一種凝血酶的製備方法

2023-10-05 12:40:24 1

一種凝血酶的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一種凝血酶的製備方法，其包括：過濾除去豬血漿中的雜質；加入病毒滅活試劑進行病毒滅活處理；加入吸附劑吸附凝血酶原；洗滌和浸泡吸附凝血酶原的吸附劑，再進行透析；激活經透析的溶液中的凝血酶原；將溶液的pH調節至5.2-5.6，靜置後離心，將上清液的pH調節至6.0-6.5，靜置；通過膜吸附器後，洗脫得到洗脫液；經超濾膜過濾；經濾膜過濾除菌，再經孔徑為20nm的過濾器過濾除去病毒；製成製劑。該製備方法在進一步穩定凝血酶產品的效價的基礎上，更有效地減少了凝血酶產品中的雜質及降低雜蛋白濃度，並使病毒充分滅活後被除去。
【專利說明】一種凝血酶的製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生化製藥領域，涉及一種凝血酶的製備方法，具體涉及一種有效降低 雜質和去除/滅活病毒、效價穩定的凝血酶的製備方法。

【背景技術】
[0002] 凝血酶是一種廣泛存在於人體和動物血液中的絲氨酸蛋白酶，它是血液凝血級聯 反應中的主要效應蛋白酶，顯現出促凝和抗凝的特性。當循環凝血因子在暴露的血管外組 織與組織因子相接觸時，凝血酶會在組織上聚集。凝血酶通過激活血小板催化纖維蛋白原 轉化為纖維蛋白，促進血塊穩定，從而在血栓性疾病的引發和發展中發揮核心作用。由於凝 血酶能直接作用於血液中的纖維蛋白原，促使其轉變為纖維蛋白、加速血液的凝固而止血， 因此臨床上將其用於外傷、手術、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、婦產科、消化道出血的止血，特別是 用於手術中不易結紮的小血管止血、消化道出血及外傷出血等。
[0003] 目前，臨床上應用的凝血酶主要是由人血以及豬、牛等動物血分離提取的。其中， 由於豬血來源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶產品都是由豬血製備的，少量的是 由人血及牛血等血液製備的。但是，不論是從動物血還是從人血製備的凝血酶產品，現有的 製備方法都會存在以下幾個問題：（1)凝血酶產品效價不穩定；（2)產品雜質及雜蛋白濃度 偏高；(3)存在引入各種病毒的風險，這些都會限制凝血酶產品的臨床應用，並造成安全隱 患。
[0004] 中國發明專利申請CN1031160486(以下簡稱在先專利）公開了一種豬凝血酶的 製備方法，該方法包括以下步驟：一、分離豬血漿；二、化學法病毒滅活；三、吸附凝血酶原； 四、收集凝血酶原；五、納米過濾；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的凍幹保存。該專利申請 並未公開用於病毒滅活的試劑和納米膜的種類，而且所述方法得到的產品雜質含量偏高， 其廣品的效價也有待進一步提_。


【發明內容】

[0005] 為了克服現有技術的上述缺陷，本發明的目的在於提供一種凝血酶的製備方法， 該製備方法在進一步提高凝血酶產品的效價的基礎上，更有效地去除了凝血酶產品中的雜 質並使病毒充分滅活後被除去。
[0006] 用於實現上述目的的技術方案如下：
[0007] -種凝血酶的製備方法，該製備方法包括以下步驟：
[0008] (1)過濾除去豬血漿中的雜質；
[0009] (2)向步驟（1)得到的過濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，進行病毒滅活處理；
[0010] ⑶向步驟⑵得到的經病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，吸附凝血酶原，抽 濾；
[0011] (4)以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附劑；
[0012] (5)將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡於包含117克/升氯化鈉、3克 /升檸檬酸三鈉的水溶液中，抽濾；
[0013] (6)將步驟（5)得到的濾液置於2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進行透析；
[0014] (7)將步驟（6)得到的經透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A， 再加入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌後靜置；其中，所述溶液A為以 35克/升的濃度將氯化鈣溶於9克/升的NaCl水溶液並經加熱攪拌後離心得到的上清液； 溶液B為向步驟（6)得到的經透析的溶液加入體積比為7 %的溶液A並攪拌後，加入體積比 為7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液製得的溶液；溶液C為1摩爾/升的氯化鈣水溶液； [0015] (8)將步驟（7)得到的溶液的pH調節至5. 2-5. 6,靜置後離心，將上清液的pH調 節至6. 0-6. 5,靜置；
[0016] (9)將步驟（8)得到的上清液通過膜吸附器後，洗脫得到洗脫液；
[0017] (10)將步驟（9)得到的洗脫液經超濾膜過濾；
[0018] (11)將步驟（10)得到的濾液經濾膜過濾除菌，再經孔徑為20nm的過濾器過濾除 去病毒；
[0019] (12)將步驟（11)得到溶液製成製劑。
[0020] 在上述製備方法的步驟（1)中，所述豬血漿為經過抗凝預處理的豬血漿；優選地， 所述抗凝預處理包括以下步驟：向新鮮的豬血加入抗凝劑，靜置後離心，收集上層血漿；更 優選地，所述抗凝預處理包括以下步驟：向新鮮的豬血加入體積比為1/9的抗凝劑，輕輕攪 勻，在0-10°C下靜置後，並於5-8小時內離心，離心溫度為8-15°C，離心時間為15-20分鐘， 收集上層血漿；優選地，所述抗凝劑為38克/升的檸檬酸三鈉水溶液；進一步優選地，所述 經過抗凝預處理的豬血漿在〇-l〇°C下保存0-6小時或者-18°C以下冰凍貯存二年以內備 用；優選地，所述過濾為分別經70目、100目、200目濾網過濾。
[0021] 在上述製備方法的步驟（2)中，優選地，所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3% 的磷酸三丁酯和重量比濃度為1 %的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3 %的磷酸三 丁酯和體積比濃度為1%的TritonX-100的水溶液。
[0022] 在上述製備方法的步驟（3)中，優選地，所述吸附劑為DEAE-SephadexA-50型離子 交換樹脂；優選地，所述吸附劑與血漿的質量比為〇. 5?2. 5 :1000,優選為1. 5 :1000。
[0023] 在上述製備方法的步驟（4)中，優選地，所述洗滌用溶液與血漿的比為100毫升? 200毫升：1000克，更優選為160毫升：1000克。
[0024] 在上述製備方法的步驟（5)中，優選地，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升? 60毫升：1000克，更優選為35毫升：1000克。
[0025] 在上述製備方法的步驟（6)中，優選地，所述透析用溶液與血漿的比為2500毫 升?3500毫升：1000克，更優選為3000毫升：1000克。
[0026] 在上述製備方法的步驟（8)中，優選地，採用1摩爾/升冰醋酸水溶液將pH調節 至5. 2-5. 6 ;優選地，採用飽和碳酸氫鈉溶液將pH調節至6. 0-6. 5。
[0027] 在上述製備方法的步驟（9)中，優選地，所述膜吸附器為纖維素膜吸附器，例 如SartobindQSingleSep型囊式膜吸附器；優選地，所述洗脫的洗脫劑為先用濃度為 0? 15mol/L的NaCl水溶液，再用濃度為0? 25mol/L的NaCl水溶液。
[0028] 在上述製備方法的步驟（10)中，優選地，所述超濾膜的截留分子量為10K-150K; 更優選地，所述超濾膜過濾為先用截留分子量為150K的超濾膜過濾，再用截留分子量為 10K的超濾膜過濾；進一步優選地，所述截留分子量為150K的超濾膜為截留分子量為150K 的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜，所述截留分子量為10K的超濾膜為截留分子量為10K的中 空纖維聚碸超濾膜。
[0029] 在上述製備方法的步驟（11)中，優選地，所述過濾除菌的濾膜依次為0.8ym、 0. 45um和0. 22um的聚偏二氟乙烯膜。
[0030] 在本發明的一個優選的技術方案中，所述凝血酶的製備方法包括以下步驟：
[0031] (1)在20±2°C下，分別經70目、100目、200目濾網過濾除去經過抗凝預處理豬血 漿中的雜質；
[0032] (2)向步驟⑴得到的過濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，在24°C下進行病毒滅活 處理4-6小時；所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和重量比濃度為1% 的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和體積比濃度為1 %的Triton X-100的水溶液；
[0033] (3)在20±2°C下，向步驟⑵得到的經病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，攪拌 45分鐘後靜置30分鐘以吸附凝血酶原，經200目濾布過濾後抽濾；所述吸附劑與血漿的質 量比為1. 5 :1000 ;
[0034] (4)以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到 的吸附凝血酶原的吸附劑；所述洗滌用溶液與血漿的比為160毫升：1000克；
[0035] (5)在室溫下，將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡於包含117克/升氯 化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中30分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫 升：1〇〇〇克；再將吸附劑浸泡於包含117克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中20 分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為15毫升：1000克，合併兩次的濾液；
[0036] (6)在0_4°C下，將步驟（5)得到的濾液置於2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進 行透析5-5. 5小時；所述透析用溶液與血漿的比為3000毫升：1000克；
[0037] (7)將步驟（6)得到的經透析的溶液加熱至33_36°C，加入體積比為7%的溶液A， 5分鐘後再加入體積比為7%的溶液B和體積比為7%的溶液C，攪拌15分鐘後4°C下靜置 1小時；其中，所述溶液A為以35克/升的濃度將氯化鈣溶於9克/升的NaCl水溶液，並經 加熱攪拌後離心得到的上清液；溶液B為向步驟（6)得到經透析的溶液加入體積比為7% 的溶液A並攪拌後，加入體積比為7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液製得的溶液；溶液C為 1摩爾/升的氯化鈣水溶液；
[0038] (8)採用1摩爾/升冰醋酸水溶液將步驟（7)得到的溶液的pH調節至5. 2-5. 6， 在4°C下靜置30-45分鐘後以3000轉/分鐘離心15-20分鐘，採用飽和碳酸氫鈉溶液將上 清液的pH調節至6. 0-6. 5,在4°C下靜置30-45分鐘後以3000轉/分鐘離心15-20分鐘；
[0039] (9)將步驟⑶得到的上清液以0? 4Mpa的壓力、0? 03?20升/分鐘的流速通過 膜吸附器後，先用濃度為〇.15mol/LNaCl水溶液洗滌，再用濃度為0.25mol/LNaCl水溶液 洗脫得到洗脫液；
[0040] (10)將步驟（9)得到的洗脫液pH控制為2-13,在5-45°C的溫度和不大於0. 3Mpa 壓力下先經截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜過濾，再在5-45°C的溫度和 不大於0. 12Mpa壓力下經截留分子量為10K的中空纖維聚碸超濾膜過濾，並濃縮濾液；
[0041] (11)將步驟（9)得到的濾液依次經孔徑為0.8i! m、0.45i!m和0.22i!m的聚偏二 氟乙烯膜過濾除菌，然後經孔徑為0. 1Um的濾膜預過濾，再以200 ±lOKPa的過濾壓力經孔 徑為20nm的濾器過濾除病毒；
[0042] (12)將步驟（11)得到溶液與藥學上可接受的輔料混合，經凍幹製成凍幹製劑。
[0043] 實驗結果表明，相對於現有技術，本發明的製備方法在進一步穩定凝血酶產品的 效價的基礎上，更有效地減少了凝血酶產品中的雜質，降低了雜蛋白濃度並使病毒充分滅 活後被除去，從而延長了凝血酶產品的運輸、儲存和使用周期，消除了安全隱患，更有利於 凝血酶產品在臨床上發揮療效，為廣大患者帶來益處。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中：
[0045] 圖1為本發明的凝血酶的製備方法的工藝流程圖；其中，潔淨區：溫度18_26°C;相 對溼度45-65% ;保持一定的正壓，與室外的靜壓差彡10Pa;
[0046] 圖2顯示了電泳法檢測實施例1製備的凝血酶產品的雜質含量的結果；
[0047] 圖3顯示了超濾前後的蛋白分子量分布的對比結果；其中，圖3A:超濾前；圖3B: 超濾後。

【具體實施方式】
[0048] 以下參照具體的實施例來說明本發明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅 用於說明本發明，其不以任何方式限制本發明的範圍。
[0049] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的原 料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0050] 實施例1凝血酶的製備方法
[0051] 一、生產處方
[0052] 1、豬血預處理：
[0053]

【權利要求】
1. 一種凝血酶的製備方法，該製備方法包括以下步驟： (1) 過濾除去豬血漿中的雜質； (2) 向步驟（1)得到的過濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，進行病毒滅活處理； (3) 向步驟（2)得到的經病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，吸附凝血酶原，抽濾； (4) 以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附劑； (5) 將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡於包含117克/升氯化鈉、3克/升 檸檬酸三鈉的水溶液中，抽濾； (6) 將步驟（5)得到的濾液置於2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進行透析； (7) 將步驟（6)得到的經透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A，再加 入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌後靜置；其中，所述溶液A為以35 克/升的濃度將氯化鈣溶於9克/升的NaCl水溶液並經加熱攪拌後離心得到的上清液；溶 液B為向步驟（6)得到的經透析的溶液加入體積比為7 %的溶液A並攪拌後，加入體積比為 7%的1摩爾/升的氯化鈣水溶液製得的溶液；溶液C為1摩爾/升的氯化鈣水溶液； (8) 將步驟（7)得到的溶液的pH調節至5. 2-5. 6,靜置後離心，將上清液的pH調節至 6. 0-6. 5,靜置； (9) 將步驟（8)得到的上清液通過膜吸附器後，洗脫得到洗脫液。 (10) 將步驟（9)得到的洗脫液經超濾膜過濾； (11) 將步驟（10)得到的濾液經濾膜過濾除菌，再經孔徑為20nm的過濾器過濾除去病 毒； (12) 將步驟（11)得到溶液製成製劑。
2. 根據權利要求1所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方法的步驟（1) 中，所述豬血漿為經過抗凝預處理的豬血漿；優選地，所述抗凝預處理包括以下步驟：向新 鮮的豬血加入抗凝劑，靜置後離心，收集上層血漿；更優選地，所述抗凝預處理包括以下步 驟：向新鮮的豬血加入體積比為1/9的抗凝劑，輕輕攪勻，在0-KTC下靜置後，並於5-8小 時內離心，離心溫度為8-15°C，離心時間為15-20分鐘，收集上層血漿；優選地，所述抗凝劑 為38克/升的檸檬酸三鈉水溶液；進一步優選地，所述經過抗凝預處理的豬血漿在0-KTC 下保存0-6小時或者_18°C以下冰凍貯存二年以內備用；優選地，所述過濾為分別經70目、 100目、200目濾網過濾。
3. 根據權利要求1或2所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方法的步 驟（2)中，優選地，所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0.3%的磷酸三丁酯和重量比濃度 為1%的吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和體積比濃度為1%的 Triton X-100的水溶液。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在上述製備方 法的步驟（3)中，優選地，所述吸附劑為DEAE-Sephadex A-50型離子交換樹脂；優選地，所 述吸附劑與血漿的質量比為〇. 5?2. 5 :1000,優選為1. 5 :1000。
5. 根據權利要求1至4中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方 法的步驟（4)中，優選地，所述洗滌用溶液與血漿的比為100毫升?200毫升：1000克，更 優選為160毫升：1000克。
6. 根據權利要求1至5中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方 法的步驟（5)中，優選地，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升?60毫升：1000克，更優 選為35毫升：1000克。
7. 根據權利要求1至6中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方 法的步驟（6)中，優選地，所述透析用溶液與血漿的比為2500毫升?3500毫升：1000克， 更優選為3000毫升：1000克。
8. 根據權利要求1至7中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備方 法的步驟（8)中，優選地，採用1摩爾/升冰醋酸水溶液將pH調節至5. 2-5. 6 ;優選地，採 用飽和碳酸氫鈉溶液將pH調節至6. 0-6. 5。
9. 根據權利要求1至8中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備 方法的步驟（9)中，優選地，所述膜吸附器為纖維素膜吸附器，例如Sartobind Q Singles印 型囊式膜吸附器；優選地，所述洗脫的洗脫劑為先用濃度為〇. 15mol/L的NaCl水溶液，再用 濃度為〇? 25mol/L的NaCl水溶液。
10. 根據權利要求1至9中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備 方法的步驟（10)中，所述超濾膜的截留分子量為10K-150K;優選地，所述超濾膜過濾為先 用截留分子量為150K的超濾膜過濾，再用截留分子量為10K的超濾膜過濾；進一步優選地， 所述截留分子量為150K的超濾膜為截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜，所 述截留分子量為10K的超濾膜為截留分子量為10K的中空纖維聚碸超濾膜。
11. 根據權利要求1至10中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，在所述製備 方法的步驟（10)中，所述過濾除菌的濾膜依次為0. 8iim、0. 45iim和0. 22iim的聚偏二氟 乙火布月旲。
12. 根據權利要求1至11中任一項所述的凝血酶的製備方法，其特徵在於，所述凝血酶 的製備方法包括以下步驟： (1) 在20〒2°C下，分別經70目、100目、200目濾網過濾除去經過抗凝預處理豬血漿 中的雜質； (2) 向步驟（1)得到的過濾的豬血漿加入病毒滅活試劑，在24°C下進行病毒滅活處理 4-6小時；所述病毒滅活試劑為體積比濃度為0. 3%的磷酸三丁酯和重量比濃度為1%的 吐溫-80的水溶液，或者體積比濃度為0. 3 %的磷酸三丁酯和體積比濃度為1 %的Triton X-100的水溶液； (3) 在20±2°C下，向步驟（2)得到的經病毒滅活處理的豬血漿加入吸附劑，攪拌45分 鍾後靜置30分鐘以吸附凝血酶原，經200目濾布過濾後抽濾；所述吸附劑與血漿的質量比 為 1. 5 :1000， (4) 以包含11. 7克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液洗滌步驟（3)得到的吸 附凝血酶原的吸附劑；所述洗滌用溶液與血漿的比為160毫升：1000克； (5) 在室溫下，將步驟（4)得到的吸附凝血酶原的吸附劑浸泡於包含117克/升氯化 鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中30分鐘，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為20毫升： 1000克；再將吸附劑浸泡於包含117克/升氯化鈉、3克/升檸檬酸三鈉的水溶液中20分 鍾，抽濾，所述浸泡用溶液與血漿的比為15毫升：1000克，合併兩次的濾液； (6) 在0-4°C下，將步驟（5)得到的濾液置於2. 94克/升檸檬酸三鈉水溶液中，進行透 析5-5. 5小時；所述透析用溶液與血漿的比為3000毫升：1000克； (7) 將步驟（6)得到的經透析的溶液加熱至33-36°C，加入體積比為7%的溶液A，5分 鍾後再加入體積比為7 %的溶液B和體積比為7 %的溶液C，攪拌15分鐘後4°C下靜置1小 時；其中，所述溶液A為以35克/升的濃度將氯化鈣溶於9克/升的NaCl水溶液，並經加 熱攪拌後離心得到的上清液；溶液B為向步驟（6)得到的經透析溶液加入體積比為7%的 溶液A並攪拌後，加入體積比為7 %的1摩爾/升的氯化鈣水溶液製得的溶液；溶液C為1 摩爾/升的氯化鈣水溶液； (8) 採用1摩爾/升冰醋酸水溶液將步驟（7)得到的溶液的pH調節至5. 2-5. 6,在4°C 下靜置30-45分鐘後以3000轉/分鐘離心15-20分鐘，採用飽和碳酸氫鈉溶液將上清液的 pH調節至6. 0-6. 5,在4°C下靜置30-45分鐘後以3000轉/分鐘離心15-20分鐘； (9) 將步驟（8)得到的上清液以0. 4Mpa的壓力、0. 03?20升/分鐘的流速通過膜吸 附器後，先用濃度為〇? 15mol/L NaCl水溶液洗滌，再用濃度為0? 25mol/L NaCl水溶液洗脫 得到洗脫液； (10) 將步驟（9)得到的洗脫液pH控制為2-13,在5-45°C的溫度和不大於0. 3Mpa壓力 下先經截留分子量為150K的中空纖維聚偏氟乙烯超濾膜過濾，再在5-45°C的溫度和不大 於0. 12Mpa壓力下經截留分子量為10K的中空纖維聚碸超濾膜過濾，並濃縮濾液； (11) 將步驟（9)得到的濾液依次經孔徑為0. 8 ii m、0. 45 ii m和0. 22 ii m的聚偏二氟乙 烯膜過濾除菌，然後經孔徑為0. 1 U m的濾膜預過濾，再以200 ± lOKPa的過濾壓力經孔徑為 20nm的濾器過濾除病毒； (12) 將步驟（11)得到溶液與藥學上可接受的輔料混合，經凍幹製成凍幹製劑。
【文檔編號】C12N9/74GK104328101SQ201410591661
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月27日 優先權日:2014年10月27日
【發明者】邵春傑 申請人:長春遠大國奧製藥有限公司