一種植物組織培養脫毒的外植體及其脫毒方法與流程
2023-10-10 20:39:44
本發明屬於植物脫毒技術領域，特別涉及植物組織培養脫毒外植體脫毒方法。
背景技術：
病毒對植物危害嚴重，病毒可導致植物樹體衰弱，果實變小並且畸形，品質變劣，產量嚴重下降，病毒病屬於難治療病害，迄今還沒有一種有效的藥物。因此，培育無病毒植物苗木已經成為防止病毒危害的主要措施。目前通常採用的培育無病毒植物苗木的方法是莖尖組織培養技術。莖尖培養可以從植物組織中脫除病毒，形成無病毒(或脫毒)植株。莖尖培養，有時也稱微莖尖培養，此處所稱的莖尖實質是指莖尖的分生區。莖尖培養是利用莖尖的分生區為分生組織，其中無病毒的原理，通過組織培養實現脫除病毒的目的。但莖尖大小對成活率和脫毒率有很大的影響，莖尖越大，分化率和成活率越大，但脫毒率越低；反之，如果莖尖越小，雖然脫毒率提高了，但分化率和成活率又大大降低，往往外植體死亡，造成組織培養脫毒失敗。
技術實現要素：
為解決傳統的莖尖培養法培育脫毒苗時，由於外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種後的外植體死亡的問題，本發明提供一種植物組織培養脫毒外植體，使得組織培養脫毒操作變得更加簡單，大大提高分化率和成活率，使得脫毒的成功率提高。
從莖的結構上看，分生區的形態學下方是伸長區，該區域為分生區和成熟區的過渡區，伸長區的組成既有成熟組織，也有分生組織。根據這一結構的特殊性，可以認為伸長區與分生區具有相似性，因為其中也含有分生組織，故也可以參與植物脫毒苗的培育。發明人將莖尖的分生區與伸長區(甚至包括少部分成熟區的組織)結合在一起，稱其為莖尖plus。在發明人的研究中發現，莖尖plus作為外植體，採取誘導胚狀體的方式可以培育出脫毒苗。採用莖尖plus作為外植體時，首先要誘導出胚性細胞，然後誘導胚狀體和莖葉分化的培養，最後進行生根培養、馴化與移栽。
本發明採用的技術方案如下：
一種植物組織培養脫毒的外植體，該外植體為植物莖尖plus，包括植物莖的分生區和伸長區。
採用上述植物組織培養脫毒的外植體脫毒方法，包括以下步驟：取植物莖尖plus作為外植體，將其滅菌處理後進行胚性細胞培養，在胚性細胞培養的基礎上，進行胚狀體誘導培養，在胚狀體誘導培養的基礎上進行莖葉分化培養，然後取無根苗進行病毒檢測，挑選病毒陰性的無根苗繼續進行增殖培養，擴大繁殖量並進行生根培養，篩選適宜的根系馴化、移栽。
進一步的，上述方法包括以下步驟：
(1)將休眠季或生長季的植物莖尖plus作為外植體用流水清洗，放入30～50wt％大蒜水溶液中滅菌20～40min；
(2)滅菌後的外植體立即接種在最適胚性細胞培養基中，經8～10周培養形成大量的胚性細胞團後，轉移到最適胚狀體誘導培養基中培養；
(3)經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，並將這些小塊置於最適莖葉分化培養基上培養；
(4)待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量後再將其轉到生根培養基中進行生根培養，
(5)待長出良好的根系後馴化、移栽。
進一步的，所述的最適胚性細胞培養基包括：1.0～3.5mg/L 6-BA，0.1～0.8mg/L NAA。
進一步的，所述的最適胚狀體誘導培養基包括：0.5～4.0mg/L 6-BA。
進一步的，所述的最適莖葉分化培養基包括：0.01～0.05mg/L 6-BA。
進一步的，所述的生根培養基包括：0.2～3.5mg/L IBA。
所述的馴化為：將長出良好的根系轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化。
進一步的，所述步驟(5)中，馴化後將根系移栽在中性土壤中。
本發明另一個目的是請求保護雙子葉植物莖尖plus在組織培養脫毒中的應用。
採用莖尖plus作為外植體，在脫除植物病毒方面具有如下優勢：
1、操作方便。傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由於所取外植體太小(一般外植體長度不超過1mm)，工作人員需要在體視顯微鏡下，才能獲取外植體。而且由於外植體太小，很難用鑷子夾住並將其接種到培養基上，導致操作速度慢，操作不便。採用莖尖plus作為外植體，由於外植體較大(分生區長度1mm左右，伸長區的長度為3～5mm，故莖尖plus的長度為4～6mm)，不存在上述操作難度大等問題，且無需體視顯微鏡也可以較為準確的切割外植體。
2、分化率和成活率很高，提高無毒苗培育率。傳統的莖尖培養培育脫毒苗，由於外植體太小，外植體分化為組培苗的難度較大，成苗率自然很低，往往導致接種後的外植體死亡，導致實驗研究失敗。採用莖尖plus作為外植體，由於外植體較大，分化率和成活率相對較高。
3、採用莖尖plus作為外植體，即使生成極少量的脫毒苗，也可以通過組培快速地繁殖起來，不影響脫毒培養。
附圖說明
圖1為蘋果主要病毒ACLSV RT-PCR產物電泳圖；
圖2為甜櫻桃主要病毒PNRSV RT-PCR產物電泳圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明的技術方案作進一步的說明，但本發明不以任何形式受限於實施例內容。實施例中所述試驗方法如無特殊說明，均為常規方法；如無特殊說明，所述試劑和生物材料，均可從商業途徑獲得。
實施例1：
選雙子葉植物「紅富士」蘋果生長期的莖尖plus作為外植體，流水衝洗後，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經8～10周培養形成大量的胚性細胞團後，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+6-BA 2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成0.3～1.0cm3小塊，並將這些小塊置於最適莖葉分化培養基(LS+BA 0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，如電泳圖圖1所示。本次檢測的病毒是蘋果主要病毒之一，即蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)。檢測結果為陰性，即圖1中沒有出現長度為358bp病毒特異性片段。然後將無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量後再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系後轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最後移栽在中性壤土中。脫毒成功率可達到3.5～5.6％。
實施例2：
選雙子葉植物「紅富士」蘋果休眠期的葉芽，流水衝洗後，剝去芽外面的鱗片，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，切取芽前端的莖尖plus作為外植體，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.4mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經8～10周培養形成大量的胚性細胞團後，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+BA2.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～6周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，並將這些小塊置於最適莖葉分化培養基(LS+BA0.02mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是ACLSV。然後將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量後再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.0mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系後轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最後移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達到3.2～4.6％。
實施例3：
選雙子葉植物「佳紅」甜櫻桃生長期的葉片莖尖plus作為外植體，流水衝洗後，放入到30％大蒜水溶液滅菌30min，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經7～8周培養形成大量的胚性細胞團後，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～5周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，並將這些小塊置於最適莖葉分化培養基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測，如圖2所示。本次檢測的病毒是甜櫻桃主要病毒之一，即李屬壞死環斑病毒(Prunus necrotic ring spot virus，PNRSV)。檢測結果為陰性(即電泳圖中沒有出現長度為449bp病毒特異性片段)然後將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量後再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系後轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最後移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達到5.3～7.1％。
實施例4：
選雙子葉植物「佳紅」甜櫻桃休眠期的葉芽，流水衝洗後，剝去芽外面的鱗片，放入到50％大蒜水溶液滅菌30min，切取芽前端的莖尖plus作為外植體，立即接種在最適胚性細胞培養基中(LS+BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L+3％蔗糖+瓊脂7g/L)上。經7～8周培養形成大量的胚性細胞團後，轉移到最適胚狀體誘導培養基(LS+BA 1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中培養，經4～5周培養形成胚狀體塊，切割胚狀體塊成小塊，並將這些小塊置於最適莖葉分化培養基(LS+BA0.05mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)上培養。待莖葉分化階段的無根苗達到較大數量時，取50～100mg葉片進行主要病毒的檢測。本次檢測的病毒是李屬壞死環斑病毒。然後將檢測結果為陰性的無根苗繼續在莖葉分化培養基上培養，到一定數量後再將其轉到適宜的生根培養基中(1/2MS+IBA1.5mg/L+3％蔗糖+7g/L瓊脂)中進行生根培養，至長出良好的根系後轉移到珍珠巖和沙土上進行馴化，最後移栽在中性壤土中，脫毒成功率可達4.8～7.6％。
試驗例
一.「紅富士」蘋果ACLSV RT-PCR檢測技術體系：
1.總RNA的提取
⑴取50～100mg葉片(包括待檢測「紅富士」蘋果繼代組培苗、陰性和陽性指示植物GF305葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩衝液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配製，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。
⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重複1～2次，直至不再出現蛋白層。
⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃靜置2h。取出後，於4℃，12000rpm，離心15min。
⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉澱，於4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉澱為純白色。
⑸室溫下乾燥後15min左右，溶於30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。
2.RT優化體系及程序：
⑴反應體系：dNTPs 125μmol/L；5×Buffer 1.0μl；RNasin 8U；MgCl21.05mmol/L；Cl-Pc 0.60μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；總RNA模板0.5μl；用DEPC水補足10μl。
⑵反應程序：37℃，1～1.5h；95℃，5min。
3.PCR優化體系及程序：
⑴反應體系：dNTPs 100μmol/L；10×Buffer(10x)2.5μl；MgCl21.5mmol/L；Cl-Pc 0.6μmol/L；Cl-Ph 0.64μmol/L；TaqE 1U；RT產物10μl；用DEPC水補足25μl。
⑵反應程序：94℃1min；52℃2min；72℃2min；循環25～30次，最後一次延伸5min。
二.「佳紅」甜櫻桃PNRSV RT-PCR檢測技術體系：
1.總RNA的提取
⑴取50～100mg葉片(包括待檢測「佳紅」甜櫻桃繼代組培苗、陰性和陽性指示植物GF305葉片)，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5mL Eppendorf管中，加入600μL RNA提取緩衝液(50mmol/L TrisCl、140mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA、1％SDS及2％PVP，用1‰DEPC水配製，pH8.0)，1μL RNasin混勻。4℃，12000rpm，離心15min。
⑵取上清，加入等體積氯仿：異戊醇(24∶1v/v)溶液，混勻，4℃，12000rpm，離心10min。重複1～2次，直至不再出現蛋白層。
⑶取水相，加2.5倍體積的無水乙醇及1/10體積3mol/L NaAc(pH5.3)，混勻。-20℃置2h。取出後，4℃，12000rpm，離心15min。
⑷棄上清，用200μL 70％無水乙醇洗沉澱，4℃，12000rpm，5min，清洗多次，至沉澱為純白色。
⑸室溫下乾燥後15min左右，溶於30μL 1‰DEPC水中，-20℃保存。
2.RT優化體系及程序：
⑴反應體系：dNTPs 125μmol/L；RT Buffer 1μl；RNasin 8U；MgCl21.13mmol/L；Nr-Pc 0.496μmol/L；Mo-MLV RTase 50U；總RNA模板0.5μl。
⑵反應程序：37℃1～1.5h；95℃5min。
3.PCR優化體系及程序：
⑴反應體系：dNTPs 100μmol/L；PCR Buffer 2.5μl；MgCl21.2mmol/L；Nr-Pc0.396μmol/L；Nr-Ph 0.456μmol/L；TaqE 1U；RT產物10μl，用DEPC水補足25μl。⑵反應程序：94℃30sec；54℃1min；72℃1min，循環25～30次，最後一輪延伸5min。
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