天然軟組織去細胞基質的製備方法與流程
2023-10-10 06:32:39 2
本發明涉及臨床醫學、生物醫學與再生醫學技術領域，尤其是涉及一種天然軟組織去細胞基質的製備方法。
背景技術：
組織由細胞和細胞外基質(ecm)組成，細胞外基質是由結構蛋白和功能性蛋白形成複雜的網架結構、支持並連接組織結構，對細胞的生理活動(遷移、分化和增殖)進行調節，完成特定的功能。
與金屬、塑料等非動物來源的材料相比，細胞基質的成分和結構更接近人體組織，生物相容性更優異，這使之成為組織工程修復中應用最為廣泛的材料。但由於細胞外基質的三維結構複雜，難以在體外重現與體內細胞外基質組成和結構一致的細胞外基質材料。通過去細胞技術將組織中的細胞成分除去，從而獲得各種天然組織的細胞外基質，是目前製備天然組織細胞外基質的有效辦法。
理想的去細胞基質材料製備方法應既能有效除去組織/器官中的細胞成分，最大程度地降低基質材料的免疫原性，又能最大程度的保持基質的三維結構和原始形態，最大程度的保留其中的有效活性分子，滿足組織再生修復的要求。
去細胞的過程就是通過物理方法、化學方法或者生物酶等方法除去基質中的細胞。去細胞方法的有效性取決於細胞類型、組織緻密程度、組織厚度和脂肪含量等。
而傳統的組織去細胞基質製備工藝容易導致基質成分和三維結構被破壞，而且試劑殘留嚴重，植入組織中可能引起嚴重的免疫排斥反應。且傳統的組織去細胞基質製備工藝需要耗費大量的時間才能讓化學去垢劑滲透至組織內部，作用於細胞，除去組織中的細胞成分，所以，去細胞效率較低。
針對現有技術中存在的上述問題，提出本發明。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種天然軟組織去細胞基質的製備方法，該方法去細胞效率高，對基質成分的破壞小，去細胞基質的免疫原性低，生物相容性好。
為解決上述技術問題，本發明採用如下技術方案：
一種天然軟組織去細胞基質的製備方法，該方法包括：取材，預處理，消毒，脫脂，酶處理，去細胞，漂洗和滅菌步驟。
優選地，所述天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織。
優選地，所述取材，預處理為將準備脫細胞的天然軟組織用生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液進行清洗，待用。
優選地，所述消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液、或新潔爾滅溶液中的一種或幾種溶液的混合液進行浸泡，再用生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液漂洗。
優選地，所述過氧乙酸溶液的濃度為0.01-0.3wt％；所述乙醇溶液的濃度為1-10％；所述新潔爾滅溶液的濃度為0.05-1wt％，所述浸泡時間為0.5-12h；所述生理鹽水的濃度為0.9wt％；所述磷酸鹽緩衝溶液ph值為7.2-7.8，濃度為0.01m。
優選地，所述脫脂為將所述天然軟組織置於脫脂劑中0.5-12h；所述脫脂劑選自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一種或多種；所述脫脂劑的用量為所述天然軟組織體積的1-30倍。
優選地，所述酶處理為將脫脂後的天然軟組織置於含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中。
優選地，所述脫脂後的天然軟組織置於含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中的時間為1-48h；所述生物酶選自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；所述生物酶的濃度為0.1-10wt％。
優選地，所述去細胞為將經過脫脂及酶處理後的天然軟組織置於含有化學去垢劑的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中。
優選地，所述化學去垢劑選自tritonx-100、tritonx-200、tween-20、tween-40、tween-60、脫氧膽酸鈉和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種；所述化學去垢劑的濃度為0.1-5wt％。
上述方法製備的天然軟組織去細胞基質。
本發明的有益效果如下：
1.脫脂處理可以將細胞膜中的脂質成分溶解除去，破壞細胞膜的完整性，有利於細胞內容物的釋放，便於後續處理中將細胞內容物更徹底地除去，降低組織基質中的免疫原性。
2.生物蛋白酶處理可以特異性地作用於基質中的蛋白成分，削弱基質成分間相互作用，讓後續的化學去垢劑更快滲透到基質內部，作用於基質細胞，從而縮短化學去垢劑滲透到基質中的時間，提高去細胞效率。
3.在生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液環境對基質進行去細胞處理，可以避免組織基質出現吸水/脫水狀態，避免改變膠原纖維的構象和排列，這樣能使組織有效地保持原始形態和三維結構，不僅能有效除去基質中細胞成分降低基質的免疫原性，更能有效保持組織基質的特定微觀結構。
附圖說明
圖1a為實施例1中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後的he染色圖；
圖1b為實施例4-1中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後的he染色圖。
圖1c為實施例4-2中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後的he染色圖。
圖1d為實施例4-3中製備得到的豬小腸黏膜下層去細胞後的he染色圖。
圖2為實施例1，實施例4-1，實施例4-2，實施例4-3的聚丙烯醯胺凝膠電泳表徵圖。
具體實施方式
下面將結合附圖對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
生物衍生材料是指天然生物組織經過特殊處理後形成的一種生物材料。近年來去細胞組織基質(acellulartissuematrix)越來越多的被用於生物衍生材料。
傳統的組織去細胞基質製備工藝容易導致基質成分和三維結構被破壞，而且試劑殘留嚴重，植入組織中可能引起嚴重的免疫排斥反應。且傳統的組織去細胞基質製備工藝需要耗費大量的時間才能讓化學去垢劑滲透至組織內部，作用於細胞，除去組織中的細胞成分，所以，去細胞效率較低。
而脫脂處理可以將細胞膜中的脂質成分溶解除去，破壞細胞膜的完整性，有利於細胞內容物的釋放，便於後續處理中將細胞內容物更徹底地除去，降低組織基質中的免疫原性；
生物蛋白酶處理可以特異性地作用於基質中的蛋白成分，削弱基質成分間相互作用，讓後續的化學去垢劑更快滲透到基質內部，作用於基質細胞，從而縮短化學去垢劑滲透到基質中的時間，提高去細胞效率；
在生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液環境對基質進行去細胞處理，可以避免組織基質出現吸水/脫水狀態，避免改變膠原纖維的構象和排列，這樣能使組織有效地保持原始形態和三維結構，不僅能有效除去基質中細胞成分降低基質的免疫原性，更能有效保持組織基質的特定微觀結構。
所以，本發明的發明人將上述手段應用於天然軟組織去細胞基質。
天然軟組織去細胞基質，以豬小腸黏膜下層為例包括如下步驟：
取材，預處理，消毒，脫脂，酶處理，去細胞，漂洗和滅菌步驟。
天然軟組織包括小腸組織，血管組織，肌肉組織，心臟組織，瓣膜組織，肺組織，脾臟組織，腎臟組織，肝臟組織，胃組織，膽囊組織，脂肪組織，軟骨組織，氣管組織，食道組織，膀胱組織，輸尿管組織，輸卵管組織或子宮組織。
在一個優選的實施方式中，預處理為將準備去細胞的天然軟組織用生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液進行清洗，待用。
在另一個優選的實施方式中，消毒為用過氧乙酸溶液、乙醇溶液或新潔爾滅溶液中一種或幾種溶液的混合液進行浸泡，再用生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液漂洗。
在一個優選的實施方式中，過氧乙酸溶液的濃度為0.01-0.3wt％；
在一個優選的實施方式中，乙醇溶液的濃度為1-10％；
在一個優選的實施方式中，新潔爾滅溶液的濃度為0.05-1wt％，
在一個優選的實施方式中，浸泡時間為0.5-12h；
在一個優選的實施方式中，生理鹽水的濃度為0.9wt％；
在一個優選的實施方式中，磷酸鹽緩衝溶液ph值為7.2-7.8，濃度為0.01m。
在一個優選的實施方式中，脫脂為將選擇的天然軟組織置於脫脂劑中0.5-12h；
本發明中，作為典型但非限制性的天然軟組織在脫脂劑中的放置時間為：0.5，1，2，2.5，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，9，9.5，10，10.5，11，11.5，12h。
在一個優選的實施方式中脫脂劑選自三氯甲烷，二氯甲烷，丙酮、二氯乙烷和乙醇中的一種或多種；
在一個優選的實施方式總，脫脂劑的用量為選擇的天然軟組織體積的1-30倍；
本發明中，作為典型但非限制性的脫脂劑的用量為選擇的天然軟組織體積的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30倍。
酶處理為將脫脂後的天然軟組織置於含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中。
在一個優選的實施方式中，天然軟組織置於含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中的時間為1-48h；本發明中，作為典型但非限制性的天然軟組織置於含有生物酶的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中的時間可以為，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40h。
在一個優選的實施方式中，生物酶選自胰蛋白酶、胃蛋白酶或磷脂酶；在一個優選的實施方式中，生物酶的濃度為0.1-10wt％，本發明中，作為典型但非限制性的生物酶的濃度，還可以為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10wt％。
在一個優選的實施方式中，去細胞為將所述組織置於含有化學去垢劑的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液中。
在一個優選的實施方式中，化學去垢劑選自tritonx-100、tritonx-200、tween-20、tween-40、tween-60、脫氧膽酸鈉和十二烷基磺酸鈉中的一種或多種；化學去垢劑的濃度優選為0.1-5wt％。
漂洗採用濃度為0.9wt％的生理鹽水或磷酸鹽緩衝溶液進行漂洗24-96h。
將漂洗乾淨後的天然軟組織基質用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy。
實施例1
對天然軟組織進行去細胞處理得到去細胞基質，以豬小腸黏膜下層為例，包括如下步驟：
取材：取豬小腸空腸段，用濃度為0.9wt％的生理鹽水清洗乾淨；
預處理：小心剝離並除去豬小腸腸壁中的漿膜層、基層，刮除黏膜層，得到豬小腸黏膜下層，用濃度為0.9wt％的生理鹽水清洗乾淨；
消毒：用含有0.02wt％過氧乙酸和5％乙醇的溶液浸泡1h，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗乾淨；
脫脂：將消毒後的豬小腸黏膜下層置於脫脂試劑中4h，脫脂試劑選用三氯甲烷，脫脂試劑總體積為豬小腸黏膜下層體積的30倍；
酶處理：將脫脂後的豬小腸黏膜下層置於含有胰蛋白酶的生理鹽水中12h，溶液濃度為0.25wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；
去細胞：將酶處理後的豬小腸黏膜下層置於含有化學去垢劑十二烷基磺酸鈉的生理鹽水中24h，其中十二烷基磺酸鈉濃度為0.3wt％，用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗；
漂洗：用濃度為0.9wt％生理鹽水漂洗經過上述各步驟處理的豬小腸黏膜下層48h；
滅菌：將漂洗乾淨後的豬小腸黏膜下層去細胞基質用γ射線進行輻照，輻照劑量為25kgy。
將實施例1中的脫脂，酶處理，去細胞三個步驟中的時間及試劑優化如下表1-3所示：
與實施例1的步驟和條件相同，不同的是脫脂步驟的時間，酶處理步驟的時間，去細胞步驟的去垢劑濃度和時間，具體情況如表1所示，
表1
與實施例1的步驟和條件相同，不同的是，脫脂步驟的時間，酶處理步驟的胰蛋白酶濃度和時間，去細胞步驟的時間，具體情況如表2所示，
表2
與實施例1的步驟和條件相同，不同的是，脫脂步驟的時間，酶處理步驟的時間，去細胞步驟的時間，化學去垢劑的選擇，具體情況如表3所示，
表3
實施例5
參考國家標準yy/t0606.25-2014分別對未經去細胞處理的豬小腸黏膜下層與實施例2-1至4-3的去細胞處理後的豬小腸黏膜下層進行了dna殘留量檢測，未經去細胞工藝處理的豬小腸黏膜下層的dna殘留量為696.53ng/mg，實施例2-1至4-3的測試結果如表4所示，經上述去細胞工藝處理後，豬小腸黏膜下層基質中的dna殘留量顯著降低。
表4不同工藝參數豬小腸黏膜下層dna殘留量
實施例6
對實施例1和實施例4-1、4-2、4-3中去細胞處理後的豬小腸黏膜下層基質進行he染色，如圖1a、圖1b、圖1c、圖1d所示，，染色結果表明，實施例1和實施例4-1、4-2、4-3中處理後的豬小腸黏膜下層中基本看不到細胞了，鏡下並未觀察到明顯差異。說明該工藝均可有效除去豬小腸黏膜下層基質中的細胞，降低基質的免疫原性。
實施例7
對實施例1和實施例4-1、4-2、4-3進行聚丙烯醯胺凝膠電泳表徵(sds-page)，如圖2所示。sds-page結果顯示，實施例1中的75kda條帶較弱，可能是該條帶位置中的蛋白丟失，而實施例4-1、4-2、4-3的蛋白條帶位置及數量基本一致，且未見條帶彌散現象出現，說明該處理工藝並未造成基質蛋白的降解，且效果優於實施例1。
最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍。