植物中海藻糖的產生的製作方法

2023-10-10 19:25:49 1

專利名稱：植物中海藻糖的產生的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用DNA重組技術來改變植物碳水化合物的代謝，其中所用的重組DNA，以及改變了基因組成的植物或植物部分。所說的植物可用來提取特異的碳水化合物，或換句話說，它們可加工成食品，飼料，或其成分等，在加工過程中由於所述碳水化合物的存在使上述產品具有改善的性能。
海藻糖是D-葡糖基D-葡糖苷的俗稱，它是由兩個α-，α，β-和β，β-連接的葡萄糖分子組成的雙糖。海藻糖，尤其是α-海藻糖(1-O-α-D-吡喃葡糖基)-1』-O-α-D-吡喃葡糖是廣泛存在的天然雙糖。
海藻糖的化學合成是困難的(需要保護基團)，而且效率低。目前海藻糖的天然來源是蘑菇和啤酒酵母，它們能夠積累佔乾重10％以上的海藻糖。但由於高活性的海藻糖酶所引起的海藻糖的快速代謝使得生產受到妨礙。Elkein A.D.(1974，Adv.Cavbohydrate Chem.and Biochem.30 227-256)有一篇關於雙糖海藻糖的存在和代謝的綜述，尤其是活的機體中的α，α-海藻糖。據報導在植物中，海藻糖在一些低等植物種類中存在，也存在於一些較高等植物種類中，包括種子植物藍刺頭E.persicus，苔草C.branescens；水青岡F.silvaticus。但是，這些結果始終沒有被其它作者進一步確證過。(如Kendall等，1990，Phytochemistry 29，No.8，2525-2528)。例如，Kendall等(同上)關於海藻糖在spersicus中的存在，指出其存在只在 蒿(Carum carvi)種子裡明確證實。Cegla等(1977，J.Am.Oil Chem.Soc.54，150 et seq)的一篇海藻糖存在於向日葵中的報告被Kandler等在1990年提出疑問(在The Biochemistry of Plants Vol 3.Carbohy-dratesStructure and Function；Preiss，J.，ed.，P.228，Academic Press中)。海藻糖存在於山毛櫸(Fagus Syluaticus)和捲心菜中的報告還沒有其他作者證實(Kendlall等.，1990同上，和其中的參考文獻)。
儘管海藻糖在高等植物中是很少見的，但據報導在許多被調查的植物種類中存在著海藻糖降解活性。發現穩定的高海藻糖酶活性在三種小麥品系，木波羅(Jack pine)和Selaginella lepidophylla中存在。穩定的、低海藻糖酶活性存在於苜蓿、黑墨西哥甜玉米和白雲杉中。不穩定的中等海藻糖酶活性存在於兩種不同的canola懸浮液中，但這些可能不能歸於特異的海藻糖酶活性。據報導，大麥、雀麥草、大豆和黑雲杉中根本不含有海藻糖酶活性(Kendall，1990，同上)。
據信在能產生海藻糖的機體中，海藻糖是作為6-磷酸酯被生物合成的，而它的貯存形式則是游離的糖。因此，認為在產生和/或貯存海藻糖的機體中含有磷酸酯酶，它能夠裂解海藻糖6-磷酸酯(Elbein，1974，同上)。在較高等植物中，幾乎不知道特異性的海藻糖磷酸酯的磷酸酯酶的存在。
國際專利申請書WO 93/17093 A1，於1993年9月2日公布，它描述了在酵母中轉入編碼海藻糖磷酸酯合成酶的酵母基因，產生海藻糖。它提出，利用這些酵母基因高等植物也可產生海藻糖，但沒有確切表明在植物中產生海藻糖。應注意的是WO 93/17093的公布早於本申請的申請日，但晚於本申請的優先權日。
本發明提出了一種在植物宿主中產生海藻糖的方法，這種產生是由於在所述的植物宿主中存在依次包含以下序列的植物可表達的基因(a)在所述的植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
本發明的另一具體實施方案包括由於在所述植物宿主中存在依次包含以下序列的植物可表達基因使得植物宿主產生海藻糖(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包含以下序列的植物可表達的基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少和編碼所述植物宿主中天然存在的蔗糖磷酸酯合成酶(SPS)的RNA序列部分互補，和選擇性的(c)在所述植物中起作用的轉錄終止序列。
本發明的另一實施方案包括由於在所述植物宿主中存在以下基因使得植物宿主產生海藻糖依次包含以下序列的植物可表達的基因(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包含以下序列的植物可表達的基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少和編碼所述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(c)在所提植物宿主中起作用的終止序列。
本發明的另一具體實施方案包括由於在所述植物宿主中存在以下基因使得植物宿主產生海藻糖依次包含以下序列的植物可表達的基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包含以下序列的植物可表達的基因(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少和編碼所述植物宿主中天然存在的蔗糖磷酸酯合成酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包含以下序列的植物可表達的基因(g)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(h)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少和編碼所述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(i)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
本發明還涉及在海藻糖生產方法中所使用的植物可表達的基因，還涉及植物可表達基因的組合，以及克隆質粒、轉化載體、微生物及包含本發明植物可表達基因的個體植物細胞。
本發明還提供一重組的植物DNA基因組，其中含有非天然存在的植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因。本發明還包括一重組的植物DNA基因組，其中含有非天然存在的植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因，除此之外還有能抑制SPS活性生物合成的植物可表達基因，和/或抑制AGP酶活性生物合成的植物可表達基因。
本發明還提供了獲得可產生海藻糖的植物的方法，包括以下步驟(1)向受體植物細胞中引入包含以下序列的植物可表達的基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，及包含以下序列的植物可表達的基因(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)在所述植物宿主中有功能的編碼可選擇標記基因的DNA序列，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，(2)在允許選擇選擇性標記基因之存在的條件下，從一轉化細胞生成植物。
本發明還包括那些遺傳上發生改變後，可產生增長水平海藻糖的植物。
本發明還包括具有含本發明植物可表達基因的重組DNA基因組的那些植物。
本發明還包括在重組DNA基因組中含本發明植物可表達基因，並能產生海藻糖的那些植物。
本發明還包括根據本發明含有重組DNA基因組並表現出增強的抗旱性的那些植物。
本發明還涉及根據本發明的那些植物的某部分，例如細胞或原生質體或其培養物，花，果實，葉，花粉，根(包括髮根培養物)，種子，莖，塊莖(包括所謂的微塊莖)等等。
本發明還涉及到保存含有海藻糖的植物或植物某部分的方法，它包括以下步驟(1)培養本發明產生海藻糖的植物，(2)收穫含有海藻糖的植物或植物的某部分(3)風乾植物或植物的某部分，或者(4)冷凍乾燥植物或植物的某部分。
本發明還包括根據本發明的方法保存的植物和植物的某部分。
本發明還包括生產海藻糖的方法，它包括以下步驟(1)培養由於重組植物DNA基因組而能產生增長水平海藻糖的植物，(2)收穫所述植物或植物的某部分，(3)從所述的植物或植物的某部分中分離海藻糖。
本發明還包括生產海藻糖的方法，它包括以下步驟(1)培養由於重組植物DNA基因組而能產生增長水平海藻糖的植物細胞，(2)從所述植物細胞培養物中分離海藻糖。
本發明還提供了一種分離的編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的核酸序列。優選的分離核酸序列是從大腸肝菌中獲得的，尤其優選SEQIDNO 2所表示的分離核酸序列。另一優選的實例包括編碼如SE-QIDNO 3中胺基酸序列的核酸序列。
下面的附圖將進一步說明本發明。

圖1植物次生組織中部分蔗糖和澱粉生物合成途徑的示意圖。本圖表示在葉片中通過光合作用產生的碳水化合物通過韌皮組織以蔗糖形式來運輸。進入次生組織後，它被與膜結合的轉化酶水解產生單糖葡萄糖和果糖。通過一些酶促步驟的作用，如這裡粗略所示這些單糖被轉化成澱粉和/或蔗糖。葡萄糖的代謝物G6P和UDPG被認為可作為TPS-酶的底物，這種酶是通過將植物可表達的otsA基因通過基因工程方法引入植物而得到的。本圖表示了如何通過降低SPS酶和AGP酶的水平增加作為底物的UDPG和G6P數量。它們的抑制作用用X標明。圖2.來自Kohara等(1987)的EMBL4克隆7F11的示意圖，它包含大腸桿菌otsBA操縱子。18.8kb的插入子用陰影表示。用來克隆otsA基因的EcoRV和HindIII限制性酶切位點以及它們相對於插入子左手位點的、以kb計的距離也被標出。標出了otsA和B基因，箭頭表示轉錄的方向(見圖8，擴展圖)。圖3克隆的馬鈴薯SPS cDNA序列。劃線部分被用作PCR擴增反應的寡聚核苷酸的玉米SPS cDNA序列。圖4二分載體pMOG644的示意圖。圖5顯示克隆在pMOG 579中的兩個片段的部分pTiB6的限制性酶切圖譜。圖6用來在農桿菌菌株MOG101中構建無T區輔助質粒的pMOG579的示意圖。圖7表示載體pMOG180的示意圖。圖8來自Kohara等(1987)的EMBL4克隆7F11的擴展圖，包含大腸桿菌otsBA操縱子。標出了TPS開放讀碼框架(ORF)的位置。(*在Kohara等的圖中沒有的HindIII位點)。圖9二分載體pMOG799的示意10二分載體pMOG801的示意圖。圖11二分載體pMOG802的示意圖。
本發明一個優選實施方案包括在塊莖中能產生海藻糖的馬鈴薯植物，這是由於在馬鈴薯植物中存在著植物可表達的基因，該基因依次包括以下序列(a)來自於CaMV 355RNA的轉錄起始區，在此起始區上遊一側有一雙重增強子，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶的DNA序列，這是位於大腸桿菌otsBA操縱子中的otsA基因的編碼區，(c)從農桿菌屬的胭脂氨酸(nos)合成酶基因中獲得的轉錄終止序列。含有植物可表達TPS基因的轉基因植物的塊莖中產生海藻糖，而缺乏這種基因的對照植物則不能產生。很明顯，轉基因的塊莖產生的海藻糖磷酸酯被轉化成了海藻糖。因為馬鈴薯中似存在海藻糖磷酸酯磷酸酯酶活性，顯然不必提供這一酶活性。
圖1還表示出提高TPS底物的方法。為了這個目的，兩個影響葡萄糖-6磷酸(G6P)和UDPG的基因和反義SPS基因及反義AGP酶基因在CaMV 355啟動子控制下已被克隆到植物宿主中進行表達。如果是引入到含有本發明植物可表達TPS基因的植物宿主中，則能提高用作底物的TPS含量，因此能增加海藻糖的合成。本領域技術人員很容易想到用其它的反義基因阻止蔗糖或澱粉的合成，以提高底物的含量。
雖然本發明詳細描述的是馬鈴薯在CaMV 35S啟動子作為轉錄起始區的控制下表達大腸桿菌的植物可表達海藻糖磷酸酯合成酶基因，但本領域技術人員很清楚，其它種子植物也同樣適用來生產海藻糖。優選的種子植物中的植物宿主是被子植物，尤其是雙子葉植物，代表性的科尤其包括茄科，和單子葉植物，代表性的科尤其包括禾本科。適當的宿主植物，如本發明說明書中所定義，包括這樣的植物(還有所述植物的某部分及細胞)和它們的後代，運用重組DNA技術已使它們在遺傳上發生了改變導致或增強有關植物或植物器官中海藻糖的產生。這些植物可直接使用(例如那些產生可食部分的植物)或海藻糖從所述宿主中提純後再使用(從那些可食及不可食植物宿主中)。根據本發明具有可食部分的農作物包括那些產花植物如花椰菜(Brassica olercaea)，洋薊(cynara scolymus)；產果實植物，如蘋果(Malus，如domesticus)，香蕉(Musa，如acuminata)，漿果(如茶藨子屬，Ribes，如rubrum)，櫻桃(如甜櫻桃，Prunus，如avium)，黃瓜(Cucumis，如sativus)，葡萄(Vitis，如vinifera)，檸檬(Citrus limon)，甜瓜(Cucumis melo)，堅果(如胡桃，Juglans，如regia；花生，Arachis hypogeae)，桔子(Citrus，如maxima)，梨(Pyra，如，communis)，辣椒(Sohnum，如capsicum)，李子(Prunus，如domestica)，草黴(Fragaria，如moschatu)，西紅柿(Lycopersicon，如esculentum)；產葉植物如苜蓿(Medicago stativa)，捲心菜(如Brassica oleracea)，苣蕒菜(Cichoreum，如endivia)，韭蔥(Allium porrum)，生菜(lactuca sativa)，菠菜(Spinaciaoleraceae)，菸草(Nicotiana tobacum)；產根植物如竹芋(Maranta arundinacea)，甜菜(Beta vulgaris)，胡蘿蔔(Daucus carota)，木薯(Manihotesculenta)，蕪菁(Brassica rapa)，小蘿蔔(Raphanus sativus)，薯蕷屬(Dioscorea esculenta)，甘薯(Ipomoea batatas)；和產種子植物，如蠶豆(Phaseolus vulgaris)，豌豆(Pisum sativum)，大豆(Glycin max)，小麥(Triticum aestium)，大麥(Hordeum vulgare)，玉米(Zeamays)、水稻(Oryza sativa)；產塊莖植物，如球莖甘藍(Brassica oler-aceae)，馬鈴薯(Solanum tuberosum)等等。由於植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因的存在，使得可食部分在其中有更高海藻糖水平存在下可通過乾燥來保存。通過把編碼TPS活性的DNA置於植物器官或組織特異性啟動子的控制下來產生更高水平的海藻糖是非常用益的；啟動子的選擇可由本領域技術人員很容易地確定。
可使用任何置於植物細胞中DNA表達所必需的調控元件控制下的海藻糖磷酸酯合成酶基因(特異性或組成性地)，只要它能夠產生有活性的海藻糖磷酸酯合成酶活性。SEQIDNO 2所示的核酸序列，及事實上任何根據本發明編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的開放讀碼框架，都可改變，但不一定會改變其所編碼蛋白的胺基酸序列。這個事實是由遺傳密碼的簡併性造成的。那麼編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的開放讀碼框架可調整成所選宿主植物慣用的密碼子。
SEQIDNO 2所示的分離的核酸序列，可通過將其它來源的DNA和從大腸桿菌基因中獲得的DNA-或RNA-片段雜交的方法，用於鑑定其它機體中的海藻糖磷酸酯合成酶活性並分離它們。優選地，這些DNA序列通過嚴格條件下的雜交來篩選(如溫度和雜交混合物的離子強度)，條件是否嚴格也依賴於雜交的性質，如DNADNA，DNARNA，RNARNA，還有最短的雜交片段的長度。本領域技術人員能很容易地建立一嚴格雜交體系。
分離海藻糖磷酸酯合成酶活性的來源包括微生物(如細菌，酵母，真菌)，植物，動物等等，從其它來源分離編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列可使用與本發明產生海藻糖類似的方法。
本發明還包括改變SEQIDNO 2中所示的核酸序列而獲得的核酸序列，通過突變一個或多個密碼子會引起所編碼蛋白的胺基酸的改變，只要胺基酸序列的突變不會完全喪失海藻糖磷酸酯合成酶活性。
原則上，任何植物宿主都適於與任何植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因組合。如果有其它來源的海藻糖基因，可採用此處所述的相似的方法來獲得植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因組合。
抑制內源性基因以增加海藻糖磷酸酯合成酶的可用底物水平，如此處所例舉的抑制內源性蔗糖磷酸酯合成酶基因和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因。可用許多方法來進行，而方法的選擇對本發明來說不是至關重要的。優選的基因抑制是通過所謂的「反義方法」來完成的。其中，DNA序列被表達產生一RNA，這一RNA至少部分地和編碼將要被阻斷酶活性的RNA互補(如實施例中的AGP酶或SPS)。優選使用同源反義基因，因為它們比異源基因更有效。用玉米SPS-基因序列作為探針從馬鈴薯中分離反義SPS基因足以證明這個策略的可行性。這並不意味著實施本發明必須要求使用同源反義片段。阻斷不想要的酶合成的一種可供選擇的方法是將存在於植物宿主的該內源基因的附加拷貝導入植物宿主的基因組。經常可看到這樣一個基因的附加拷貝可使此內源基因沉默在文獻中，這種效應被稱作共抑制效應或共抑制。
原則上，雙子葉和單子葉植物都可以被轉化，都可通過將本發明植物可表達的基因導入受體細胞而發生改變，並長成一株含有並表達植物可表達基因的新植物，本發明優選的是那些能將海藻糖磷酸酯轉化成海藻糖，並不含有或幾乎不含有海藻糖降解活性的植物。可以理解，那些缺乏將海藻糖磷酸酯轉化成海藻糖活性的植物也包括在本發明中。這些植物可通過引入編碼磷酸酯酶的額外基因加以改變，使其能將海藻糖磷酸酯轉化成海藻糖。原則上，那些含有海藻糖酶的植物也可考慮，因為可通過抑制這些酶活的方法，使其適於產生海藻糖，例如採用反義方法抑制編碼這些酶的基因的表達。
只要是基因穩定地整合到所述植物細胞的基因組中，那麼將植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因引入到受體植物細胞的方法不是極其重要的，除了使用農桿菌屬的菌株以外，還可採用其它各種已有技術將DNA導入植物細胞，如使用鈣/聚乙二醇方法的原生質體轉化，電穿孔和微注射或(包被)粒子轟擊(Potrykus，1990，Bio/Technol.8，535-542)。
除了這些所謂直接DNA轉化方法外，包含載體的轉化系統也已廣泛採用，如病毒載體(如來自花椰菜花葉病毒(CaMV))和細菌載體(如來自農桿菌屬(Potrykws，1990，Bio/Technol，8，535-542)。經過選擇和/或篩選，轉化過的原生質體，細胞或植物某部分可採用本領域中已知的方法再生整株植物(Hcrsch等.，1985，Scienco 225，1229-1231)。
已證明單子葉植物可用於轉化，可以轉化的細胞可再生成可育的轉基因植物。對這些作物來說可重複的組織培養系統和將遺傳物質導入植物細胞的有效方法的發展使轉化容易進行。目前，轉化單子葉植物的優選方法是外植體或懸浮細胞的微粒轟擊和直接DNA攝入或電穿孔(Shimanoto等，1989，Nature 338，274-276)。通過微粒轟擊將編碼phosphinothricin乙醯轉移酶(一種滅活除草劑phos-phinothricin的酶)的吸水鏈黴菌bar-基因導入玉米懸浮培養物的胚胎發生細胞中，得到了轉基因玉米植物(Gordon-Kamm，1990，PlantCell，2，603-618)。將遺傳物質導入到其它單子葉作物如小麥和大麥的糊粉原生質體中也已有報導(Lec，1989，Plant Mol.Biol，13，21-30)，由胚胎發生懸浮培養物已再生出小麥植物，這是通過只選擇成熟的、緻密的節狀胚胎發生愈傷組織來建立胚胎發生懸浮培養物(Vasil，1990 Bio/Technol.8，429-434)。結合這些作物的轉化系統可使本發明能夠應用到單子葉植物。這些方法也可應用在雙子葉植物的轉化和再生中。
單子葉子物，包括商業上重要的作物如玉米，易於通過農桿菌屬的菌株進行DNA轉移(歐洲專利159 418 B1；Gould J，Michel D，Hasegawa O，Ulian EC，Peterson G，Smith RH，(1991)Plant.Physiol.95，426-434)。
關於宿主植物的選擇，優選幾乎沒有或沒有海藻糖降解活性的植物種類。然而，表現出海藻糖酶活性的植物也不排除是產生海藻糖的適當植物宿主，儘管如果這阻礙了海藻糖的積累可能必須要抑制海藻糖酶的活性。這種抑制可用本領域中眾所周知的和本說明書中為其它目的所描述的反義方法來完成。
也應該清楚，本發明不拘限在使用CaMV 35啟動子作為轉錄起始區。控制植物可表達基因表達的適當的DNA序列(包括標記基因)如轉錄起始區、增強子、非轉錄前導序列等等，都可從在植物細胞中表達的任何基因衍生而來，如內源植物基因，在植物細胞中自然表達的基因，如那些位於農桿菌野生型T-DNA上的基因，植物病毒的基因，還有其它包含同真核轉錄起始共有序列一致的轉錄起始區的真核基因。還可考慮組合各種啟動子的功能部分或其合成等同物的雜合啟動子。除了組成型啟動子外，誘導型啟動子或在它們表達方式中起調控作用的其它啟動子如程序型或細胞型特異啟動子可用來控制本發明的植物可表達基因的表達，只要這些基因可在含有TPS底物的植物某部分中表達。
為了選擇或篩選轉化細胞，優選將標記基因和根據本發明的要轉化到植物細胞中的植物可表達基因連接起來。在植物轉化中適當的標記基因的選擇是普通技術人員能做到的；常規使用的標記基因的例子有提供卡那黴素抗性的新黴素磷酸轉移酶基因(EP-B 131623)，從鼠肝中分離的提供穀胱甘肽衍生的除草劑抗性的穀胱甘肽-S-轉移酶基因(EP-A 256 223)，對穀氨醯胺合成酶抑制劑如phosphinothficin提供超量表達抗性的穀氨醯胺合成酶基因(WO 87/05327)，提供對選擇性試劑phosphinothricin抗性的來自綠色產色鏈黴菌的乙醯轉移酶基因(EP-A 275 957)，使耐N-膦醯甲基甘氨酸、編碼5-enolshikimate-3-磷酸合成酶(EPSPS)的基因，提供Bialaphos抗性的bar基因(如WO 91/02071)等等。只要它在和選擇的植物細胞組合上是起作用的(如選擇的)，標記的實際選擇不是至關重要的。
標記基因和目的基因不一定要連在一起，因為在植物轉化中，非連接基因的共轉化也是一有效的方法(美國專利4,399,216)。
優選轉化的植物材料，尤其對雙子葉植物作物來說，是易轉化且具有好的再生能力的葉片(Horsch R.B.等.，(1985)Science 227，1229-1231)。
而海藻糖的產生可通過採用植物可表達的海藻糖磷酸酯合成酶基因作為唯一的糖類修飾基因來實現，本發明還進一步用列舉了能夠增加海藻糖磷酸酯合成酶底物可用性的其它的植物可表達的反義基因的例子。這些基因具體例子為玉米和馬鈴薯中的植物可表達的SPS反義基因及馬鈴薯中的AGP酶的反義基因。
用反義方法對糖類修飾酶的負調控不拘限於這些具體的舉例。例如，植物可表達的部分互補的反義基因可用來抑制靶基因的表達，只要植物可表達反義基因產生的轉錄產物和靶基因的轉錄產物足夠互補，且足夠長從而抑制所述靶基因的表達。
對於本發明，兩種或多種基因在同一植物中如何存在是不重要的。這尤其可以通過以下方法之一來實現(a)以含有一個以上要導入基因的多基因構建物來轉化植物系，(b)用不同的構建物同時共轉化同一植物系，(c)以要導入的基因對同一植物進行幾次轉化，(d)把含不同基因的兩種植物雜交使它們導入同一種植物中。
本發明應用的領域是農業和園藝業，例如，由於改造的植物具有改良的性質，也可應用在那些使用或將使用海藻糖的一些工業上。海藻糖磷酸酯和海藻糖可就此以其純化的形式或混合物的形式、或是作為植物某部分的貯存產物的形式使用。含有(增加水平的)海藻糖磷酸酯或海藻糖的植物某部分可就此使用或加工而不需加入海藻糖。
海藻糖也可從產生它的植物或植物部分中提純，最終用在工業加工中。在食品工業中，乾燥前可在食物中加入海藻糖。食物的乾燥是工業中保存食物的一種重要的方法。海藻糖似乎對通過傳統風乾的食品保存非常有用，並且能使高質量產品在加入水後快速還原(Roser等，July 119，Trends in Food Science and Technology，pp.166-169)。其益處包括天然香味/芳香，新鮮產品的味道和營養價值(蛋白質和維生素)的保留。已證明，海藻糖具有穩定蛋白質和膜的能力，並形成一化學惰性的、穩定的玻璃狀物。這種完全乾燥的食品的低水活性能阻止引起腐敗的化學反應。
田野作物如玉米、木薯、馬鈴薯，甜菜和甘蔗很久以來都被作為大量糖類生產(澱粉和蔗糖)的天然來源。通過基因工程將海藻糖生物合成途徑引入到這些植物種類中，使這些作物能產生海藻糖，這將允許利用這些基因工程作物生產海藻糖。
在說明書中所列舉的全部文獻都表明了本發明有關領域的技術水平。不論是否專利，在本說明書的前後部分提及的所有出版物在這裡都被引入本文作為參考，就象它們是被單獨引入的。
下面給出的例子僅為說明目的而決不是限制本發明的範圍。DNA操作所有的DNA操作(從大腸桿菌分離DNA、限制性酶切、連接、轉化等等)都按照標準實驗操作進行(Sambrook等、(1989)MoleculerCloninga laboratory manual，2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratayPress，CSH，New York)。菌種在所有實施例中都用大腸桿菌K-12DH5α來克隆用於植物轉化實驗的根癌農桿菌菌株是MOG 101，它是通過用壯觀黴素抗性標記取代T-DNA而從LBA 1010(Koekman等，(1982)Plasmid 7，119)中衍生的非致癌性章魚氨酸型輔助菌株。農桿菌菌株MOG 101的構建二分載體系統(Hookema A.，Hirsch，P.R.，Hooykaas，P.J.J.，和Schilperoort，R.A.(1983)Nature 303，179)用於把基因構建物轉進馬鈴薯和菸草植物體中。賦予根瘤農桿菌毒力功能的輔助質粒是由章魚氨酸Ti-質粒pTiB6衍生而來的。MOG 101是攜帶非致癌性Ti-質粒(Koekman等、1982，同上)的根瘤農桿菌，Ti-質粒的整個T-區從中缺失，並被轉座子Tn 1831中(Hooylaas等，1980，Plasmid 4，64-75)的細菌壯觀黴素抗性標記所取代。
Ti-質粒pTiB6含有兩個相鄰的T-區，TL(T-左)和TR(T-右)。要獲得缺乏TL和TR-區的衍生物，我們構建了中間載體pMOG579。質粒pMOG 579是pBR322的衍生物，其中含有兩個Ti-質粒片段，該片段與位於pTiB6 T區左右外側的片段同源(圖5和6中的陰影部分)。pMOG579中的這兩個片段被轉座子Tn1831中帶有壯觀黴素標記的2.5kb BamHI-HindIII片段(Hooykaas等，1980 Plas-mid 4，64-75)分隔開(圖6)。這個質粒通過三親接合，用HB1018pRK2013作為輔助子從大腸桿菌導入到根瘤農桿菌菌株LBA 1010(C58-C9(PTiB6)＝一處理後的C58，其中導入了pTiB6)(Koekonam等(1982)，同上)。接合子通過利福平(20mg/l)和壯觀黴素(250mg/l)的抗性來選擇。pMOG579和pTiB6間的雙重組導致了羧苄青黴素抗性(pBR322標誌)的喪失和整個T-區的缺失。500株壯觀黴素抗性的接合子影印接種到羧苄青黴素(100mg/l)上，其中兩個發現是敏感的。Southern分析(沒表示出來)表明雙交換的發生使得整個T-區缺失。最終的菌種稱為MOG101。這個菌株和它的構建與菌株GV2260是相似的(Debaere等，1985，Nucl.Acid.Res，13，4777-4788)。
對於MOG101一個可選擇的輔助菌種是例如LBA 4404；這個菌株也適於用在二分質粒的導入，如pMOG799和隨後的植物轉化。其它合適的輔助菌株是很容易得到的。表達載體pMOG 180的構建表達載體pMOG 180是pMOG 18(EP 0 479 359 A1，Example2b)的衍生物，其中編碼GUS的基因被除去而其它基因作為BamHI片段可插入到ALMV RNA4前導序列和3』nos終止子之間。
為這一目的，用PCR技術合成含有35S啟動子和AIMV RNA 4前導序列的pMOG 18的EcoRI/NcoI片段，所用引物對為5』GTTTC-TACAGGACGGA GGATCCTGGAAGTATTTGAAAGA3』知5』CAGC-TATGACCATGATTACG3』，由此把NcoI位點突變成一個BamHI位點。然後用EcoRI和BamHI消化pMOG18載體，之後，新合成的EcoRI/BamHI片段可連接在這些限制性酶切位點之間。為了避免PCR-誘導的啟動子序列中的隨機突變，在PCR合成的EcoRI/BamHI片段中的EcoRI/EcoRV片段被pMOG18野生型的序列取代。短的EcoRV/BamH1片段通過序列測定檢測突變。最終的表達載體是質粒pMOG 180(圖7)。三親接合二分載體在三親接合中用含有質 粒pRK2013(Ditta G.，Stan-field，S.，Corbin，D.，和Helinski，D.R.等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci，USA 77，7347)的大腸桿菌菌種HB101轉移到根瘤農桿菌菌株MOG 1010中並用來轉化。菸草的轉化(Nicotiana tabacum SR1)菸草的轉化是通過植物組織和含有如上所述的目的二分載體的根瘤農桿菌菌株MOG101(Hoekema等，1983，Nature 303，179-180)共培養來進行的。如Horsch等(1985，Science 227，1229-1231)所述採用菸草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR1)的葉片共培養進行轉化。轉基因植物由生長在含有卡那黴素或潮黴素的選擇培養基上的幼苗再生得到，其抗性取決於二分質粒的抗性基因，然後再使它生根，再轉入土壤中。馬鈴薯的轉化馬鈴薯cv.Désiree是用含有如上所述的目的二分載體的根瘤農桿菌菌株MOG 101來轉化的(Hoekema A.，Huisman，M.J.Molendijk，L.，Van den Elzen，P.J.M.，和Cornelissen，B.J.C.(1989)Bio/technology 7，273)。基本培養基是MS 30R30，組成為MS-培養基(Murashige，T.，和Skoog，F.(1962)Physiol.Plan，14，473)，其中有30g/L蔗糖，R3維生素(Ooms G.，Burrell，M.M.，Karp，A.，Bevan，M.，和Hille，J.(1987)Theor.Appl.Genet.73，744)，5μM玉米素核苷(ZR)和0.3μM吲哚乙酸(IAA)。如需要，可用0.7g/L Daichin瓊脂使之固化。
將馬鈴薯的塊基削皮，其表面用含0.1％Tween-20的0.6％次氯酸鹽溶液消毒20分鐘。馬鈴薯用大量的無菌水徹底清洗至少2小時。從以Corkbore製備的塊莖組織的圓柱體上切下大約2mm厚的圓片。圓片在含無ZR和IAA的MS30R3培養基和106-107細菌/ml的攜帶二分載體的農桿菌MOG 101的懸浮液中溫育20分鐘。隨後，圓片在無菌的濾紙上吸乾水分，再轉移到含有ZR和IAA的固體MS30R3培養基上。兩天後，圓片再轉移到含有100mg/L頭孢噻肟(cefo-taxim)和50mg/L萬古黴素的新鮮培養基上。一周後，圓片再轉移到相同的培養基上，但這一次用100mg/l卡那黴素來選擇轉基因幼苗。4-8周後，切下從圓片上長出的幼苗，放在生根培養基中(MS30R3-培養基，不合ZR和IAA，但含有100mg/L頭孢噻肟(ce-fotaxim)和100mg/L卡那黴素)。幼苗通過分生組織扦插進行無汙染的繁殖，根發育後再轉入土壤。合適時，用10mg/L潮黴素代替100mg/L卡那黴素進行篩選。
馬鈴薯cv.Kardal的轉化基本如cv.Désiree操作，但有以下的變動基本培養基中的植物激素玉米素核苷3.5mg/l；IAA(吲哚乙酸)0.03mg/l。用於轉化的農桿菌懸浮液為105至106細菌每毫升。生根培養基中卡那黴素的濃度為50mg/l。海藻糖測定海藻糖的鑑定基本上如Hottiger等所描述(Hottiger等，(1987)J.Bact，169，5518)。馬鈴薯塊莖組織在液氮中冷凍，用碾槌和研缽粉碎然後在大約3倍體積的500mM三氯乙酸中室溫下抽提60分鐘。離心後，沉澱再用同樣方法抽提一次。測定兩次抽提的混合上清液中蒽酮陽性物質(Spiro R.G.(1966)Meth.Enzymol，8，3)。海藻糖可通過薄層層析法定性測定。將抽提物去離子(Merck，Ion ex-chenger v)並加至矽膠60板(Merck)上。層析板用正丁醇-吡啶-水(15∶3∶2，V/V)展開後，用5mg/ml香草醛的濃硫酸液噴灑，並在130℃加熱顯現斑點。商品海藻糖(Sigma)用作標準品。
海藻糖還可通過陰離子交換層析用脈衝安培計檢測進行定量測定。抽提物由在1g冷凍材料中加入1ml沸水製備，隨後100℃加熱15分鐘。樣品(25μl)用配備有4×250mm Dronex 35391 Carbopac PA-1柱和一4×50mm Dionex 43096 Carbopac PA-1預柱的DronexDX-300液相色譜儀分析。以100mM NaOH在1ml/min流速下洗脫。以一脈衝安培檢測器檢測糖。以商品海藻糖(Sigma)為標準品。酶的測定在所有的測定中，非轉基因塊莖材料或非轉基因的菸草材料用作對照。所有樣品中蛋白含量測定如Bradford所述(Bradford(1976)Anal.Biochem，72，2498)。在塊莖抽提物實驗中，冷凍的大約100mg的馬鈴薯塊莖切片在100μl 20mM HEPES PH7.4中勻漿，離心(Empendnf，最大速度下5分鐘)。上清用於酶活實驗。SPS活性-SPS活性基本按照Amin，J.和Preiss，J.(1982)(Plamfphysiol.69，1027-1030)所描述的方法測定。通過改變反應混合物的組成，可測定SPS活性的兩種形式Vmas和Vsel。Vmax反應混合物中含有3.2mM VDP-葡萄糖，81μM[14C]-UDP-葡萄糖，3.2mM果糖-6-磷酸酯，16mM葡萄糖-6-磷酸酯，100mM Hepes PH7.4，20mM MgCl2和5mM EDTA，總體積為50μl。在Vsel反應混合物中，果糖-6-磷酸酯和葡萄糖-6-磷酸酯的濃度減半並加入5mM無機磷酸鹽。作為對照，在Vmax反應混合物中測定SPS酶活時不加入果糖-6-磷酸酯和葡萄糖-6-磷酸酯。反應在室溫下進行30分鐘，95℃加熱5分鐘終止反應。反應產物用鹼性磷酸酯酶處理，產生的[14C]-蔗糖通過離子交換層析從底物中分離。反應中形成的放射標記蔗糖的量用閃爍記數器測定。TPS活性-TPS活性用與所述SPS相似的方法來測定。離子交換層析後，樣品中含有脫磷酸的蔗糖還有海藻糖。為了測定形成的產物中哪一部分是海藻糖，樣品用上述的薄層層析分離。將抽提物去離子(Merck，Ion exchanger v)並上樣於矽膠60板(Merch)。層析後，刮下含[14C]-蔗糖和[14C]-海藻糖的點，用閃爍記數器測定。AGP酶(AGPase)活性-AGP酶活性用Muller-Roker等所描述的方法測定(Müller-Rber B.，Sonnewald，U.，和Willmitzer，L.(1992)EMBO J.11，1229)。由ADP-葡萄糖產生的葡萄糖-1-磷酸酯在NAD-連接的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶系統中測定。反應物中含有80mM HEPES PH7.4，10mM MgCl2，1mM ADP-葡萄糖，0.6mM NAD，10μM葡萄糖-1，6-二磷酸，3mM DTT，0.02％牛血清白蛋白，1U鼠肌肉中的磷酸葡萄糖轉位酶(Sigma)，2.5U腸繫膜狀明串珠菌的NAD-連接的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和塊莖抽提物。加入焦磷酸鈉至終濃度2mM來啟動反應。NAD還原用分光光度計在340nm 30℃測定。AGP酶活性的單位定義為每分鐘在30℃產生的葡萄糖-1-磷酸納摩爾數。
實施例1全長大腸桿菌otsA基因的克隆在大腸桿菌中，海藻糖磷酸酯合成酶(TPS)由位於otsBA操縱子的otsA基因編碼。操縱子在大腸桿菌染色體上轉錄的位置和方向是已知的(Koaseh，I.，Falkenberg，P.Styrvold，O.B，和Strom，A.R.(1992)J.Bact.174，889)。otsA基因位於42』，並根據Kaasen等將其定位在存在於Kakara等命名的EMBL4基因組克隆7F11的18-8kb片段上(Kohara，Y.，Akiyama，K.，and Isono，K.(1987)Cell 50，4955)。DNA由λ克隆7F11的裂解物中製備，用HindIII消化。分離的2.9kb HindIII片段(插入片段14.3kb處的右手HindIII位點在圖譜上被kohlara等省略，如Kassen早已指出的那樣)克隆到HindIII切成線性的PUC 18中。所形成質粒(稱為pMOG674)的2.9kb HindIII插入片段被測序。該序列中含有阿拉伯糖轉運操縱子的部分araH基因(Scripture，J.B.，Voelker，C.，Miller，S.，O Donnell，R.T.，Polgar，L.，Rade，J.，Horazdovsky，B.F.，和Hogg，R.W.(1987)J.Mol.Bul.197，37)，Kaassen等定位的編碼TPS的otsB基因，和編碼TPS的部分otsA基因。otsA被發現不局限在Kaasen等。所描述的2.9kb HindIII片段中。為完成這一序列，一重疊的BamHI/EcoRI片段被分離並部分測序。完整的編碼TPS的otsA基因的序列如SEQIDNO2所示。otsA基因在克隆7F11上的位置及所使用的限制性酶切位點如圖8中所示。在Kohara等，所繪圖譜上不存在的另一HindIII位點被發現存在於2.9kb HindIII片段的左手位點。
通過將寡聚核苷酸雙鏈SstI5′AGCTCACGAGCTCTCAGG 3′ (SEQ ID NO8)3′GTGCTCGAGAGTCCTCGA 5′ (SEQ ID NO9)克隆到由HindIII切開的pMOG 180中，pMOG 180中HindIII位點由SstI位點取代。形成的載體被稱為pMOG746。寡聚核苷酸雙鏈
BamHI SphI HindIII|SmaI | | BamHI|| | | |5′ GATCCCCCGGGGCATGCAAGCTTG 3′(SEQ ID NO10)3′ GGGGCCCCGTACGTTCGAACCTAG 5′(SEQ ID NO11)被克隆到用BamHI切成線狀的載體pMOG 746中。這種含有所要求取向(用限制性內切酶消化來檢驗)的寡聚核苷酸雙鏈的載體被稱作pMOG 747。質粒pMOG 674的2.9kb HindIII片段克隆到用HindIII切成線狀的pMOG 747中，產生載體pMOG 748。大約2.4kb EcoRV/SstI和大約3.5kb SstI/SmaI的pMOG 748片段被分離，連接，再轉化到大腸桿菌中，由此缺失2.9kb HindIII片段的3』末端。形成的質粒稱作pMOG 749。otsA基因的5』末端由PCR合成，PCR是用合成的寡聚核苷酸TPS1和TPS2，且用pMOG 749作為模板來進行的。
TPS1 5′ GAGAAAATACCCGGGGTGATGAC 3′(SEQIDNO12)TPS2 5′ GATAATCGTGGATCCAGATAATGTC 3′ (SEQIDNO13)通過測序確定0.4kb PCR片段有正確的序列。pMOG 749的1kbBamHI/HindIII片段和0.4kb XmaI/BamH PCR片段一起克隆到用XmaI及HindIII切成線狀的pMOG 747中。形成的質粒用HindIII和SstI消化，並克隆編碼TPS的三個C-末端胺基酸的合成寡聚核苷酸TPS6/7，LysLeuAlaStopTPS 6/75′ AGCTGGCGTGAGGAGCGGTTAATAAGCTTGAGCT3′3′ CCGCACTCCTCGCCAATTATTCGAAC5′形成的質粒用HindIII和SstI消化，克隆含有根瘤農桿菌胭脂氨酸合成酶(NOS)基因終止子的質粒pMOG749 HindIII/SstI片段，產生質粒pMOG 798。該質粒在帶有雙增強子的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子(Guilley等，(1982)Cell 30，763)、苜蓿花葉病毒(AMV)RNA4前導序列(Brederode等，(1980)Nucl.Acid Res.8，2213)和根瘤農桿菌胭脂氨酸合成酶轉錄終止子序列的控制下含有正確取向的otsA基因。整個的表達盒作為一2.5kb EcoRI/SstI片段被克隆到EcoRI和SstI切成線狀的二分載體pMOG 23中。形成的二分載體pMOG 799(圖9)被用來轉化馬鈴薯和菸草(含有pMOG 799的大腸桿菌菌株已於1993年8月23日被保存在Centreaal Bureau voorSchimmelcultures，Phabagen collections，Padulaan 8，Utrecht，The Nether-lands，保藏號為CBS 430.93；pMOG 23已於1990年6月29日被保存在CBS，保藏號為CBS 102.90)。
實施例II在pMOG 799轉化的菸草中海藻糖的產生用根瘤農桿菌將二分載體轉化到菸草葉片中。20株獨立的轉基因幼菌用來做海藻糖磷酸酯合成酶(TPS)活性的分析。發現一些離體生長的菸草植物與非轉化的植物相比具有非常粗的根。對這些轉基因菸草植物的根進行分析，表明與非轉基因對照植物相比，它的海藻糖水平有增加。
實施例III在pMOG 799轉化的馬鈴薯中海藻糖的產生用根瘤農桿菌將二分載體轉化到馬鈴薯的塊莖切片中。轉基因的幼苗用卡那黴素篩選。20株獨立的轉基因幼苗用來做海藻糖磷酸酯合成酶(TPS)活性的分析。含有這種酶的幼苗被培養成成熟的植物體。對這些轉基因馬鈴薯植物成熟塊莖的分析表明，與非轉基因對照植物相比，它的海藻糖水平有所增加。轉基因植物系MOG799.1被繁殖用於下一步工作。
實施例IVpMOG 664的構建合成了相應於馬鈴薯塊莖cv.Descree(Muller-Rober，B.，Koss-mann，J.，Hannah，L.C.，Willmitzer，L.，和Sonnewald，U.(1990)Mol.Gen Genet，224，136-146)ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亞基(AGPase B)cDNA序列的兩條寡聚核苷酸5′ TCCCCATGGAATCAAAGCATCC 3′ (SEQIDNO4)5′ GATTGGATCCAGGGCACGGCTG 3′ (SEQIDNO5)設計寡聚核苷酸使其末端含有合適的限制性酶切位點(BamHI和NcoI劃線部分)，以便用這些酶作用後可以反義取向組裝在表達盒中。從二個月大的葉片組織(Clontech)製備馬鈴薯cv.Desiree的cD-NA文庫，用從中分離的DNA作為模板，用這些寡聚核苷酸PCR擴增大約1kb的片段。通過測序表明，這個片段和馬鈴薯cv.Desiree(Muller-Roker，B.，Kossmann，J.，Hannah，L.C.，Willmitzer，L.，和Sonnewedd，U.(1990)Mol.Gen.Genet.224，136-146)的AGPaseB序列是一致的。用BamHI和NcoI消化以後，該片段被克隆到用BamHI和NcoI切成線狀的pMOG 18中。將所成質粒的1.85kbEcoRI/BamHI片段(含CaMV 35S啟動子，AMV RNA4前導序列和反義取向的AGP酶片段)，及含有根瘤農桿菌的胭脂氨酸合成酶(NOS)基因終止子的BamHI/HindIII片段用三向連接克隆到用EcoRI和HindIII切成線狀的二分載體pMOG22中。二分載體pMOG 22中含有植物可表達的HPTII基因以用潮黴素選擇轉基因植物(pMOG22已於1990年1月29日被保存在the Centraal Buresu voor Schim-melcultures，保藏號為101.90)。形成的二分載體pMOG 664(圖4)用來轉化馬鈴薯。
實施例VpMOG 801的構建合成一組與玉米蔗糖磷酸酯合成酶(SPS)cDNA序列(Worrell，A.C.，Bruneau，J-M.，Summerfait，K.，Boersig，M.，和Voelker，T.A.(1991)Plant Cell 3，1121)互補的寡聚核苷酸。它們的序列如下5′CTAGGTCGTGATTCTGATACAGGTGGCCAGGTG 3′ (SEQIDNO6)5′CAGCATCGGCATAGTGCCCATGTATCACGTAAGGC 3′ (SEQIDNO7)以由兩個月大的葉片組織(clontech)中製備的馬鈴薯cv.DesireeDNA文庫中分離的DNA作為模板，用這些寡聚核苷酸進行370bpDNA片段的PCR擴增。通過這個片段的測序表明它與玉米的SPS序列同源(見圖3，和Worrell等(1991))。此PCR片段被用來篩選從2個月葉片組織製備的馬鈴薯cv.Déiree cDNA文庫的一個λgt10文庫。一個陽性雜交克隆的插入序列被測序，發現654bp的DNA片段的序列與玉米SPS序列的對應部分(始於wbrrell等(1991)中圖11中第349個核苷酸)有65％的一致率。這個克隆的EcoRI插入序列和以下的合成寡聚核苷酸雙鏈以三向連接克隆到BamHI消化的pMOG180中。
5′GATCGTCAGATCTAGC 3′ (SEQIDNO14)3′CAGTCTAGATCGTTAA 5′ (SEQIDNO15)含有相對於Camv 35S啟動子反義取向的SPS片段的質粒被稱作pMOG787。質粒pMOG787的EcoRI/HindIII片段以三向連接與下列合成接頭克隆到用EcoRI切成線狀的二分載體pMOG22中。
5′AGCTTCCCCCCCG3′ (SEQIDNO16)3′AGGGGGGGGTTAA5′ (SEQIDNO17)二分載體pMOG22中含有轉基團植物用潮黴素選擇的植物可表達HPTII基因(pMOG22已於1990年1月29日保藏於Centraal BureauVoor Schimmelcultures，保藏號為101.90)。形成的二分載體pMOG801(圖10)用於馬鈴著的轉化。
實施例VIpMOG802的構建將含有反義SPS表達盒的質粒pMOG801的EcoRI片段克隆到用EcoRI切成線狀的二分載體pMOG664中(含有反義AGPase盒)。形成的二分載體被稱作pMOG802(圖11)。
實施例VII在pMOG 799和pMOG664轉化的馬鈴薯中海藻糖的產生表達TPS(實施例IX)的卡那黴素抗性植物系MOG799.1的馬鈴薯塊莖切片用含有反義AGP酶表達盒的二分載體pMOG664轉化。用10mg/L卡那黴素篩選的轉基因幼苗，通過PCR來分析TPS和反義AGP酶序列的存在。含有二者的轉基因植物用於TPS和AGP
轉基因塊莖AGP酶活性的分析表明與非轉基因對照相比，在個體轉基因系中酶活水平降低。Northern印跡法表明，與非轉基因對照植物相比，AGP酶的mRNA水平降低。與轉基因植物系MOG799.1相比，具有TPS活性和降低了AGP酶水平的轉基因馬鈴薯物塊莖中，海澡糖的水平提高。
實施例VIIIpMOG 799和pMOG801轉化的馬鈴薯中海澡糖的產生表達TPS(實施例IX)的卡那黴素抗性植物系MOG799.1的馬鈴薯塊莖切片用含有反義SPS表達盒的二分載體pMOG801轉化。以10mg/L潮黴素篩選的轉基因幼苗通過PCR來分析TPS和反義SPS序列的存在。含有二者的轉基因植物用於TPS和SPS活性的分析。
轉基因塊莖SPS活性的分析表明，與非轉基因對照相比，在個體轉基因系中酶活水平有降低。Northern印跡法表明，與非轉基因對照植物相比，SPS的mRNA水平降低。與轉基因植物系MOG799.1相比，具有TPS活性且降低了SPS水平的轉基因馬鈴薯植物塊莖中，海澡糖的水平提高。
實施例IXpMOG 799和pMOG802轉化的馬鈴薯中海藻糖的產生表達TPS(實施例IX)的卡那黴素抗性植物系MOG799.1的馬鈴薯塊莖切片用含有反義SPS和AGP酶表達盒的二分載體pMOG802轉化。以10mg/L潮黴素篩選的轉基因幼苗通過PCR來分析TPS和反義AGP酶及反義SPS序列的存在。含有這三種構建物的轉基因植物用於TPS、AGP酶和SPS活性的分析。轉基因植物用於TPS、AGP酶和SPS活性的分析。
轉基因塊莖的AGP酶和SPS活性的分析表明，與非轉基因對照相比，在個體轉基因系中，兩酶的活性都降低。Northern印跡法表明，與非轉基因對照植物相比，AGP酶和SPS的mRNA水平降低。與轉基因植物系MOG799.1相比，具有TPS活性並降低了SPS水平的轉基因馬鈴薯植物塊莖中，海藻糖的水平提高。保藏的菌種pMOG22；保藏號CBS 101.90(23頁，18-21行；24頁，21-23行)pMOG23；保藏號CBS 102.90(22頁，10行)pMOG799；保藏號CBS 430.93(22頁，6行)序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱MOGEN International N.V(B)街道Einsteinweg 97(C)城市LEIDEN(D)州Zuid-Holland(E)國家荷蘭(F)郵政編碼(ZIP)NL-2333 CB(G)電話(31)、(71)、258282(H)傳真(31)、(71)、221471(ii)發明題目植物中海藻糖的產生(iii)序列數目17(iv)計算機可讀形式(A)媒介種類軟盤
(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體PatentIn Release#1.0，#1.25版本(EPO)(v)本申請資料申請號WO PCT/EP93/02290(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特徵(A)長度370鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA到mRNA(iii)假擬無(vi)原始來源(A)生物體馬鈴薯(B)菌種Desiree(F)組織類型葉(xi)序列描述SEQ ID No1CTAGGTCGTG ATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTGAAGTATG TAGTAGAGCT TGCTCGAGCA 60CTTGCAAACA TGAAAGGAGT TCACCGAGTT GATCTCTTGA CTCGGCAGAT CACATCCCCA 120GAGGTTGATT CTAGCTATGG TGAGCCAATT GAGATGCTCT CATGCCCATC TGATGCTTTG 180GCTGCTGTGG TGCCTACTAT TCGGATCCCT GCGGACCAGG TGACAAGATA TTCCAAAAGA 240ATTTACATAC CAGAATTTGT TGATGGAGCA TTAAGCCACA TTGTGAATAT GGCAAGGGCT 300ATAGGGGAGC AAGTCAATGC TGGAAAAGCA GTGTGGCCTT ACGTGATACA TGGGCACTAT 360GCCGATGCTG370(2)SEQ ID No2的信息(i)序列特性(A)長度1446鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬無(vi)原始來源(A)生物體大腸桿菌(Vii)直接來源(B)克隆7F11(viii)基因組中的位置(B)圖譜位置41-42』(ix)特性(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置19..1446(C)其它信息/產物＝「海藻糖磷酸酯合成酶」/基因＝「otsA」(xi)序列描述SEQ ID No2GAGAAAATAA CAGGAGTG ATG ACT ATG AGT CGT TTA GTC GTA GTA TCT AAC51Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn1 5 10CGG ATT GCA CCA CCA GAC GAG CAC GCC GCC AGT GCC GGT GGC CTT GCC99Arg Ile Ala Pro Pro Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala15 20 25GTT GGC ATA CTG GGG GCA CTG AAA GCC GCA GGC GGA CTG TGG TTT GGC 147Val Gly Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly30 35 40TGG AGT GGT GAA ACA GGG AAT GAG GAT CAG CCG CTA AAA AAG GTG AAA 195Trp Ser Gly Glu Thr Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys45 50 55AAA GGT AAC ATT ACG TGG GCC TCT TTT AAC CTC AGC GAA CAG GAC CTT 243Lys Gly Asn Ile Thr Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu60 65 70 75GAC GAA TAC TAC AAC CAA TTC TCC AAT GCC GTT CTC TGG CCC GCT TTT 291Asp Glu Tyr Tyr Asn Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe80 85 90CAT TAT CGG CTC GAT CTG GTG CAA TTT CAG CGT CCT GCC TGG GAC GGC 339His Tyr Arg Leu Asp Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly95 100 105TAT CTA CGC GTA AAT GCG TTG CTG GCA GAT AAA TTA CTG CCG CTG TTG 387Tyr Leu Arg Val Asn Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu110 115 120CAA GAC GAT GAC ATT ATC TGG ATC CAC GAT TAT CAC CTG TTG CCA TTT 435Gln Asp Asp Asp Ile Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe125 130 135GCG CAT GAA TTA CGC AAA CGG GGA GTG AAT AAT CGC ATT GGT TTC TTT 483Ala His Glu Leu Arg Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe140 145 150 155CTG CAT ATT CCT TTC CCG ACA CCG GAA ATC TTC AAC GCG CTG CCG ACA 531Leu His Ile Pro Phe Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr160 165 170TAT GAC ACC TTG CTT GAA CAG CTT TGT GAT TAT GAT TTG CTG GGT TTC 579Tyr Asp Thr Leu Leu Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe175 180 185CAG ACA GAA AAC GAT CGT CTG GCG TTC CTG GAT TGT CTT TCT AAC CTG 627Gln Thr Glu Asn Asp Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu190 195 200ACC CGC GTC ACG ACA CGT AGC GCA AAA AGC CAT ACA GCC TGG GGC AAA 675Thr Arg Val Thr Thr Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys205 210 215GCA TTT CGA ACA GAA GTC TAC CCG ATC GGC ATT GAA CCG AAA GAA ATA 723Ala Phe Arg Thr Glu Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile220 225 230 235GCC AAA CAG GCT GCC GGG CCA CTG CCG CCA AAA CTG GCG CAA CTT AAA 771Ala Lys Gln Ala Ala Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys240 245 250GCG GAA CTG AAA AAC GTA CAA AAT ATC TTT TCT GTC GAA CGG CTG GAT 819Ala Glu Leu Lys Asn Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp255 260 265TAT TCC AAA GGT TTG CCA GAG CGT TTT CTC GCC TAT GAA GCG TTG CTG 867Tyr Ser Lys Gly Leu Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu270 275 280GAA AAA TAT CCG CAG CAT CAT GGT AAA ATT CGT TAT ACC CAG ATT GCA 915Glu Lys Tyr Pro Gln His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala285 290 295CCA ACG TCG CGT GGT GAT GTG CAA GCC TAT CAG GAT ATT CGT CAT CAG 963Pro Thr Ser Arg Gly Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln300 305 310 315CTC GAA AAT GAA GCT GGA CGA ATT AAT GGT AAA TAC GGG CAA TTA GGC 1011Leu Glu Asn Glu Ala Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly320 325 330TGG ACG CCG CTT TAT TAT TTG AAT CAG CAT TTT GAC CGT AAA TTA CTG 1059Trp Thr Pro Leu Tyr Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu335 340 345ATG AAA ATA TTC CGC TAC TCT GAC GTG GGC TTA GTG ACG CCA CTG CGT 1107Met Lys Ile Phe Arg Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg350 355 360GAC GGG ATG AAC CTG GTA GCA AAA GAG TAT GTT GCT GCT CAG GAC CCA 1155Asp Gly Met Asn Leu Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro365 370 375GCC AAT CCG GGC GTT CTT GTT CTT TCG CAA TTT GCG GGA GCG GCA AAC 1203Ala Asn Pro Gly Val Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn380 385 390 395GAG TTA ACG TCG GCG TTA ATT GTT AAC CCC TAC GAT CGT GAC GAA GTT 1251Glu Leu Thr Ser Ala Leu Ile Val Ash Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val400 405 410GCA GCT GCG CTG GAT CGT GCA TTG ACT ATG TCG CTG GCG GAA CGT ATT 1299Ala Ala Ala Leu Asp Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile415 420 425TCC CGT CAT GCA GAA ATG CTG GAC GTT ATC GTG AAA AAC GAT ATT AAC 1347Ser Arg His Ala Glu Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn430 435 440CAC TGG CAG GAG TGC TTC ATT AGC GAC CTA AAG CAG ATA GTT CCG CGA 1395His Trp Gln Glu Cys Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg445 450 455AGC GCG GAA AGC CAG CAG CGC GAT AAA GTT GCT ACC TTT CCA AAG CTT 1443Ser Ala Glu Ser Gin Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu460 465 470 475GCG 1446Ala(2)SEQ ID No3的信息(i)序列特徵(A)長度476個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓撲型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID No3Met Thr Met Ser Arg Leu Val Val Val Ser Asn Arg Ile Ala Pro Pro1 5 10 15Asp Glu His Ala Ala Ser Ala Gly Gly Leu Ala Val Gly Ile Leu Gly20 25 30Ala Leu Lys Ala Ala Gly Gly Leu Trp Phe Gly Trp Ser Gly Glu Thr35 40 45Gly Asn Glu Asp Gln Pro Leu Lys Lys Val Lys Lys Gly Asn Ile Thr50 55 60Trp Ala Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Leu Asp Glu Tyr Tyr Asn65 70 75 80Gln Phe Ser Asn Ala Val Leu Trp Pro Ala Phe His Tyr Arg Leu Asp85 90 95Leu Val Gln Phe Gln Arg Pro Ala Trp Asp Gly Tyr Leu Arg Val Asn100 105 110Ala Leu Leu Ala Asp Lys Leu Leu Pro Leu Leu Gln Asp Asp Asp Ile115 120 125Ile Trp Ile His Asp Tyr His Leu Leu Pro Phe Ala His Glu Leu Arg130 135 140Lys Arg Gly Val Asn Asn Arg Ile Gly Phe Phe Leu His Ile Pro Phe145 150 155 160Pro Thr Pro Glu Ile Phe Asn Ala Leu Pro Thr Tyr Asp Thr Leu Leu165 170 175Glu Gln Leu Cys Asp Tyr Asp Leu Leu Gly Phe Gln Thr Glu Asn Asp180 185 190Arg Leu Ala Phe Leu Asp Cys Leu Ser Asn Leu Thr Arg Val Thr Thr195 200 205Arg Ser Ala Lys Ser His Thr Ala Trp Gly Lys Ala Phe Arg Thr Glu210 215 220Val Tyr Pro Ile Gly Ile Glu Pro Lys Glu Ile Ala Lys Gln Ala Ala225 230 235 240Gly Pro Leu Pro Pro Lys Leu Ala Gln Leu Lys Ala Glu Leu Lys Asn245 250 255Val Gln Asn Ile Phe Ser Val Glu Arg Leu Asp Tyr Ser Lys Gly Leu260 265 270Pro Glu Arg Phe Leu Ala Tyr Glu Ala Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Gln275 280 285His His Gly Lys Ile Arg Tyr Thr Gln Ile Ala Pro Thr Ser Arg Gly290 295 300Asp Val Gln Ala Tyr Gln Asp Ile Arg His Gln Leu Glu Asn Glu Ala305 310 315 320Gly Arg Ile Asn Gly Lys Tyr Gly Gln Leu Gly Trp Thr Pro Leu Tyr325 330 335Tyr Leu Asn Gln His Phe Asp Arg Lys Leu Leu Met Lys Ile Phe Arg340 345 350Tyr Ser Asp Val Gly Leu Val Thr Pro Leu Arg Asp Gly Met Asn Leu355 360 365Val Ala Lys Glu Tyr Val Ala Ala Gln Asp Pro Ala Asn Pro Gly Val370 375 380Leu Val Leu Ser Gln Phe Ala Gly Ala Ala Asn Glu Leu Thr Ser Ala385 390 395 400Leu Ile Val Asn Pro Tyr Asp Arg Asp Glu Val Ala Ala Ala Leu Asp405 410 415Arg Ala Leu Thr Met Ser Leu Ala Glu Arg Ile Ser Arg His Ala Glu420 425 430Met Leu Asp Val Ile Val Lys Asn Asp Ile Asn His Trp Gln Glu Cys435 440 445Phe Ile Ser Asp Leu Lys Gln Ile Val Pro Arg Ser Ala Glu Ser Gln450 455 460Gln Arg Asp Lys Val Ala Thr Phe Pro Lys Leu Ala465 470 475(2)SEQ ID No4的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No4TCCCCATGGA ATCAAAGCAT CC(2)SEQ ID No5的信息(i)序列特徵(A)長度22鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No5GATTGGATCC AGGGCACGGCTG(2)SEQ ID No6的信息(i)序列特徵(A)長度33鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No6CTAGGTCGTGATTCTGATAC AGGTGGCCAG GTG(2)SEQ ID No7的信息(i)序列特徵(A)長度35鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型DNA(基因組)(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No7CAGCATCGGC ATAGTGCCCA TGTATCACGT AAGGC(2)SEQ ID No8的信息(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID NO8AGCTCACGAG CTCTCAGG(2)SEQ ID No9的信息(i)序列特徵(A)長度18鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No9GTGCTCGAGA GTCCTCGA(2)SEQ ID No10的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No10GATCCCCCGGGGCATGCAAG CTTG(2)SEQ ID No11的信息(i)序列特徵(A)長度24鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No11GGGGCCCCGTACGTTCGAAC CTAG(2)SEQ ID No12的信息(i)序列特徵(A)長度23鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No12GAGAAAATAC CCGGGGTGAT GAC(2)SEQ ID No13的信息(i)序列特徵(A)長度25鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No13GATAATCGTG GATCCAGATA ATGTC(2)SEQ ID No14的信息(i)序列特徵(A)長度16鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No14GATCGTCAGA TCTAGC(2)SEQ ID No15的信息(i)序列特徵(A)長度16鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No15CAGTCTAGAT CGTTAA(2)SEQ ID No16的信息(i)序列特徵(A)長度13鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No16AGCTTCCCCC CCG(2)SEQ ID No17的信息(i)序列特徵(A)長度13鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲型線性(ii)分子類型cDNA(iii)假擬是(xi)序列描述SEQ ID No17AGGGGGGGCT TAA
權利要求
1.一種植物可表達的基因，當其在植物或植物細胞中表達時可增加所述植物或植物細胞中海藻糖的含量。
2.根據權利要求1的植物可表達基因，其依次包括以下序列(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
3.根據權利要求2的植物可表達的基因，其中所述DNA序列編碼SEQIDNo.2的胺基酸序列所代表的海藻糖磷酸酯合成酶活性。
4.根據要求2的植物可表達的基因，其中編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列包括大腸桿菌otsA基因的開放閱讀框架。
5.根據權利要求2至4的植物可表達的基因，其中所述的轉錄起始位點包括編碼花椰菜花葉病毒DNA的35S RNA的啟動子區和根瘤農桿菌的胭脂氨酸合成酶基因的轉錄終止子區。
6.根據權利要求2的植物可表達的基因，它存在於pMOG799中，後者保藏在the Centraal Bureau voor Schimmelcultures，保藏號為430.93。
7.一種含有下述基因的DNA序列依次包括以下序列的植物可表達基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包括以下序列的植物可表達的基因(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少與編碼所述植物宿主中天然存在蔗糖磷酸酯合成酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
8.一種含有下述基因的DNA序列依次包括以下序列的植物可表達基團(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性地(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次包括以下序列的植物可表達基因(d)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(e)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少與編碼所述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(f)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
9.含有下述基因的DNA序列依次含有以下序列的植物可表達基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物中起作用的轉錄終止序列，和依次含有以下序列的植物可表達基因(a)在所述植物中起作用的轉錄起始區，(b)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNNA序列至少與編碼天然存在於所述植物宿主中的蔗糖磷酸酯合成酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，和依次含有以下序列的植物可表達基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)編碼一種RNA序列的DNA序列，這一RNA序列至少與編碼在所述植物宿主中天然存在的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶的RNA序列部分互補，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
10.含有根據權利要求1至6任一項中的植物可表達基因的克隆載體。
11.含有權利要求7至9任一項中DNA序列的克隆載體。
12.含有根據權利要求1至6任何一項中植物可表達基因的二分載體。
13.含權利要求7至9任一項中DNA序列的二分載體。
14.含有權利要求10至13任一項中載體的微生物。
15.根據權利要求12或13的微生物，它是農桿菌屬的微生物。
16.一種獲得具有提高的產生海藻糖能力之植物的方法，包括以下步驟(1)向植物的受體細胞中導入一種植物可表達的基因，當該基因在植物或植物細胞中表達時，可增加所述植物或植物細胞中海藻糖的含量，和依次包括以下序列的植物可表達的基因(a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，(b)在所述植物宿主中起作用的編碼選擇標記基因的DNA序列，和選擇性的(c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列，(2)在允許篩選選擇標記基因之存在的條件下，從轉化細胞生成植物。
17.一種重組植物DNA基因組，它含有植物可表達的且在該植物中非天然存在的海藻糖磷酸酯合成酶基因。
18.一種重組植物DNA基因組，其包括(a)編碼海藻糖磷酸酯合成酶的植物可表達基因，和(b)能夠抑制蔗糖磷酸酯合成酶活性生物合成的植物可表達基因。
19.一種重組植物DNA基因組，其包括(a)編碼海藻糖磷酸酯合成酶的植物可表達基因，和(b)能夠抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性生物合成的植物可表達基因。
20.一種重組植物DNA基因組，其包括(a)編碼海藻糖磷酸酯合成酶的植物可表達基因，(2)能夠抑制ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性生物合成的植物可表達的基因，及(c)能夠抑制蔗糖磷酸酯合成酶活性生物合成的植物可表達基因。
21.含有根據權利要求17至20中任一項中重組植物DNA基因組的植物細胞。
22.含有權利要求21中植物細胞的植物細胞培養物。
23.含有權利要求21中細胞的植物。
24.主要由權利要求21中細胞組成的植物。
25.由於遺傳修飾能夠產生增長水平的海藻糖的植物。
26.權利要求25的植物，其含有增長水平的海藻糖。
27.權利要求25的植物，其屬於被子植物綱。
28.權利要求27的植物，其屬於茄科。
29.權利要求28的植物，其為馬鈴薯。
30.權利要求25至29任一項中植物的一部分。
31.權利要求中的植物部分，所述部分含有增長水平的海藻糖。
32.權利要求30或32任一項的部分，其選自磷莖、花、果實、髮根、葉片、微塊莖、花粉、根、種子、莖和塊莖。
33.一種保存含有海藻糖的植物或植物部分的方法，包括以下步驟(1)培養權利要求25至26任一項中的植物，或培養權利要求29至30任一項中的植物部分，(2)收穫含有海藻糖的植物和植物部分，及(3)風乾植物或植物部分，或(4)冷凍乾燥植物或植物部分。
34.可按權利要求31的方法得到的乾燥的植物或植物部分。
35.一種生產海藻糖的方法，包括以下步驟(1)在能產生海藻糖的條件下培養權利要求25的植物，(2)收穫所述植物或其部分，(3)從所述植物或其部分中分離海藻糖。
36.分離的編碼全長海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列。
37.權利要求36的分離的DNA序列，其可從大腸桿菌中獲得。
38.權利要求35的分離的DNA序列，其可由SEQIDNo2表示。
39.一種分離的核酸序列，它編碼SEQIDNo3中的胺基酸序列。
全文摘要
本發明提供由於依次包含以下序列的植物可表達基因的存在使植物宿主中產生海藻糖的方法a)在所述植物宿主中起作用的轉錄起始區，b)編碼海藻糖磷酸酯合成酶活性的DNA序列，和選擇性的c)在所述植物宿主中起作用的轉錄終止序列。
文檔編號C12N15/82GK1129015SQ94193026
公開日1996年8月14日 申請日期1994年6月30日 優先權日1993年6月30日
發明者A·霍克馬, J·苯, M·P·道斯, P·J·M·萬登埃爾森 申請人:莫根國際公司