快速測定甜葉菊糖含量的方法及其專用試劑的製作方法

2023-10-10 22:00:59

專利名稱：快速測定甜葉菊糖含量的方法及其專用試劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是一種檢測方法，具體地說是一種甜葉菊糖(也稱甜菊糖、甜葉菊糖、甜葉菊糖苷、甜葉菊糖甙)含量的快速檢測方法。本發明也涉及這種檢測方法的專用試劑。
背景技術：
目前糖尿病患者逐漸增加，另外正常人過量攝取可吸收性糖也不利於身體健康，為此具有與蔗糖口感相近，同時為非吸收性糖的甜味劑開發利用是今後的發展方向。
在世界上許可添加的幾大類甜味劑中，一半來自化工合成，另一半來自於天然植物。隨著人們生活水平的不斷提高，越來越傾向於使用天然植物無能量甜味劑。
在天然植物無能量甜味劑中甜度比較高的有甜葉菊植物，其糖作為甜味劑應用也是近十幾年的事。甜葉菊植物中有7種甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(RebaudiosideA，或稱為甜菊A3Stevioside A3)。由於它們的特性而被應用於食品、保健品、藥品、化妝品、抗氧化食用商品、飼料添加劑。
隨著甜菊糖應用範圍不斷地擴大，快速檢測手段也越來越受重視。目前分析檢測方法有(1)分光光度計比色(黃海水，林靜1990；付寶忠，史立華1995；項秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄層色譜(黃雨三2003)、(3)高壓液相色譜(黃曉蘭，倪爾葭1990)、(4)毛細管電泳(邵寒娟，胡湧剛2001)等方法。薄層色譜法的化學試劑比較多，適合於小樣品的純化。高壓液相色譜法和毛細管電泳法儀器比較貴，同時要有該專業技術人員，一般甜葉菊糖加工廠不易實現。它們都不方便攜帶，在農業甜葉菊的育種和栽培生產中的隨時監控比較困難。這3種方法適合於大學及研究所對甜菊糖的研究；相比之下，分光光度計比色法操作簡單，檢測成本低，容易克服上述不足，做常規性測定易於被生產廠家所應用。
原理在煮沸的鹼性溶液中，還原糖(具有醛基或酮基)使3，5-二硝基水楊酸成棕紅色的氨基化合物，在一定範圍內，還原糖的含量和棕紅色物的顏色深淺的程度成一定比例關係。540nm波長下測定棕紅色物質的消光值，查標準曲線，可求出樣品中還原糖的含量。這是許多生物化學實驗指導書中還原糖的分光光度計比色測定方法(郝再彬等2004；入村達郎等2004)。
植物體內的還原糖主要是單糖(葡萄糖和果糖)、雙糖(麥芽糖、異麥芽糖、纖維二糖)。葡萄糖有6個碳原子、一個醛基；果糖有6個碳原子、一個酮基；麥芽糖由兩個葡萄糖分子以α-1，4-鍵相結合、含一個醛基；異麥芽糖由兩個葡萄糖分子以α-1，6-鍵相結合、含一個醛基；纖維二糖由兩個葡萄糖分子以β-1，4-鍵相結合、含一個醛基。蔗糖是非還原糖，由葡萄糖和果糖分子以α-1，2-鍵相結合，與3，5-二硝基水楊酸沒有呈色反應。
根據上述理論，我們認為相同濃度摩爾的葡萄糖和麥芽糖所含的醛基數量相同時，540nm波長下、3，5-二硝基水楊酸方法測定它們的消光值應該相等，葡萄糖和麥芽糖兩條標準曲線斜率也應該相同；然而，我們發現它們不相等，麥芽糖的消光值數據大於葡萄糖。即在麥芽糖分子中除醛基之外還有其他基團與測定試劑發生了反應，從而導致消光值數據大於葡萄糖。由此，我們利用該原理髮明了3，5-二硝基水楊酸和鐵氰化鉀方法測定甜葉菊糖。
根據上述發現，測定甜葉菊糖的發明做如下說明。
甜葉菊糖(主要是兩種成分，St和RA。St、RA的分子結構分別見圖1、2)為甜菊醇苷體與兩個配糖體(R1、R2)相結合。St的R1和R2配糖體分別是一個葡萄糖和α-1，2-鍵相結合兩個葡萄糖；RA是在St的基礎上R2配糖體除α-1，2-鍵外又增加了一個α-1，3-鍵相結合三個葡萄糖。在甜葉菊糖(St、RA)分子中無游離醛基和酮基結構，傳統的還原糖測定方法表明這種分子結構的甜葉菊糖與還原糖測定試劑沒有反應，因此也不能用於甜葉菊糖的定量分析。但是，我們發現了它們之間有反應。
另外，甜葉菊糖的粗提取物樣品中常常含有還原糖，該還原糖對甜葉菊糖定量有影響，為此發明了在不同溫度下讓它們反應，從而將它們分別定量。既用兩組樣品，加入測定試劑之後，一組樣品在50℃加熱1小時(或25℃-30℃的室溫下放置24小時)，另一組樣品在100℃加熱10分鐘。前者還原糖有呈色反應，而甜葉菊糖沒有反應；後者還原糖和甜葉菊糖都有呈色反應。
(三)

發明內容
本發明的目的在於提供一種用分光光度計比色法快速測定甜葉菊糖含量的方法。本發明的目的還在於提供快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑。
本發明的目的是這樣實現的首先配製測定用試劑，分別製備出1％葡萄糖及1％甜葉菊糖標準液母液；用母液製備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應；之後利用分光光度計在波長540nm下測定出它們的消光值，製作出濃度和消光值之間的標準曲線，得到標準曲線的計算公式；其次配製未知樣品溶液，按照製作標準曲線的方法進行；通過標準曲線或計算公式計算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。
本發明還可以包括1、所述的測定用試劑為將200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶於0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
2、所述的其測定過程為葡萄糖、甜葉菊糖標準樣品和測定用試劑在體積為5ml的離心管中搖勻，100℃水浴加熱10分鐘，取出後立即放入4℃冰箱中冷卻，之後各管在天平上以蒸餾水定重量至4.0g，加蓋後顛倒混勻；在540nm波長下，測定消光值；以濃度為橫坐標，消光值為縱坐標，分別繪製出葡萄糖、甜葉菊糖的標準曲線，求得直線方程；同時做出50℃下葡萄糖標準曲線，求得直線方程；未知樣品用同樣方法進行。
發明方法的原理甜葉菊糖(主要是兩種成分，St和RA。St、RA的分子結構分別見圖1、2)為甜菊醇苷體與兩個配糖體(R1、R2)相結合。St的R1和R2配糖體分別是一個葡萄糖和α-1，2-鍵相結合兩個葡萄糖；RA是在St的基礎上R2配糖體除α-1，2-鍵外又增加了一個α-1，3-鍵相結合三個葡萄糖。在甜葉菊糖(St、RA)分子中無游離醛基和酮基結構，但是能與測定還原糖的試劑反應，從而進行定量。甜葉菊糖的粗提取物樣品中常常含有還原糖，該還原糖對甜葉菊糖定量有影響，為此用兩組樣品，加入測定試劑之後，一組樣品在50℃加熱1小時(或25℃-30℃的室溫下放置24小時)，另一組樣品在100℃加熱10分鐘。前者還原糖有呈色反應，而甜葉菊糖沒有反應；後者還原糖和甜葉菊糖都有呈色反應。
本發明的方法可以用來測定甜葉菊糖(也稱甜菊糖、甜葉菊糖苷、甜葉菊糖甙)。
本發明的方法應用領域廣泛，可以應用於1)工業甜葉菊糖的提取、純化等工業化生產的隨時監控；2)農業在甜葉菊栽培和育種的種植中，甜葉菊糖含量質量監控；3)原料收購收購甜葉菊葉片(或莖稈)時，其中的甜葉菊糖含量測定；4)相關終端產品在食品、保健品、藥品、化妝品、添加甜葉菊糖的抗氧化商品以及飼料添加劑中，甜葉菊糖被濃縮之後用該方法測定等。


附圖是甜葉菊糖苷的分子結構。其中R是H時為St、R是葡萄糖時為RA。
(五)具體實施方案下面對本發明做更詳細的描述1.材料甜葉菊葉片或甜葉菊糖粉。
2.儀器設備分光光度計；分析天平；離心機；水浴鍋；5ml離心管；容量瓶；研缽。
3.試劑和標準液(1)測定用試劑200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與20g NaOH溶於0.8L蒸餾水中。攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)6g，結晶酚(苯酚)5g，亞硫酸鈉(Na2SO3)5g，先後於溶液中溶解。最後再加入鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)3.2g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1L，貯於棕色瓶中備用；備用試劑出現混濁時要過濾。(2)標準液80℃下烘至恆重的葡萄糖、甜葉菊糖各100mg，分別加蒸餾水溶解，定容至10ml，搖勻後置冰箱中保存備用。
4.標準曲線製備將7支5ml離心管編號，按下表所示的量精確加入濃度為10mg·mL-1的標準液和測定試劑。將各管搖勻，在100℃加熱10分鐘，取出後立即放入4℃冰箱中冷卻，之後各管在天平上以蒸餾水定重量至4g，加蓋後顛倒混勻。在540nm波長下，用0號管調零，分別讀取1～6號管的消光值。以消光值為縱坐標，濃度為橫坐標，分別繪製出葡萄糖、甜葉菊糖的標準曲線，求得直線方程。同時做出50℃下葡萄糖標準曲線，求得直線方程。
5.樣品中糖的提取準確稱取1g樣品，放在100ml的燒杯中，先以少量蒸餾水調製，然後加50ml蒸餾水，攪勻，置於50℃恆溫水浴中保溫20分鐘，使糖浸出，攪勻後於4000rpm離心10分鐘，離心的上清液收集在100ml的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為待測液。葉片樣品至少要105℃乾燥3個小時以上，再進行上述過程。
表1各試管加溶液的量管號 0 1 2 3 4 5 6標準液(μl) 0 20 40 60 80 100120水(μl) 20018016014012010080測定試劑(μl)200200200200200200200標準量(mg) 0 0.20.40.60.81.01.2定容到4.0g後標準量(mg/ml)0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30注意表中各量是根據分光光度計比色杯厚度為0.8-1.0cm設計的。
6.計算待測液的比色方法與標準曲線的方法相同。比色後根據消光值、標準曲線或計算公式即可計算出樣品中甜葉菊糖濃度。
按下式計算百分含量(1)、根據50℃下葡萄糖標準曲線方程求得50℃下還原糖量；50℃下還原糖量A(％)＝(C50)·V0(1000V1·W)-1式中C5050℃下標準曲線方程求得的還原糖量(mg)；V0提取液的體積(ml)V1顯色時吸取樣品液體積(ml)；W樣品重(g)。
(2)、根據100℃下葡萄糖標準曲線方程求出C50的消光值為B；(3)、100℃下葡萄糖和甜葉菊糖共存下的消光值為C；(4)、100℃下甜葉菊糖消光值C-B＝D；(5)、根據100℃下甜葉菊糖標準曲線方程求出甜葉菊糖百分含量；甜葉菊糖(％)＝(C100)·V0(1000V1·W)-1式中C100根據消光值D，100℃下標準曲線方程求得的甜葉菊糖(mg)；V0提取液的體積(ml)V1顯色時吸取樣品液體積(ml)；W樣品重(g)。
權利要求
1.一種快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特徵是首先配製測定用試劑，分別製備出1％葡萄糖及1％甜葉菊糖標準液母液；用母液製備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應；之後利用分光光度計在波長540nm下測定出它們的消光值，製作出濃度和消光值之間的標準曲線，得到標準曲線的計算公式；其次配製未知樣品溶液，按照製作標準曲線的方法進行；通過標準曲線或計算公式計算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。
2.根據權利要求1所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特徵是所述的測定用試劑為將200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶於0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
3.根據權利要求1或2所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法，其特徵是所述的其測定過程為葡萄糖、甜葉菊糖標準樣品和測定用試劑在體積為5ml的離心管中搖勻，100℃水浴加熱10分鐘，取出後立即放入4℃冰箱中冷卻，之後各管在天平上以蒸餾水定重量至4.0g，加蓋後顛倒混勻；在540nm波長下，測定消光值；以濃度為橫坐標，消光值為縱坐標，分別繪製出葡萄糖、甜葉菊糖的標準曲線，求得直線方程；同時做出50℃下葡萄糖標準曲線，求得直線方程；未知樣品用同樣方法進行。
4.一種快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑，其特徵是它是200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與10-30g氫氧化鈉(NaOH)溶於0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)3-9g、結晶酚(苯酚)1-8g、亞硫酸鈉(Na2SO3)1-8g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]2-5g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
5.根據權利要求4所述的快速測定甜葉菊糖含量的方法的專用試劑，其特徵是它是200g酒石酸鉀鈉(KNaC4H4O6·5H2O)與20g氫氧化鈉(NaOH)溶於0.8L蒸餾水中；攪拌加熱下，將3，5-二硝基水楊酸(DNS)6g、結晶酚(苯酚)5g、亞硫酸鈉(Na2SO3)5g，先後於溶液中溶解；最後再加入鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]3.2g使其溶解，冷卻後加蒸餾水定容至1L所得到的溶液。
全文摘要
本發明提供的是一種快速測定甜葉菊糖含量的方法及其專用試劑。首先配製測定用試劑，分別製備出1％葡萄糖及 1％甜葉菊糖標準液母液；用母液製備出不同濃度的溶液，向這些不同濃度的溶液中添加測定用試劑測定，在50℃和100℃溫度下反應；之後利用分光光度計在波長540nm下測定出它們的消光值，製作出濃度和消光值之間的標準曲線，得到標準曲線的計算公式；其次配製未知樣品溶液，按照製作標準曲線的方法進行；通過標準曲線或計算公式計算出未知樣品中甜葉菊糖濃度。本發明的方法可以用來測定甜葉菊糖；應用領域廣泛，可以應用於工業、農業、原料收購及相關終端產品等的測定。
文檔編號G01N1/28GK1731144SQ20051001027
公開日2006年2月8日 申請日期2005年8月24日 優先權日2005年8月24日
發明者郝再彬, 蒼晶, 一井真比古, 武田真 申請人:郝再彬