核殼結構球形致孔劑及其用於製備三維細胞支架的製作方法
2023-10-04 18:00:39 2
專利名稱：核殼結構球形致孔劑及其用於製備三維細胞支架的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物材料領域，特別涉及一種核殼結構球形致孔劑及其用於製備三維細胞支架。
背景技術：
三維細胞支架為種子細胞提供生長模板，引導組織再生，控制組織或器官的形狀，它在組織工程學起著關鍵性的作用。組織工程所用的細胞支架需要具有適宜的孔隙形狀、結構、大小、孔隙率和良好的孔隙連通性。以聚乙烯醇彈性微球為致孔劑的壓濾成型/粒 子浙濾法(Qi Q Q, Chen J D , Gao S Z, et al. Preparation cell scaffolds withwell defined pore structure through elastic porogen/pressure filtration [J].Advanced materials research, 2011, 236-238:1897-1901),通過調節致孔劑大小、壓縮比例實現了控制支架內部孔隙的大小、孔隙間通道尺寸，但是，聚乙烯醇微球在微波加熱過程中不能完全除盡；製備出的聚乙烯醇微球強度低，在壓濾成型過程中，微球變形性隨空間位置變化，當支架體積較大時，支架孔隙結構的均勻性較差、重現性不高，孔隙參數不能由實驗條件調節與控制，不利於工業化生產。
發明內容
本發明的目的是為了解決壓濾成型/粒子浙濾法製備支架中致孔劑的不足，提供一種外層具有一定彈性、內層強度較高的微球，即核殼結構的致孔劑，並利用該致孔劑與壓濾成型粒子/浙濾技術結合製備孔隙結構參數可控的三維多孔細胞支架。本發明所涉及的核殼結構球形致孔劑是通過下述方法獲得其具體步驟如下 第一步在砂磨機中配製碳酸鈣/海藻酸鈉懸浮液；
第二步將第一步製得的懸浮液吸入注射器中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv,電極間距離為2cm ;流速為10mL/h,針頭內徑為0. 55mm,將液滴滴入固化液氯化鈣濃度為20%，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核，其粒徑在200-1000 u m ；
第三步將第二步製得的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於自製的沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水，篩分微粒，得到需要粒徑的微粒；
第四步稱取第三步得到需要粒徑的微粒，置於盛有EDTA溶液的燒杯中，反應至設定時間後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。本發明的另一方面是將致孔劑微球用於製備三維細胞支架，其具體步驟為 第一步配製I3DLLA支架溶液；
第二步將支架製備溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按I: I (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓；
第三步將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 1低溫環境，冷凍、固化定型18h及以上；
第四步迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h；
第五步將複合物浸入蒸餾水中30min ；
第六步將步驟⑤中的複合物取 出用刀切去上下面，浸泡在用2mol/L的EDTA溶液(PH=IO)溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次；
第七步取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔TOLLA支架。本發明所涉及的具有核殼結構的致孔劑克服了壓濾成型/粒子浙濾法製備支架中致孔劑的缺點，致孔劑的外層海藻酸鈣凝膠具有一定彈性、內層碳酸鈣/海藻酸鈣強度較高的微球，採用該種致孔劑製備的多孔支架的孔隙參數可以方便地由實驗條件調節與控制，且製備工藝適合於工業化生產。
圖I是粒徑為200-1000微米的核殼球形微球致孔劑的形貌顯微鏡照片；
圖2是致孔劑與支架材料複合物的外觀照片；
圖3是三維細胞支架的外觀；
圖4是點光源透過多孔支架；
圖5是三維支架孔隙的細胞支架的掃描電鏡圖片(28倍)；
圖6是三維支架孔隙的細胞支架的掃描電鏡圖片(100倍)；
圖7是三維支架孔隙的細胞支架的掃描電鏡圖片(301倍)。具體實施案例
下面結合附圖和實施例對本發明進一步說明如下
實施例I.
①配製CaCO3含量為2%、海藻酸鈉濃度為3%的懸浮液稱取研磨後的碳酸鈣粉末(粒度為約IOiim) 2g置於馬克杯中，加入95mL蒸餾水，用砂磨機在轉速為500r/min下砂磨Ih ；加入3g海藻酸鈉,調整轉速為100r/min,研磨30min後逐漸調高轉速至500r/min,砂磨時間4h，形成白色粘稠懸浮液，停止砂磨，密封、靜止脫泡，備用。②將步驟①中的懸浮液裝入吸入注射器5ml的注射中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv，電極間距離為2cm ;流速為10mL/h ;針頭內徑為0. 55mm ;將液滴滴入固化液(氯化鈣濃度為20%)，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核。③將步驟②中的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水。篩分微粒，得到425-600 微米。④稱取0. 2g空氣乾燥的致孔劑，置於盛有20mL、0. Olg/mL的EDTA溶液，反應至設定時間至5min後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。⑤將支架製備溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按I: I (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓，壓濾比例為30%。⑥將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 °C環境，冷凍、固化定型18h。⑦迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h。⑧將複合物浸入蒸餾水中30min。⑨將複合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10_ll的EDTA溶液溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次。⑩取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔TOLLA支架。實施例2
①配製CaCO3含量為2%、海藻酸鈉濃度為3%的懸浮液稱取研磨後的碳酸鈣粉末(粒度為約IOiim) 2g置於馬克杯中，加入95mL蒸餾水，用砂磨機在轉速為500r/min下砂磨Ih ；加入3g海藻酸鈉,調整轉速為100r/min,研磨30min後逐漸調高轉速至500r/min,砂磨時 間4h，形成白色粘稠懸浮液，停止砂磨，密封、靜止脫泡，備用。②將步驟①中的懸浮液裝入吸入注射器5ml的注射中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv，電極間距離為2cm ;流速為10mL/h ;針頭內徑為0. 55mm ;將液滴滴入固化液(氯化鈣濃度為20%)，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核。③將步驟②中的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水。篩分微粒，得到425-600 微米。④稱取0. 2g空氣乾燥的致孔劑，置於盛有20mL、0. Olg/mL的EDTA溶液，反應至設定時間至15min後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。⑤將支架製備溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按I: I (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓，壓濾比例為30%。⑥將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 °C環境，冷凍、固化定型18h。⑦迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h。⑧將複合物浸入蒸餾水中30min。⑨將複合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10_ll的EDTA溶液溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次。(&取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔I3DLLA支架。實施案例3
①配製CaCO3含量為2%、海藻酸鈉濃度為3%的懸浮液。稱取研磨後的碳酸鈣粉末(粒度為約IOiim) 2g置於馬克杯中，加入95mL蒸餾水，用砂磨機在轉速為500r/min下砂磨Ih ;加入3g海藻酸鈉,調整轉速為100r/min,研磨30min後逐漸調高轉速至500r/min,砂磨時間4h，形成白色粘稠懸浮液，停止砂磨，密封、靜止脫泡，備用。②將步驟①中的懸浮液裝入吸入注射器5ml的注射中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv，電極間距離為2cm ;流速為10mL/h ;將液滴滴入固化液(氯化鈣濃度為20%)，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核。③將步驟②中的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水。篩分得到300-425微米的致孔劑核。④稱取0. 2g空氣乾燥的致孔劑，置於盛有20mL、0. Olg/mL的EDTA溶液，反應至設定時間至15min後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。⑤將支架溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按1:1 (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓，壓濾比例為20%。⑥將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 °C環境，冷凍、固化定型18h。
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⑦迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h。⑧將複合物浸入蒸餾水中30min。⑨將複合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10_ll的EDTA溶液溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次。⑩取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔TOLLA支架。實施案例4
①配製CaCO3含量為2%、海藻酸鈉濃度為3%的懸浮液稱取研磨後的碳酸鈣粉末(粒度為約IOiim) 2g置於馬克杯中，加入95mL蒸餾水，用砂磨機在轉速為500r/min下砂磨Ih ；加入3g海藻酸鈉,調整轉速為100r/min,研磨30min後逐漸調高轉速至500r/min,砂磨時間4h，形成白色粘稠懸浮液，停止砂磨，密封、靜止脫泡，備用。②將步驟①中的懸浮液裝入吸入注射器5ml的注射中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv，電極間距離為2cm ;流速為10mL/h ;針頭內徑為0. 55mm ;將液滴滴入固化液(氯化鈣濃度為20%)，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核。③將步驟②中的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水。篩分得到425-600微米的致孔劑核。④稱取0. 2g空氣乾燥的致孔劑，置於盛有20mL、0. Olg/mL的EDTA溶液，反應至設定時間至15min後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。⑤將支架溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按1:1 (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓，壓濾比例為20%。⑥將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 °C環境，冷凍、固化定型18h。⑦迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h。⑧將複合物浸入蒸餾水中30min。
⑨將複合物取出用刀切去上下面，浸泡在2mol/L pH=10_ll的EDTA溶液溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次。⑩取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔TOLLA支架。圖2是致孔劑與支架材料複合物的外觀照片，顯示出致孔劑均勻的填充在支架的材料中。圖3是三維細胞支架的外觀。通過核殼致孔劑-壓濾成型/粒子浙析技術製備的三維支架外觀較為均勻，白皙，質地和孔隙分布均勻、結構完整。圖4是點光源透過多孔支架。從圖中可以看出有均勻的光線透過支架，證實了支架中孔隙分布均勻、孔隙間連通性好。
圖5、圖6、圖7是三維支架孔隙的細胞支架的掃描電鏡圖片。由圖5可見，支架孔隙分布均勻、形態規則，表明核殼致孔劑-壓濾成型/粒子浙濾技術可以製備出孔隙結構均勻的多孔細胞支架。由圖6圖7可以清楚地看出，支架中存在均勻分布的球形大孔以及在大孔壁上的圓形通道，大孔是由除去核殼球形微球致孔劑後形成的球形孔隙，大孔壁上的圓形通道為在壓濾成型時核殼球形致孔劑相互之間擠壓而形成的接觸面，致孔劑除去後轉化為了孔隙之間的連通通道。支架的孔隙形態與大小取決於致孔劑大小與形態；致孔劑之間的接觸保證了支架孔隙間的相互連通性。實施案例1-2製備的支架，進行外觀和微觀結構觀察，並用軟體統計孔隙通道直徑大小和孔間連通通道直徑大小，其結果為表I。表I致孔劑殼厚與孔隙參數的關係
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備註壓濾比例為30%，致孔劑粒徑為425-600 iim當致孔劑粒徑和壓濾比恆定不變時，當核殼致孔劑「殼」厚為70. 03±9. 94(100) Um時，支架孔隙直徑為438. 70± 15. 22 (8) u m，孔間通道直徑為129. 31 + 20. 61 (14) y m ;當核殼致孔劑「殼」厚為100. 85 ±7. 97(100) Pm時，支架孔隙直徑為575. 26 ±224. 60(19) u m,孔間通道直徑為208. 58±18. 30(30) Um0統計分析表明當致孔劑「殼」厚度不同時，支架中孔隙的直徑之間，以及孔間通道直徑之間均存在顯著性差異，表明支架孔隙尺寸、孔間通道直徑均與致孔劑「殼」厚度有顯著的相關關係，即支架孔隙尺寸、孔間通道直徑可以通過致孔劑「殼」厚度進行調節。綜上所述，當致孔劑粒徑和壓濾比恆定不變時，通過改變致孔劑「殼」厚度可以方便地調節三維多孔支架的孔隙尺寸、孔間通道直徑。
實施案例3-4製備的支架，進行外觀和微觀結構觀察，並用軟體統計孔隙通道直徑大小和孔間連通通道直徑大小，其結果為表I。表2不同粒徑的致孔劑與孔隙參數的關係
權利要求
1.一種核殼結構球形致孔劑，其特徵是所述的致孔劑其核為具有較高的強度的碳酸鈣/海藻酸鈣複合物，殼為具有彈性的海藻酸鈣水凝膠，該致孔劑是通過下述方法獲得，該方法具體步驟如下 第一步在砂磨機中配製碳酸鈣/海藻酸鈉懸浮液； 第二步將第一步製得的懸浮液吸入注射器中，放置於注射泵上，在高壓靜電體系中的條件為電壓在8-10kv,電極間距離為2cm ;流速為10mL/h,針頭內徑為0. 55mm,將液滴滴入固化液氯化鈣濃度為20%，固化交聯完全後，得到碳酸鈣/海藻酸鈣複合微球，即致孔劑微球的核，其粒徑在200-1000 u m ； 第三步將第二步製得的微球過濾，用蒸餾水反覆衝洗數次後，用無水乙醇除去微球表面的多餘的水分，將微球置於自製的沸騰乾燥裝置中，用壓縮空氣乾燥至無水，篩分微粒，得到需要粒徑的微粒； 第四步稱取第三步得到需要粒徑的微粒，置於盛有EDTA溶液的燒杯中，反應至設定時間後，迅速過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡lh，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。
2.如權利要求I所述的核殼結構球形致孔劑用於製備三維細胞支架的方法，其特徵是具體步驟為 第一步配製I3DLLA支架溶液； 第二步將支架製備溶液、模具、致孔劑等置於三氯甲烷/ 二氧六環(V/V=5:2)蒸汽飽和的密閉操作箱內，在操作箱內，將核殼致孔劑與支架溶液按I: I (V/V)混合均勻，轉入支架製備模具內，用分布有微孔的壓濾板對混合物施壓； 第三步將致孔劑/支架溶液複合物連同磨具迅速置於-45 1低溫環境，冷凍、固化定型18h及以上； 第四步迅速脫模後用冷凍乾燥機乾燥7 h； 第五步將複合物浸入蒸餾水中30min ； 第六步將步驟⑤中的複合物取出用刀切去上下面，浸泡在用2mol/L的EDTA溶液(PH=IO)溶解致孔劑，每12h更換一次EDTA溶液，如此反覆更換三次； 第七步取出三維支架，用蒸餾水衝洗，充分乾燥後獲得多孔TOLLA支架。
全文摘要
一種核殼結構球形致孔劑及其用於製備三維細胞支架的方法，所述的致孔劑其核為具有較高的強度的碳酸鈣/海藻酸鈣複合物，殼為具有彈性的海藻酸鈣水凝膠，該致孔劑是通過第一步在砂磨機中配製碳酸鈣/海藻酸鈉懸浮液；第二步製備致孔劑微球的核，其粒徑在200-1000μm；第三步將第二步製得的微球過濾，沸騰乾燥、篩分微粒，得到需要粒徑的微粒；第四步過濾致孔劑，並轉入20%的氯化鈣溶液中浸泡1h，過濾，用蒸餾水反覆衝洗至無游離鈣離子，即獲得核殼結構的致孔劑。用所述的核殼結構球形致孔劑可以製備出孔隙間相互連通、孔隙直徑大小和連通通道直徑可以人為控制的三維細胞支架，且操作簡便快速，適宜於工業化生產。
文檔編號A61L27/56GK102698667SQ201210202659
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月19日 優先權日2012年6月19日
發明者宋永婷, 林聰 , 王天會, 羅浩, 譚忠燕, 郭菊仙, 陳際達 申請人:重慶大學