從麻瘋樹種子中提取分離純化佛波酯的方法
2023-10-10 15:59:54
專利名稱：從麻瘋樹種子中提取分離純化佛波酯的方法
技術領域：
本發明屬於資源植物學領域，具體說是關於大戟科資源植物中佛波酯類成分的提取分離純化方法，尤其是大戟科資源植物麻瘋樹種子中佛波酯類成分的提取分離純化方法。
背景技術：
麻瘋樹為大戟科麻瘋樹屬植物，為非洲、美洲、亞洲大部分國家和地區的有毒傳統藥用資源植物，廣泛用於各類疾病的治療，全株有毒，種子最毒，枝、葉次之。麻瘋樹在中醫藥體系中是一味有毒中藥，收載於《中藥大辭典》等著作中，常經過炮製或配伍製毒後應用 於臨床。近年來，由於其在民族民間傳統藥物，生物醫藥、生物農藥，特別是生物能源方面的重要資源價值，已受到全世界科研人員的廣泛關注。2008 2010年，學者先後在《當代藥物生物技術》(IF:3. 404)，《農業化學與食品化學雜誌》(IF:2. 469)及《毒理與環境健康評論雜誌B》(IF:3. 617)發表4篇關於麻瘋樹資源綜合利用進展的綜述論文，引用論文近200篇。四篇綜述涉及其在民族民間藥用、能源、生物活性、營養學等方面的重要進展，在文中，學者均論述「毒」是制約其利用的關鍵，其中I篇綜述就以「麻瘋樹毒性」為題。從1949年首次發現麻瘋樹毒素(毒蛋白)，到2010年甲醇純化佛波酯類的小鼠急性毒性試驗研究，麻瘋樹「毒」的研究已有近60年曆程，集中於兩大類毒性組分毒蛋白類、佛波酯類；然而這些組分同時具有顯著的生物活性，如毒蛋白的抗腫瘤、抗真菌活性，佛波酯類的抗真菌、殺滅農作物病蟲害活性等。麻瘋樹「毒」恰好是其部分生物活性的「效」，又是制約其生物活性資源利用的「毒」。 特別是近年來廣泛報導麻瘋樹中的佛波酯類成分具有顯著的生物活性或者具有潛在誘導腫瘤發生用於腫瘤誘導劑的報導，故製備其佛波酯類成分尤其是高純度的佛波酯成分顯得尤為重要，儘管有部分文獻已經開展了其佛波酯類成分的提取分離純化研究，但是由於其提取工藝路線複雜，不適合快速分離和製備出高含量的佛波酯類成分以及高純度佛波酯類單體成分。本發明的目的是提供一種簡便、快速提取獲得高含量的佛波酯類成分和高純度佛波酯類單體成分的新工藝和新方法。
發明內容
本發明的內容包括麻瘋樹種子總提取物的提取；麻瘋樹種子總佛波酯類成分的分離製備；麻瘋樹種子中佛波酯類單體成分的製備三部分。本發明的工藝方法步驟如下1.麻瘋樹種子總提取物的提取
將成熟的麻瘋樹種子自然乾燥後，直接粉碎成6(Γ80目的細粉，直接經5 10倍質量乙酸乙酯於-15 25°C靜置24 48h，期間不間斷的震搖，重複浸提2 3次，提取液並經過f 2倍體積的蒸餾水萃取2 3次，即得到富含佛波酯類成分的總提取物。
2.麻瘋樹種子總佛波酯類成分的分離
總提取物經矽膠柱層析，經石油醚、石油醚-正己烷、正己烷，正己烷-乙酸乙酯依次洗脫，收集正己烷-乙酸乙酯部分，濃縮回收溶劑，即得總佛波酯類成分。將總提取物(油狀)，直接加在預裝好的矽膠柱頂端，然後依次用4倍柱體積的石油醚、Γ3:3的石油醚-正己烷、正己燒，廣3:3正己烷-乙酸乙酯依次梯度洗脫，收集3:1正己烷-乙酸乙酯部分，矽膠柱採用溼法裝柱，固定相為100 200目的矽膠G，柱徑為5 30cm，柱高為4(T80cm。3.麻瘋樹種子中佛波酯類單體成分的製備
總佛波酯類成分，經製備HPLC分離，即得5種高純度的佛波酯類單體成分。將總佛波酯類成分，經8 2 2的乙腈-水混合溶劑溶解後，過製備HPLC柱，採用檢測波長25(T280nm波長檢測，室溫分離，流速為3 5ml/min，製備規格為l(T50mmX 10(T250mm的C8或C18柱，進行製備分離，於15、0min區間收集懼分，即得佛波酯類單體成分Factor C廣C5。所用製備柱是C8或C18柱，規格為柱徑l(T50mm，柱長為10(T250mm，填料粒徑為3. 5 4. 5 μ m0
圖I麻瘋樹種子中總佛波酯類成分的高效液相色譜圖
I表界 Jatropha Factor C1
II表界 Jatropha Factor C2TTT 表界 Jatropha Factor C3
IV表界 Jatropha Factor C4
V表界 Jatropha Factor C5
圖2麻瘋樹種子中佛波酯類單體成分的高效液相色譜圖
I表界 Jatropha Factor C1
II表界 Jatropha Factor C2TTT 表界 Jatropha Factor C3
IV表界 Jatropha Factor C4
V表界 Jatropha Factor C5
圖3麻瘋樹種子佛波酯類單體成分/airoMa Factor C1的LC-TOF-MS圖 圖4麻瘋樹種子佛波酯類單體成分/airoMa Factor C2的LC-TOF-MS圖 圖5麻瘋樹種子佛波酯類單體成分Factor C3的LC-TOF-MS圖 圖6麻瘋樹種子佛波酯類單體成分Factor C4的LC-TOF-MS圖 圖7麻瘋樹種子佛波酯類單體成分/airoMa Factor C5的LC-TOF-MS圖 具體實施例
以下實施例旨在進一步說明本發明，並不對本發明的範圍加以限制。實施例I
本實施例為麻瘋樹種子中總佛波酯類成分的提取分離方法。將乾燥的2kg麻瘋樹種子粉碎過200目篩，採用10L乙酸乙酯24h後，將冷浸液體過濾，再用10L乙酸乙酯24h後合併兩次浸提液，浸提液於大型離心機中以速率4000r/min離心20分鐘,合併上清液,取上清液水為I :1的比例進行萃取,合併乙酸乙酯相,將水相棄之，以祛除上清液中極性較強的物質，將乙酸乙酯相於旋轉蒸發儀中進行濃縮，回收乙酸乙酯以便再利用，燒瓶中剩餘的是油狀液體，約800mL，移入到容量瓶中，保存在冰箱中，取矽膠3L溶於約500mL石油醚，混勻脫氣後，裝入矽膠柱(若柱子中存在氣泡，可用洗耳球輕拍以除之);取300mL提取出的油狀液體進行上樣(動作緩慢均勻，以使樣品在柱子中的上表面水平)；洗脫液體積為柱體積的四倍即12L，因此配成7種不同濃度配比的洗脫液各12L，從極性由弱及強的順序分別是 ①石油醚12L (30-60)②石油醚正己烷=1:1的混合液12L③正己烷 12L④正己烷乙酸乙酯=3:1的混合液12L⑤正己烷乙酸乙酯=1:1的混合液12L⑥正己烷乙酸乙酯=1:3的混合液12L⑦乙酸乙酯12L依次使用以上的7種洗脫液進行柱層析，收集500mL洗脫液為一瓶，更換下一瓶。理論上可收集168瓶洗脫液，實際上因為揮發等損失收集了 163瓶，分別給每瓶編號為1，2，3……163。從瓶I開始每六瓶進行混合，旋轉濃縮，純的洗脫液回收，不純的棄之，將每次濃縮後的液體收集到IOmLEP管中保存；2 :將每個EP管中的濃縮液取O. 4mL經氮吹儀濃縮後溶於ImL甲醇做成樣品進行HPLC檢測；3 =HPLC檢測條件為柱溫30°C，流速I. OmL/min,流動相為80%乙腈(20%甲酸水(內含1%甲酸的超純水))，檢測波長280nm ;121-125瓶中(第六種洗脫液)顯示佛波酯的特徵峰，且純度相對較高，雜質峰較低。
實施例2
本實施例為麻瘋樹種子中佛波酯單體成分的分離純化方法。將提取實例中顯示佛波酯特徵峰的總佛波酯類成分經乙腈-水(8 2)溶解後，過直徑O. 45 μ m的濾膜待製備分析。製備分離色譜條件為色譜柱，C8柱(Welchrom ，5 μ m,10. OX250mm);流動相，乙腈一水(80:20);檢測波長，280nm和254nm。在島津LC-6AD型半製備液相色譜儀進行總佛波酯類成分的分離純化，分別於37. 93,45. 41,52. 36,57. 99、63. 77min收集到化合物f 5。經HPLC-UV方法對化合物I飛進行純度檢測，對不純的化合物進行重製備。化合物 I 5 經 LC/micrOTOF-Q(Agilent 1260, Bruker-micrOTOF-QII)鑑定同時參照文獻數據,分別是Factor Jatropha Factor C5。佛波酯單體成^ Jatropha Factor C1^Jatropha Factor C5經HPLC-UV方法進行純度檢測,純度分別為99. 957，98. 585，97. 416，95. 645 and 94.919 %。
權利要求
1.一種從麻瘋樹種子中提取分離純化佛波酯的方法，其特徵是將成熟的麻瘋樹種子自然乾燥後，將其粉碎後，用5 10倍質量的乙酸乙酯，於室溫條件下浸提24 48h，重複浸提2^3次，合併提取液，提取液經廣2倍體積的蒸餾水萃取2 3次，去除水萃取液後將乙酸乙酯層回收即得富含佛波酯類成分的總提取物，總提取物經矽膠柱層析，經石油醚、石油醚-正己烷、正己燒，正己烷-乙酸乙酯依次洗脫，收集正己烷-乙酸乙酯部分，濃縮回收溶劑，即得總佛波酯類成分，總佛波酯類成分經乙腈和水配比溶解後，進行製備HPLC分離，即得5種高純度的佛波酯類單體成分。
2.一種從麻瘋樹種子中提取富含佛波酯類成分的總提取物的方法，其特徵在於該方法是將成熟的麻瘋樹種子自然乾燥後，直接粉碎成6(Γ80目的細粉，直接經5 10倍質量乙酸乙酯於-15 25°C靜置24 48h，期間不間斷的震搖，重複浸提2 3次，提取液並經過f 2倍體積的蒸懼水萃取2 3次，即得到富含佛波酯類成分的總提取物。
3.一種從麻瘋樹種子中分離純化製備總佛波酯類的方法，其特徵在於該方法總提取物經矽膠柱層析，經石油醚、石油醚-正己烷、正己烷，正己烷-乙酸乙酯依次洗脫，收集正己烷-乙酸乙酯部分，濃縮回收溶劑，即得總佛波酯類成分。
4.一種從麻瘋樹種子中分離純化製備5種高純度的佛波酯類單體成分，其特徵在於該方法是將權利要求3的總佛波酯類成分，製備HPLC分離，即得5種高純度的佛波酯類單體成分。
5.根據權利要求3的方法，其特徵在於將總提取物(油狀)，直接加在預裝好的矽膠柱頂端，然後依次用4倍柱體積的石油醚、f 3:3的石油醚-正己烷、正己烷，f 3:3正己烷-乙酸乙酯依次梯度洗脫，收集3:1正己烷-乙酸乙酯部分，矽膠柱採用溼法裝柱，固定相為100 200目的矽膠G，柱徑為5 30cm，柱高為4(T80cm。
6.根據權利要求4的方法，其特徵在於將權利要求3的總總佛波酯類成分，經4 22的乙腈-水混合溶劑溶解後，過製備HPLC柱，採用檢測波長25(T280nm波長檢測，室溫分離，流速為3 5ml/min,製備規格為10 50mmX 100 250mm的C8或C18柱,進行分離製備,於15飛Omin區間收集餾分，即得佛波酯類單體成分。
7.根據權利要求書6所用製備柱是CS或C18柱，規格為柱徑l(T50mm，柱長為100 250臟，填料粒徑為3. 5 4. 5 μ m。
全文摘要
本發明公開了一種從麻瘋樹種子中提取分離純化製備佛波酯類成分的方法和應用。麻瘋樹的佛波酯類成分經過乙酸乙酯提取，並經過柱層析後獲得總佛波酯類成分，再經過半製備高效液相色譜技術製備獲得5種佛波酯單體成分。這為進一步開發利用麻瘋樹中的佛波酯類成分提供了基礎。
文檔編號C07C69/33GK102659583SQ201210112400
公開日2012年9月12日 申請日期2012年4月17日 優先權日2012年4月17日
發明者唐琳, 張偉, 王戰國, 陳放, 顏鍅, 魏磊 申請人:四川大學