從大黃中提取大黃苷元的方法

2023-10-05 01:16:59

專利名稱：從大黃中提取大黃苷元的方法
技術領域：
本發明屬於中藥材大黃應用技術領域，特別涉及一種從大黃中提取大黃 苷或大黃苷元的方法及大黃苷或大黃苷元在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應 用。
背景技術：
大黃為蓼科植物掌葉大黃、唐古特大黃及藥用大黃的乾燥根及根莖，是 中醫學常用、有效的藥物之一。大黃異名黃良、火參、膚如、將軍、錦文黃、
川軍、馬蹄大黃、君支、南大黃、北大黃；性味苦寒，歸脾、胃、大腸、肝、
心包經；有瀉熱通便、涼血解毒、逐瘀通經功效，用於治療實熱便秘、積滯 腹痛、溼熱黃疸、目赤、咽腫、腸癰腹痛、跌打損傷、瘀血經閉等；其化學 成分包括蒽醌類、雙蒽酮類、苯丁酮苷類、芪苷類、萘苷類、鞣質及有關化 合物，多糖化合物等。對大黃的應用基本上是採用傳統的煎煮、炮製方法， 影響大黃中有效成分含量的因素主要包括大黃部位、生長發育時期、乾燥方 法、煎煮方法、炮製工藝。對大黃中提取的有效成分進行定量、定性分析的 常用方法為用比色法和分光光度法測定有效成分含量；用薄層色譜、分離 —反應一分離薄層色譜和薄層掃描技術對有效成分進行定性、定量分析；用 HPLC方法測定大黃有效成分的含量。
大黃近年來引起醫學界的廣泛重視，在治療中醫急症方面，人們開展了 較為深入的研究工作，其中以大黃藥理作用探討的進展尤為迅速，主要涉及 生大黃、從大黃中提取的有效成分主要包括大黃苷(由大黃素、大黃酸、大 黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、大黃二蒽酮、掌葉二蒽酮組成)和大黃苷元(大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、蘆薈大黃素、土大黃素、異大 黃素、蟲漆酸D組成)在以下方面的藥理作用(1)對中樞神經系統的作用
大黃具有解熱鎮痛作用；可影響體溫調節中樞內cAMP水平，使感染性發熱動 物的體溫下降；對家兔由於內毒素引起的發熱具有明顯的抑制作用，對發熱 時家兔血漿cAMP水平升高和cGMP降低均有抑制作用；具有抗炎作用。(2) 對心血管系統的作用大黃水煮酒沉劑靜脈給藥可使麻醉犬的血壓降低、心 肌耗氧量增加，提高心肌氧利用率；通過抑制心肌Na+—K+—ATP酶而實現強 心作用；大黃醇提液能提高離體血管條的收縮力，增強部分血管條的自發節 律活動；大黃醇提部位有明顯降低總膽固醇的作用。(3)對泌尿系統作用 大黃蒽醌衍生物能促進家兔尿素和肌酐排出體外，對氮質血症有治療作用； 大黃水提物腹腔給藥於100g左右體重大鼠，4-8 h後血清中尿素氨濃度下降 46-51%; 口服大黃水提取物，可使大鼠和病人慢性腎衰病程進展延緩，對慢 性腎衰的發展有預防作用，這可能與減輕殘餘腎間質一小管的損害有關；炮 制大黃水提取物對腎功能不全患者可改善尿毒症症狀。(4)對對消化系統作 用大黃對實驗性潰瘍有預防作用；能降低應激性潰瘍大鼠血漿cAMP水平， 使cAMP/cGMP比值恢復正常，對應激引起的植物神經功能紊亂有一定的調節 作用；具有抑制胃蛋白酶的作用，防治潰瘍病及其並發的出血之症。(5)對 肝膽系統作用:對四氯化碳引起的肝損傷有預防和治療作用；在體外對乙型肝 炎具有抑制作用；大黃蒽酮衍生物對細胞色素C P-450具有還原作用，可影 響肝臟藥物的氧化代謝功能；大黃提取物對與急性胰腺炎發病直接相關的5 種胰酶有明顯抑制作用。

發明內容
本發明目的在於提供一種從大黃中提取大黃苷或大黃苷元的方法及大黃 苷或大黃苷元在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用。
為達上述目的，本發明採用如下技術方案從大黃中提取大黃苷的方法， 依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液常溫浸泡、加熱回 流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏或者稠膏；(2)浸膏通過色譜柱，用
低濃度乙醇水溶液洗脫除去雜質，繼用高濃度乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，
減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷；或者，稠膏通過矽膠層析柱，用不同 比例的三氯甲垸與甲醇混合液梯度洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至幹，得到 大黃苷。
步驟(1)中加藥材重量6 — 16倍的重量百分比濃度40%—80%的乙醇水 溶液常溫浸泡0.5—4小時，加熱回流提取3 — 6次，每次0.5 — 3小時。
步驟(2)中，將浸膏通過聚醯胺層析柱，用4一12倍層析柱體積的重量 百分比濃度10%—60%的乙醇水溶液衝洗層析柱，棄去洗脫液，層析柱繼用重 量百分比濃度70%—95%的乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃 縮至幹得到大黃苷；或者，將浸膏用3 — 8倍重量蒸餾水分散後通過活化處理 後的大孔吸附樹脂柱，用5 — 15倍樹脂體積的蒸餾水衝洗樹脂柱，棄去衝洗 流出水液，繼用重量百分比濃度30%—95%的乙醇水溶液洗脫樹脂柱，收集洗 脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷；或者，將大黃提取稠膏，與2 一IO倍稠膏重量的矽膠拌勻後通過矽膠層析柱，用三氯甲垸與甲醇混合液梯 度洗脫，三氯甲垸與甲醇體積比為40 : 1 1 : 10，收集洗脫液，減壓回收溶 劑，並濃縮至幹，得到大黃苷。
從大黃中提取大黃苷元的方法，其特徵在於，依次包括如下步驟(1) 取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液常溫浸泡、加熱回流提取，提取液濾過、減 壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏溶於無機酸水溶液水解，水解液濾過備用；(3) 水解液通過聚醯胺層析柱，用低濃度乙醇洗脫除去雜質，繼用高濃度乙醇洗 脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹，得大黃苷元；或者，水解液濃 縮成稠膏，通過矽膠層析柱，用不同比例的三氯甲垸與甲醇混合液梯度洗脫， 收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，得大黃苷元。
步驟(1)中加藥材重量6 — 16倍的重量百分比濃度40%—80%的乙醇水 溶液常溫浸泡0.5—4小時，加熱回流提取3—6次，每次0.5 —3小時。
步驟(2)中浸膏溶於5 — 20倍浸膏重量的重量百分比濃度5%—20%的無 機酸水溶液，水浴加熱水解0.5 — 1.5小時。
步驟(3)中，水解液通過聚醯胺層析柱，用4一12倍層析柱體積的重量
百分比濃度10%—60%的乙醇水溶液衝洗層析柱，棄去洗脫液，層析柱繼用重 量百分比濃度70%—95%乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮 至幹，得大黃苷元；或者，水解液用3—8倍量蒸餾水分散後通過活化處理後 的大孔吸附樹脂柱，用5 — 15倍樹脂體積的蒸餾水衝洗樹脂柱，棄去衝洗流 出水液，繼用重量百分比濃度30%—95%的乙醇洗脫樹脂柱，使吸附於其上的 大黃苷元被完全洗脫為止，收集洗脫液，減壓回收乙醇，並濃縮至幹得到大 黃苷元；或者，將水解液濃縮為稠膏，與2_10倍稠膏重量的矽膠拌勻後通 過矽膠層析柱，用三氯甲垸與甲醇混合液梯度洗脫，三氯甲烷與甲醇體積比 為40 : 1 1 : 10，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得大黃苷元。
大黃苷或大黃苷元在製備抗腦缺血損傷藥物方面的應用，其特徵在於， 以大黃苷或大黃苷元。
本發明以在國內廣泛種植的大黃藥材為原料，原料價廉易得；以有機溶 劑(甲醇、乙醇)水溶液作為提取溶劑進行提取，原料成本低，提取效果好， 且生產過程中無三廢產生，環保效益好；提取並經無機酸(鹽酸或者硫酸) 水解後採用層析純化，所得提取物中大黃苷、大黃苷元含量高，可達90_95%。
下面通過大黃苷、大黃苷元抗腦缺血損傷的動物實驗研究證明大黃苷、 大黃苷元的抗腦缺血損傷作用
一般認為缺血後腦損傷主要涉及到自由基損傷、細胞內鈣超載、炎性細胞 因子參與反應等多個方面。本發明用大黃苷及大黃苷元對腦缺血模型大鼠進 行研究，從應用大黃苷及大黃苷元後腦缺血大鼠的病理形態學改變、神經症 狀評分、腦含水量測定、自由及和細胞因子測定、鈣離子含量測定方面對其 抗腦缺血損傷的作用及其機制進行研究，發現大黃苷及大黃苷元對腦缺血損 傷具有明顯的拮抗作用，可以改善缺血後大鼠腦的病理形態學損傷，減輕腦 缺血大鼠的神經症狀，大黃苷及大黃苷元抗腦缺血損傷的作用與其拮抗自由 基損傷、調節細胞因子紊亂、減輕鈣超載等諸多途徑有關。具體試驗如下 [材料與方法]
(1)實驗材料雄性SD大鼠，3 4月齡，140隻，體重300土50g，由 河南省實驗動物中心提供(編號2002LA—197，合格證號410117號)；尼 莫地平片劑(山東新華製藥股份有限公司生產，20mg/片，批號0012079);生 大黃粉(由河南中醫學院中藥製劑教研室鑑定)；大黃水提取物、大黃苷、大 黃苷元(均由河南中醫學院藥物分析學學科提供)。
(2) 分組與處理健康雄性SD大鼠140隻按隨機數字表法分為假手術
組、模型組、尼莫地平組、大黃粉組、大黃水提取物組、大黃苷組、大黃苷元 組，後3組又分別分為高、中、低3個劑量組。各組大鼠均於造模前5天開始 灌胃，每日一次，連續用藥5天，造模前2小時加灌1次。所有組大鼠均於術 前12h禁食不禁水。造模後4h觀察大鼠神經症狀體徵，參照神經症狀8級評 分標準記錄分值、斷頭取材。灌胃藥物均用生理鹽水配製成混懸液，藥物用量 按照大鼠與成人體表面積等效劑量比計算，灌胃體積為lml/100g。具體用量 為尼莫地平片a0,8mg' kg、 d—1)、生大黃粉(540 mg' kg—1' d"、水提取 物(43. 74 mg kg—1 d—1、 87. 48 mg kg—1 d—'、 174. 96 mg kg-1 d—')、大黃苷 (43.74 mg' kg-1' d—1、 87. 48 mg kg-1 cf1、 174. 96 mg kg—1 d—1)、大黃苷元 (6. 48 mg kg-1 d—1、 12. 96 mg kg-1 d_1、 25. 92 mg kg-1 d_1),假手術組和
模型組分別用同等體積的生理鹽水灌胃。
(3) 模型製備採用改良的Longa法製備局灶性腦缺血模型(MCAO)。
(4) 取材與樣品製備術後冰盤上迅速取出全腦，用冷生理鹽水(4°C) 衝洗3遍，除去積血，用濾紙吸去表面水份，去除嗅球、小腦和腦幹。分離大 腦半球，棄去右側大腦半球，取左側半球，從額極向後4mm處冠狀切取腦組織 3rran待做含水量測定；再向後切取約2mm迅速放入10%福馬林固定(固定24 h後更換福馬林)，待做光鏡標本，進行病理觀察。
(5) 觀察指標①神經症狀評分。造模後6h觀察大鼠神經症狀體徵， 參照評分標準進行評分，記錄分值；②腦組織含水量測定。切取的用於測 定含水量的腦組織迅速用電子天平稱取溼重(精確度為0. lmg)後放入幹 燥箱中乾燥(100°C±2'C)， 24h後稱取乾重。計算公式腦組織含水量=
(腦溼重一腦幹重)/腦溼重X100;③腦組織病理學觀察。左側腦組織用10% 甲醛固定，常規脫水，包埋，切片、HE染色，光鏡下觀察神經細胞的病理損傷； 根據腦缺血損傷的程度不同，每視野下正常神經元細胞存在的數目不同，每組
每隻大鼠分別觀察10個視野，取10個視野的均數，計算每視野下正常神經元 細胞個數(每視野參考面積306081, HEX200)。
(6)統計學處理數據用SPSS 11. 0統計分析軟體處理。計量資料 以(；)土標準差(s)表示，進行單因素方差分析。
(1) 神經症狀評分腦缺血損傷後大鼠神經症狀評分增高(5.86± 0.61);大黃苷高(2. 20±0. 77)、中(4.43±1.71)、低(2. 56±0. 70)劑量 均可降低神經症狀評分;大黃苷元高(l. 50±0. 53)、中(2. 74±1. 71)、低(3. 00 ±1.54)劑量均可降低神經症狀評分。其中以大黃苷高劑量組(174.96 mg kg—1 cf1)和大黃苷元高劑量(25. 92mg kg—1 cf1)組降低尤為顯著。
(2) 腦組織含水量腦缺血損傷後大鼠腦組織含水量增高(O. 86±2. 23); 大黃苷高(0.69±1.61)、中(0.74±1.47)、低(0.73±1.07)劑量均可降低 腦組織含水量；大黃苷元高(0. 65±2. 50)、中(0. 71±7. 75)、低(0. 72±6. 09) 劑量均可降低腦組織含水量。其中以大黃苷高劑量組(174.96 mg*kg—、d—') 和大黃苷元高劑量(25. 92mg kg—1 cf')組降低尤為顯著。
(3) 腦組織病理學觀察:腦缺血大鼠腦組織病變區域間質疏鬆，明顯水腫， 水腫區域的神經細胞、神經膠質細胞、毛細血管及小血管的周圍明顯變寬，神 經細胞變性明顯，胞漿和胞核界限不清，核仁不明顯，有的細胞核固縮，體積 變小，深染；大黃苷組(中劑量)、大黃苷元(中劑量)組的病理損傷減輕； 其中以大黃苷高劑量組和大黃苷元高劑量組病理損傷減輕最為明顯。腦缺血損 傷後腦組織正常神經元細胞數目顯著減少(50.20士6.34);大黃苷高(92.75 ±4.89)、中(73. 13±7.08)、低(83. 75±7.85)三個劑量組腦組織正常神經 元細胞數目增加；大黃苷元高(103. 88±6. 64)、中(91.50±10. 07)、低(84. 13 ±7.34)三個劑量組腦組織正常神經元細胞數目增加；其中大黃苷高劑量組
(174. 96 mg kg—1 d—1)、大黃苷元高劑量組(25. 92mg kg—' d-1)和中劑量 組(12. 96mg kg—1 cT1)增加最為顯著。通過研究，我們發現從大黃中提取的大黃苷、大黃苷元可以改善 腦缺血後的神經症狀，減輕腦組織水腫，減輕腦缺血後腦組織病理損傷，對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用，其中以大黃苷高劑量(174.96mg 'kg—1 '(f1) 和大黃苷元高劑量(25. 92mg kg 1 d—')對腦缺血損傷的保護作用尤為明顯。
本發明表明，大黃苷及大黃苷元對缺血性腦損傷具有明顯的保護作用， 可用於臨床治療缺血性腦血管疾病及血栓形成的相關性疾病。
具體實施例方式
實施例l、從大黃中提取大黃苷的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥 材重量6倍的重量百分比濃度60%的乙醇的水溶液常溫浸泡3小時，加熱回流 提取4次，每次1.5小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏或者稠膏。(2)浸膏 通過聚醯胺層析柱，用20%乙醇水溶液洗脫除去雜質，繼用80%乙醇水溶液洗 脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷。
實施例2、從大黃中提取大黃苷的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥 材重量10倍的重量百分比濃度70%的乙醇的水溶液常溫浸泡2小時，加熱回 流提取3次，每次2小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏或者稠膏。(2)浸膏 通過聚醯胺層析柱，用30%乙醇水溶液洗脫除去雜質，繼用80%乙醇水溶液洗 脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷。
實施例3、從大黃中提取大黃苷的方法，(1)取大黃藥材，粉碎為粗粉， 加藥材重量16倍的重量百分比濃度55%的乙醇的水溶液常溫浸泡1小時，加 熱回流提取5次，每次1小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏或者稠膏。(2) 將浸膏用8倍量蒸餾水分散後通過處理後的大孔吸附樹脂柱，用5倍樹脂體 積的蒸餾水衝洗樹脂柱，棄去衝洗流出水液，繼用重量百分比濃度80%的乙醇 水溶液洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷。
實施例4、從大黃中提取大黃苷元的方法，(l)取大黃藥材，粉碎為粗粉， 加藥材重量12倍的重量百分比濃度65%的乙醇水溶液常溫浸泡1. 5小時，加 熱回流提取5次，每次1.5小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏。(2)浸膏溶 於5倍浸膏重量的重量百分比濃度20%的鹽酸水溶液，水浴加熱水解30分種， 水解液濾過備用。(3)水解液通過聚醯胺層析柱，用40%乙醇洗脫除去雜質， 繼用95%乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹，得大黃苷元。
實施例5、從大黃中提取大黃苷的方法，取大黃藥材，粉碎為粗粉，加藥 材重量6倍的重量百分比濃度40%的乙醇的水溶液常溫浸泡2小時，加熱回流 提取3次，每次2小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏或者稠膏。(2)浸膏通 過聚醯胺層析柱，用30%乙醇水溶液洗脫除去雜質，繼用80%乙醇水溶液洗脫， 收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷。
實施例6、從大黃中提取大黃苷的方法，(1)取大黃藥材，粉碎為粗粉， 加藥材重量8倍的重量百分比濃度80%的乙醇的水溶液常溫浸泡1小時，加熱 回流提取5次，每次1小時，濾過，減壓回收乙醇得浸膏或者稠膏。(2)將 浸膏用8倍量蒸餾水分散後通過處理後的大孔吸附樹脂柱，用5倍樹脂體積 的蒸餾水衝洗樹脂柱，棄去衝洗流出水液，繼用重量百分比濃度80%的乙醇水 溶液洗脫樹脂柱，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹得到大黃苷。
實施例7、大黃苷膠囊，製法大黃苷提取物粉碎成細粉，加澱粉、滑石
粉混合均勻，製成顆粒，乾燥，裝入膠囊殼，即得。規格0.3g，組成大
黃苷O. 15g、澱粉O. 15g、滑石粉適量。每日服用量 一日3次、每次2粒。
實施例8、大黃苷元膠囊，製法大黃苷元提取物粉碎成細粉，加澱粉、 滑石粉混合均勻，製成顆粒，乾燥，裝入膠囊殼，即得。規格..0. 18g，組成:
大黃苷0.03g、澱粉O. 17g、滑石粉適量。每日服用量 一日3次，每次1粒。
實施例9、大黃苷片，製法大黃苷提取物粉碎成細粉，加澱粉、硬脂酸 鎂、滑石粉混合均勻，製成顆粒，壓製成片，包薄膜衣即得。規格0.3g，
組成大黃苷O. 15g、澱粉0.12g、硬脂酸鎂0.02g、滑石粉適量。每日服用
量 一日3次，每次2片。
權利要求
1、從大黃中提取大黃苷元的方法，其特徵在於，依次包括如下步驟(1)取大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液常溫浸泡、加熱回流提取，提取液濾過、減壓回收乙醇得浸膏；(2)浸膏溶於無機酸水溶液水解，水解液濾過備用；(3)水解液通過聚醯胺層析柱，用低濃度乙醇洗脫除去雜質，繼用高濃度乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹，得大黃苷元；或者，水解液濃縮成稠膏，通過矽膠層析柱，用不同比例的三氯甲烷與甲醇混合液梯度洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑至幹，得大黃苷元。
2、 如權利要求1所述的從大黃中提取大黃苷元的方法，其特徵在於，步 驟(1)中加藥材重量6 — 16倍的重量百分比濃度40。％—80%的乙醇水溶液常 溫浸泡0.5—4小時，加熱回流提取3—6次，每次0.5 — 3小時。
3、 如權利要求1或2所述的從大黃中提取大黃苷元的方法，其特徵在於， 步驟(2)中浸膏溶於5 — 20倍浸膏重量的重量百分比濃度5%—20%的無機酸 水溶液，水浴加熱水解O. 5 — 1.5小時。
4、 如權利要求3所述的從大黃中提取大黃苷元的方法，其特徵在於，步 驟(3)中，水解液通過聚醯胺層析柱，用4一12倍層析柱體積的重量百分比 濃度10%—60%的乙醇水溶液衝洗層析柱，棄去洗脫液，層析柱繼用重量百分 比濃度70%—95%乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至幹， 得大黃苷元；或者，水解液用3—8倍量蒸餾水分散後通過活化處理後的大孔 吸附樹脂柱，用5 — 15倍樹脂體積的蒸餾水衝洗樹脂柱，棄去衝洗流出水液， 繼用重量百分比濃度30%—95%的乙醇洗脫樹脂柱，使吸附於其上的大黃苷元 被完全洗脫為止，收集洗脫液，減壓回收乙醇，並濃縮至幹得到大黃苷元； 或者，將水解液濃縮為稠膏，與2 — 10倍稠膏重量的矽膠拌勻後通過矽膠層析柱，用三氯甲垸甲醇梯度洗脫，三氯甲烷與甲醇體積比為40 : i i : io，收集洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮至幹，得大黃苷元。
全文摘要
從大黃中提取大黃苷元的方法，(1)大黃藥材粉碎，加乙醇水溶液浸泡、回流提取，提取液濾過、回收乙醇得浸膏或者稠膏；(2)浸膏溶於無機酸水溶液水解，水解液濾過備用；(3)水解液過聚醯胺層析柱，用乙醇洗脫除去雜質，洗脫液減壓回收乙醇，濃縮至幹，得大黃苷元；或者，水解液濃縮成稠膏，過矽膠層析柱，用三氯甲烷與甲醇混合液梯度洗脫，洗脫液減壓回收溶劑至幹，得大黃苷元。大黃苷(元)可用於製備抗腦缺血損傷藥物。
文檔編號A61K36/185GK101342247SQ20081021008
公開日2009年1月14日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者劉敬霞, 李建生, 梁生旺, 高劍峰 申請人:河南中醫學院