況和其它營養因子、添加物、安定劑、載劑、結著劑和填充劑混合，以製造任何需要調節營養物質吸收者之膳食補充品、飲料和食物。對於所屬技術領域的技術人員來說，人參皂苷化合物可和其它人參皂苷和黃耆皂苷組合或以雞尾酒方式投予乃顯而易見，以對營養物質吸收提供協同或累進效用。此外，亦可由其它中藥植物或草本植物來純化出純化的人參皂苷化合物，以對營養物質吸收功能提供相同之調節效用。
人參皂苷化合物可通過任何標準方法或此項技術領域中已知之方法或知識來製備。根據本發明，純化自三七之人參皂苷化合物包括人參皂苷。上述這些物質可通過所屬技術領域的技術人員已知之現有的萃取和分離方法加以純化。根據本發明，該人參皂苷化合物係式A之逹馬烷型化合物 式A其中R1可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃木糖基之其中一個所構成；R2可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L吡喃阿拉伯糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L畉喃阿拉伯糖基之其中一個所構成；R3可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基、O-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)--L-吡喃鼠李糖之其中一個所構成；R4可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基。
根據本發明之具體實例，取得人參皂苷化合物的方法包括磨碎三七之根部；利用醇萃取磨碎物而產生醇萃取物；分離並純化此三七根部之醇萃取物，而得到五種已知之人參皂苷，其包括式I之人參皂苷Rb1(以下稱為Rb1)， 式I式II之人參皂苷Rg1(以下稱為Rg1)， 式II
式III之人參皂苷Rh1(以下稱為Rh1)， 式III式IV之人參皂苷Re(以下稱為Re)， 式IV
及式V之三七皂苷R1(Notoginsenoside R1以下稱為R1)。
式V根據本發明之具體實施例，三七之醇萃取物可利用吸附性樹脂、矽膠及逆相層析法加以分離和純化。然後，人參皂苷Rb1及Rg1可進一步以柚苷酶(naringinase)水解產生代謝物，其包括式VI之人參皂苷F2(以下稱為GF2)， 式VI
式VII之化合物K(以下稱為CK)， 式VII式VIII之人參皂苷F1(以下稱為GF1)， 式VIII
及式IX之20(S)-原人參三醇(以下稱為Rga) 式IX由於純化自三七之人參皂苷化合物可提高或抑制運輸營養物質穿越腸道細胞之細胞膜，因此依照所投予之人參皂苷化合物之群組，該營養物質之吸收可經調節而維持個體內所需之營養物質吸收量。人參皂苷化合物可調配成液劑、錠劑、藥丸、膠囊和散劑，以口服投予患有營養物質吸收問題或吸收不良症候群之個體，其改變腸子吸收足夠之營養物質進入血液的能力。例如，在製備液劑之實例中，可將人參皂苷化合物之一溶於任何溶劑，較佳為溶入共溶劑以產生含任一人參皂苷化合物之液劑例如，將大約10毫克的任一人參皂苷化合物溶入1毫升的TranscutolP。同時，可視情況將人參皂苷化合物和其它營養因子、添加物、安定劑、載劑、結著劑及填充劑混合，以製造膳食補充品、飲料、食物和動物飼料。
本發明提供一種提高受試者體內營養物質吸收之方法，其包含投予由三七純化之有效量的人參皂苷化合物之步驟，用於促進運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。該營養物質包括葡萄糖、胺基酸或維生素，其中該胺基酸為精氨酸或色氨酸；該維生素包括葉酸及其它。
根據本發明之具體實例，提高葡萄糖之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸葡萄糖穿越受試者腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式I之Rb1、式VII之CK、式VIII之GF1或式IX之Rga。
根據本發明之具體實例，提高精氨酸之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸精氨酸穿越受試者之腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式I之Rb1、式II之Rg1、式VII之CK、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga。
根據本發明之具體實例，提高色氨酸之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸色氨酸穿越受試者之腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式VII之CK或式IX之Rga。
根據本發明之具體實例，提高葉酸之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸葉酸穿越受試者之腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式VII之CK或式I之Rb1。
另一方面，本發明提供一種抑制受試者體內營養物質吸收之方法，包含投予有效量由三七純化之人參皂苷化合物之步驟，以減緩運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。該營養素包括葡萄糖或維生素；其中該維生素包括葉酸及其它。
根據本發明，抑制葡萄糖之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來減緩運輸葡萄糖穿越受試者之腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式II之Rg1或式III之Rh1。
根據本發明，抑制葉酸之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來減緩運輸葉酸穿越受試者之腸道細胞；其中該人參皂苷化合物包括式II之Rg1或式III之Rh1。
根據本發明，抑制葉酸之吸收是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來減緩運輸葉酸穿越受試者之腸道細胞；其中人參皂苷化合物包括式II之Rg1或式III之Rh1。
本發明更特定地通過下列實例加以解釋。然而，應了解本發明不應以任何方式受限於上述這些實例。
實例1純化的人參皂苷對葡萄糖吸收之調節效用細胞培養為了評估純化的人參皂苷化合物對經過腸腔攝取營養物質之效用，將Caco-2細胞放置在可滲透濾膜上生長以作為實驗模型。Caco-2細胞取自人類結腸癌並在兩周後同時分化成類腸上皮細胞表現型。這些細胞形成具有發展良好之緊密連接之單層，並經詳細評估可作為活體外模型，以用於研究營養物質和藥物兩者在小腸腔內細胞間之運輸。
Caco-2細胞購自於美國菌株保存中心(American Type CultureCollection)。將上述這些細胞放置在Dulbecco氏修飾Eagle培養基(DMEM)中，其含有4.5g/L葡萄糖和25mM之Hepes，及添加10％胎牛血清、100U/mL青黴素G和10g/L鏈黴素。每兩天更換一次培養基。每個月定期檢查上述這些細胞之黴漿菌。將衍生自人類大腸癌之Caco-2細胞株用於供研究藥物在胃腸道中吸收之活體外模型系統。在半透膜上培養Caco-2細胞，以分化成高度官能化上皮細胞屏障，與小腸柱狀上皮細胞具有顯著型態及生化相似性。因此Caco-2細胞單層可用於研究多種化合物之膜運輸性質。將培養盤以磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)清洗一次，接著加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsine-EDTA)持續10分鐘，以胰蛋白酶消化細胞。使用35-μm濾網蓋(Falcon 2235)分離並過濾經胰蛋白酶消化之細胞以得到單細胞，之後再接種細胞以進行下一步實驗。
細胞存活率分析為了檢測純化的人參皂苷對於Caco-2細胞是否具有毒性，使用分別添加有1％和10％FBS之培養基來進行細胞存活率分析。將細胞以各孔具有5000個細胞之濃度接種在96孔盤中。為了消除細胞生長之邊際效應，細胞只接種在盤中間區之60孔，而在盤周圍區域之36孔只填充入100μlPBS。一旦細胞附著在盤上，以含有不同劑量(0、1、10、20和50μM)之純化的人參皂苷的培養基培養細胞。三天後，利用含有相同化合物之新鮮培養基替代培養基，並在進行細胞存活率分析前再培養2天。
利用細胞計數試劑盒-8(CCK-8，日本熊本市Dojindo實驗室)分析來判斷細胞存活率，該分析是根據具有細胞增生試劑WST-8之活細胞內的NADH之氧化還原反應，通過脫氫酶在細胞內粒線體之電子還原鏈(ETC)中還原WST-8，而得到黃色之甲臢(formazan)產物，其可溶於組織培養基。細胞內之脫氫酶活性所產生之甲臢染劑量是和活細胞的數量成正比。因此，由ELISA判讀機在波長450nm所檢測之吸光值愈高，顯示愈多數量之活細胞的存在。
在96格式盤之每個孔中加入10μl CCK-8試劑以進行CCK-8分析。然後以鋁箔紙覆蓋測定盤並再培養兩小時後，使用ELISA判讀機于波長450nm測量吸光值。
葡萄糖攝取分析將Caco-2細胞(5×104)接種在48-孔盤中並保持在培養基(含有10％FBS、1％非必需胺基酸、L-麩氨醯胺、青黴素G(100U/mL)和兩性黴素B(amphotericin B)(2.5μg/mL)之DMEM)中於37℃培養10天，使細胞分化。每兩天更換一次培養基。然後以PBS清洗細胞，之後補充含有5％FBS之培養基及顯示濃度(0.01、0.1和l μM)之純化的人參皂苷並持續48小時。以PBS對Caco-2細胞洗掉剩餘之葡萄糖並在葡萄糖緩衝液(80mM氯化鈉(NaCl)、100mM甘露醇(mannitol)、20mM三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)、pH 7.4、3mM磷酸氫二鉀(K2HPO4)、1mM氯化鈣(CaCl2)、1mg/mL胎牛血清蛋白(BSA))中放置1小時。利用含有2μCi/mL之14C-葡萄糖和未標定冷葡萄糖(unlabeled cold glucose)之0.2ml葡萄糖緩衝液來取代葡萄糖緩衝液以開始葡萄糖的攝取，得到最終葡萄糖濃度為25mM。移除葡萄糖緩衝液並在指定時間區間以PBS清洗來終止葡萄糖攝取。在0.2mL之0.2N NaOH中溶解細胞並將20μL之細胞溶離液轉置至含有過濾底盤之UniFilter盤中(Perkim-Elmer，Wellesley，MA，USA)並於37℃真空烘箱中乾燥。將UniFilter盤底密封並將25μL之計數溶液加到每個孔中。使用具有黏性之盤黏著劑以代替封蓋，且每個樣本之放射性是使用微盤液體閃爍計數器(TopCount，Packard NXT，PackardBioScience Company，Meriden，CT，USA)加以計算。計算出累積在細胞內之葡萄糖含量並除以蛋白質濃度，所得攝取速率是以每分鐘每毫克細胞蛋白質之納摩爾葡萄糖(nmol/min/mg)來表示。蛋白質濃度可利用標準二辛可寧酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白質分析來測定。加入2μCi之L-[14C]-葡萄糖以測量非特定葡萄糖的攝取，並與每個測定值中相減，而得到特定葡萄糖攝取量。
葡萄糖吸收分析就葡萄糖的分析，將0.3ml(105細胞/ml)之Caco2細胞接種於各培養室(transwell)之頂室(apical chamber)並於基側室(basolateral chamber)加入1ml的培養基(如上述)。以Costar培養室插片(No.3414，CorningIncorporated，NY，USA)將24-孔盤之各孔分離成頂室(定義為插片上方之小室)及基側室(定義為插片下方之小室)。每隔兩天更換各培養室之頂室和基側室中之培養基。為了確定培養室中形成的Caco2單層胞膜之緊密結合完整性，使用Millicell-ERS(Millipore EVOM-6；World Precision Instrument，Sarasota，FL，USA)進行穿膜電阻值(Trans-Epithelial ElectricalResistance)(TEER)分析以測量穿越培養室之頂室和基側室間單層細胞膜之TEER。當測量的TEER到達300至450Ωcm2於培養的14至21天在細胞底側具有分化的刷狀緣存在時，則表示該Caco2單層已準備好可進行葡萄糖吸收試驗。取得各實驗前、實驗中及實驗後之TEER值，以驗證所收集數據之一致性。
在葡萄糖吸收分析中，Caco2細胞單層是以含有5％FBS及不同濃度(1、0.1及0.01μM)之純化的人參皂苷之培養基預先處理2天，之後將Caco2細胞單層進一步置於葡萄糖吸收緩衝液(80mM NaCl、100mMmannitol、20mM Tris-HCl、pH 7.4、3mM K2HPO4、1mM CaCl2、1mg/mLBSA)中培養1小時。利用新鮮的葡萄糖吸收緩衝液替代基側室的培養基並以含有2μCi/mL之D-[14C]-葡萄糖(60 Ci/mmol，American RadiolabeledChemicals，ARC，St.Louis，MO，USA)和未標定的冷葡萄糖(unlabeled coldglucose)之0.2ml葡萄糖緩衝液來替代頂室的培養基以開始葡萄糖的吸收，得到最終葡萄糖濃度為25mM。每隔5或10分鐘區間由基側室連續取五個10-μL樣本。抽取樣本後將相同量之樣本緩衝液加回基側室，以維持一定的緩衝液體積。將樣本轉置於含有過濾底盤之UniFilter盤中(Perkim-Elmer，Wellesley，MA，USA)並於37℃真空烘箱中乾燥。將UniFilter盤底密封並將25μL之計數溶液加到各孔中。在封蓋之位置使用具有黏性之盤黏著劑，並使用微盤液體閃爍計數器(TopCount，PackardNXT，Packard BioScience Company，Meriden，CT，USA)加以計算每個樣本之放射性。試驗化合物對葡萄糖吸收之效用是以在相對時間(以分鐘計算)累積在基側室之葡萄糖的納摩爾數(nmol/min)所表示。計算在各圖之圖形數據從零時開始至終點之直線斜率以取得葡萄糖吸收速率。
在細胞存活率分析中，濃度為0.1至50μM之純化的人參皂苷在含有10％FBS的培養基中，對Caco2細胞不具有毒性。然而濃度為10至50μM之Rg1在含有1％FBS的培養基中，則對Caco2細胞展現了細胞毒性。因此，在後續實驗投予不會對細胞存活率及形態有反向效用之濃度範圍之純化的人參皂苷。較佳地，可投予濃度範圍為0.01至0.5μM之純化的人參皂苷。
由表1所示之葡萄糖吸收分析結果，發現純化的人參皂苷例如式I之Rb1、式VII之CK、式II之Rg1、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga對於運輸葡萄糖穿越Caco2細胞單層具有調節效用。亦即，純化的人參皂苷增進或抑制了葡萄糖運輸穿越Caco2細胞單層。葡萄糖之運輸速率經計算為曲線梯度，表示在相對時間(以分鐘計算)於培養室之基側室所測量為μM之葡萄糖總量。請參照圖1，當Caco2細胞以濃度為0.1至5μM之式I的Rb1處理，則會增加葡萄糖的運輸速率。
另一方面，如表1所示，兩種純化的人參皂苷式II之Rg1及式III之Rh1均顯示對葡萄糖吸收有抑制效用。請參照圖2，當Caco2細胞單層以濃度為0.01至1μM之式II的Rg1處理，則會明顯的抑制葡萄糖運輸。純化的人參皂苷對運輸葡萄糖穿越Caco2細胞單層之調節效用列於下表1中，其中箭頭朝上代表對葡萄糖運輸具提高效用，而箭頭朝下代表對葡萄糖運輸具抑制效用。
表1經純化的人參皂苷對葡萄糖攝取之調節效用
因此，結論是可利用投予由三七純化之人參皂苷，包括式I之Rb1、式II之Rg1、式VII之CK、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga來調節葡萄糖之吸收。
實例2純化的人參皂苷對精氨酸吸收之調節效用精氨酸吸收分析在測量精氨酸穿越Caco2細胞單層之運輸中，將培養室(transwells)之頂、基兩側以包含137mM NaCl、10mM Hepes、0.3mM磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、0.3mM K2HPO4、5.4mM氯化鉀(KCl)、2.8mM CaCl2、1mM硫酸鎂(MgSO4)、10mM葡萄糖，調整至pH值7.4之精氨酸培養緩衝液清洗。然後，將細胞層放置在培養緩衝液，在37℃預先培養1小時。頂室(apicall chamber)和基側室(basolateral chamber)中培養緩衝液之體積分別為0.2和0.9ml。在進行運輸實驗前，對兩室中之細胞更換新鮮培養基。以含有10mM L-精氨酸之溶液(其中包含0.125μCi/mL之L-[3H]-精氨酸)更換頂側之培養溶液以開始運輸實驗。在指定時間區間，從底側移除10μL-溶液樣本並使用微盤液體閃爍計數器(TopCount，Packard NXT)計算各樣本之放射性。在抽取樣本後將相同量之緩衝液加回基側室，以維持一定的緩衝液體積。並使用[3H]-甘露醇之攝取來校正穿越單層膜之分子的非特定運輸。結果是以精氨酸運輸在相對時間(以分鐘計算)穿越Caco-2細胞單層之納摩爾數(nmol/min)所表示。
由表2所示之精氨酸吸收分析結果發現純化的人參皂苷，例如式I之Rb1、式VII之CK、式II之Rg1、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga，對運輸精氨酸穿越Caco2細胞單層具有調節效用。純化的人參皂苷對Caco2細胞中精氨酸運輸之調節效用列於下表2中，其中箭頭朝上代表對精氨酸運輸具提高效用。
表2經純化的人參皂苷對精氨酸運輸之調節效用
結論是可利用投予由三七純化之人參皂苷包括式I之Rb1、式II之Rg1、式VII之CK、式III之Rh1、式VIII之GF1或式IX之Rga來調節精氨酸之吸收。
實例3純化的人參皂苷對色氨酸吸收之調節效用色氨酸吸收分析除了使用含有137mM氯化膽鹼、10mM Hepes、0.6mM磷酸二氫鉀(KH2PO4)、5.4mM KCl、2.8mM CaCl2、1mM MgSO4和10mM葡萄糖之色氨酸培養緩衝液，並使其pH值調整至7.4以外，使用類似於實例2中之實驗程序來測量色氨酸分子穿過Caco-2膜之攝取。結果是以色氨酸運輸在相對時間(以分鐘計算)穿越Caco-2細胞單層之納摩爾數(nmol/min)所表示。
由表3中所示之色氨酸吸收分析結果發現純化的人參皂苷，例如式VII之CK及式II之Rg1，對於運輸精氨酸穿越Caco2細胞單層具有調節效用。亦即，經純化的人參皂苷可增進運輸精氨酸穿越Caco2細胞單層。關於圖4，當Caco2細胞單層以濃度為0.01至0.1μM之式VII CK處理，則色氨酸運輸速率增加。如表3中所示，當Caco2細胞單層以濃度為0.001至0.1μM之式III Rg1處理，則色氨酸運輸速率增加。經純化的人參皂苷對運輸色氨酸穿越Caco2細胞單層之調節效用列於下表3中。
表3經純化的人參皂苷對色氨酸運輸之調節效用
結論是可利用投予由三七純化之人參皂苷，包括式II之Rg1或式VII之CK來調節色氨酸之吸收。
實例4純化的人參皂苷對葉酸攝取之調節效用葉酸攝取分析將Caco2細胞以類似上列實例1葡萄糖攝取分析中所描述之方法進行葉酸攝取試驗。在葉酸攝取試驗中，以含有5％FBS和濃度0.1μM之純化的人參皂苷之培養基，將Caco2細胞預處理2天，之後將細胞置於葉酸攝取緩衝液(添加有0.14g/L CaCl2、0.1g/L MgCl2和0.1g/L MgSO4，pH6.0之Hank氏平衡鹽溶液)培養1小時。然後開始吸取緩衝液，並加入0.2ml新鮮葉酸攝取緩衝液含有2μCi/mL放射性葉酸(3，5，7，9-3H-葉酸，25mCi/mmol，ARC))及冷的未標定葉酸以開始攝取，得到最終濃度5μM之葉酸。在指定時間區間移除攝取緩衝液以終止攝取。然後以冰冷的PBS清洗細胞三次並加入0.2mL之0.2N NaOH使細胞溶解，接著於65℃培養20分鐘。將20μL細胞溶解液轉移至含過濾底盤之UniFilter盤(Perkim-Elmer)並如前面實例1中所述之計數來判斷細胞內的3H-葉酸攝取。計算出葉酸在細胞內之累積量並除以蛋白質濃度，所得攝取速率是以每分鐘每毫克細胞蛋白質中之皮可摩爾(picomoles)(pmol/min/mg)所表示。蛋白質濃度是利用上述之標準二辛可寧酸(Bicinchoninic acid；BCA)蛋白質分析來測定。
請參照圖5及表4，發現以濃度0.1μM之式VII之CK或式I之Rb1處理之Caco2細胞比含有未處理Caco-2細胞之對照組展現出較高的葉酸攝取。如表4所示，以濃度0.1μM的式II之Rg1或式III之Rh1處理之Caco2細胞相反來說具有較低的葉酸攝取。純化的人參皂苷對Caco-2細胞內葉酸攝取之調節效用列於表4，其中箭頭朝上代表對葉酸攝取具提高效用，而箭頭朝下代表對葉酸攝取具抑制效用。
表4經純化的人參皂苷對葉酸攝取之調節效用
結論是可利用投予由三七純化之人參皂苷，包括式I之Rb1、式II之Rg1、式VII之CK或式III之Rh1來調節葉酸之攝取。
儘管上列實例描述了調節大腸癌細胞之營養物質吸收，但本發明應並不受限於此。只要腸道細胞和胃腸系統之細胞具有相似之營養物質運輸機制，亦可預期這些細胞能從本發明提出之人參皂苷化合物之調節效用中得到利益。而且本發明所述之人參皂苷除了在葡萄糖和葉酸吸收中扮演調節角色外，其同樣可應用於調節營養物質(包括維生素、胺基酸、荷爾蒙、生長因子及其它細胞代謝之重要元素)之吸收。再者，可相互交換施行具體實例中所描述之營養物質吸收試驗和營養物質攝取試驗，用於評定和評估本發明所純化的人參皂苷對個人營養物質吸收之調節效用。
所屬技術領域的技術人員應了解，在不悖離其廣泛的發明概念下，上述具體實例可做改變。因此應了解，本發明並不受限於本文中所揭示之特定具體實例，但希望將上述這些修正涵蓋在如權利要求定義之本發明的精神和範疇內。
權利要求
1.一種調節受試者體內營養物質吸收之方法，其特徵是包含投予有效量由三七純化之人參皂苷化合物，用於調節運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
2.根據權利要求1所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物是式A之化合物 式A其中R1可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖-(6-1)-β-D-吡喃木糖基之其中一個所構成；R2可以是至少為氫、乙醯基、吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、吡喃葡萄糖基-(6-1)-β-D-吡喃木糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L吡喃阿拉伯糖基、吡喃葡萄糖-(6-1)-α-L畉喃阿拉伯糖基之其中一個所構成；R3可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基、O-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃葡萄糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)-β-D-吡喃木糖基、O-β-D-吡喃葡萄糖-(2-1)--L-吡喃鼠李糖之其中一個所構成；R4可以是至少為氫、氫氧基、O-乙醯基。
3.根據權利要求1所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物由下列組成之群中選出，包括式I之人參皂苷Rb1， 式I式II之人參皂苷Rg1， 式II式V之人參皂苷R1， 式V式VII之人參皂苷K， 式VII式VIII之人參皂苷F1， 式VIII式III之人參皂苷Rh1， 式III及式IX之20(S)-原人參三醇。 式IX
4.根據權利要求1所述之方法，其特徵是該營養物質包括葡萄糖、胺基酸或維生素。
5.根據權利要求4所述之方法，其特徵是該胺基酸包括精氨酸或色氨酸。
6.根據權利要求5所述之方法，其特徵是該維生素包括葉酸或其它。
7.一種提高受試者體內營養物質吸收之方法，其特徵是包含投予有效量由三七參純化之人參皂苷化合物之步驟，用於促進運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
8.根據權利要求7所述之方法，其特徵是該營養物質包括葡萄糖、胺基酸或維生素。
9.根據權利要求8所述之方法，其特徵是該胺基酸包括精氨酸或色氨酸。
10.根據權利要求8所述之方法，其特徵是該營養物質為葡萄糖。
11.根據權利要求10所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸葡萄糖穿越受試者之腸道細胞以到提高該葡萄糖之吸收。
12.根據權利要求11所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式I之人參皂苷Rb1、式VII之化合物K、式VIII之人參皂苷F1或式IX之20(S)-原人參三醇。
13.根據權利要求8或9所述之方法，其特徵是該營養物質為精氨酸。
14.根據權利要求13所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸精氨酸穿越受試者之腸道細胞以提高該精氨酸之吸收。
15.根據權利要求14所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式I之人參皂苷Rb1、式II之人參皂苷Rg1、式VII之化合物K、式III之人參皂苷Rh1、式VIII之人參皂苷F1或式IX之20(S)-原人參三醇。
16.根據權利要求8或9所述之方法，其特徵是該營養物質為色氨酸。
17.根據權利要求16所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸色氨酸穿越受試者之腸道細胞以提高該色氨酸之吸收。
18.根據權利要求17所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式VII之化合物K或式II之人參皂苷Rg1。
19.根據權利要求8所述之方法，其特徵是該營養物質為葉酸。
20.根據權利要求19所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來促進運輸葉酸穿越受試者之腸道細胞以提高該葉酸之吸收。
21.根據權利要求20所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式VII之化合物K或式I之人參皂苷Rb1。
22.一種抑制受試者體內營養物質吸收之方法，其特徵是包含投予有效量由三七參純化之人參皂苷化合物之步驟，用於減緩運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
23.根據權利要求22所述之方法，其特徵是該營養物質包括葡萄糖或維生素。
24.根據權利要求23所述之方法，其特徵是該營養物質為葡萄糖。
25.根據權利要求24所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來減緩運輸葡萄糖穿越受試者之腸道細胞以抑制該葡萄糖之吸收。
26.根據權利要求25所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式II之人參皂苷Rg1或式III之人參皂苷Rh1。
27.根據權利要求23或24所述之方法，其特徵是該營養物質為葉酸。
28.根據權利要求27所述之方法，其特徵是通過投予濃度為0.001至5μM之人參皂苷化合物來減緩運輸葉酸穿越受試者之腸道細胞以抑制該葉酸之吸收。
29.根據權利要求28所述之方法，其特徵是該人參皂苷化合物包括式II之人參皂苷Rg1或式III之人參皂苷Rh1。
全文摘要
本發明提供調節受試者體內營養物質吸收之方法，其包含投予有效量由三七(Panax notoginseng)純化之人參皂苷化合物，用於調節運輸營養物質穿越受試者之腸道細胞。
文檔編號A23L1/30GK1919204SQ20061009011
公開日2007年2月28日 申請日期2006年6月23日 優先權日2005年6月23日
發明者林漢欽, 張溫良, 張自忠, 丁秀玉, 吳天賞 申請人:維京仲華(上海)生物醫藥科技有限公司