從表達外來基因的蠶的繭制絲的方法及使用該方法生成的產品的製作方法

2023-10-31 06:40:07 1

專利名稱：從表達外來基因的蠶的繭制絲的方法及使用該方法生成的產品的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於從表達外來基因的蠶的繭制絲的方法及可以通過該方法獲得的產品。更具體而言，本發明涉及在從表達外來基因的蠶繭抽出蠶絲的步驟中在不導致表達外來基因的蠶繭特性喪失的同時進行繭乾燥、煮繭和繅絲的技術。
背景技術：
活繭中的蠶蛹若任其自由則會變態成蠶蛾，擠穿由繭絲構成的繭殼的繭絲，並作為蠶蛾從繭殼脫出。由於這樣會使繭無法繅絲，所以必須在蛾離開繭殼前將蛹殺死並乾燥蠶繭。通常，通過設置初始溫度至115°C或更高(在某些情況下至130°C或更高)，然後在5 至6小時內逐漸向下降低溫度至60°C來乾燥蠶繭。煮苗通常使用進行式煮苗機(progressive-type cocoon cooking machine)來進行。如下實施煮繭首先於約40°C的溫度浸泡繭絲；然後實施高溫滲透處理，包括高於 100°C的溫度的蒸汽處理；接著進行低溫滲透處理，包括將繭絲放置於約75°C的低溫部中； 然後實施蒸汽接觸處理，包括另一次蒸汽處理；此後進行調節處理，包括將溫度從沸騰溫度逐漸降低至約60°C等。如此，在煮繭中，通過用蒸汽、近沸騰熱水、和低溫水組合處理來實施蒸汽和熱水進出繭腔(cocoon cavity)的轉移。這導致繭層絲膠蛋白(一種包被繭絲的水溶性蛋白質)的膨脹和軟化，而且改善繭絲自繭的分離。在繅絲(reeling)中，通過索緒(brushing)抽出細絲末端，索緒即使用稻穗尖端從大約90°C溫度的熱水中放置的繭抽出細絲末端。此類常規制絲方法中，蠶絲蛋白質遭受高溫所致的熱變性。結果導致蠶絲的染料親和力和織物質地受到損害。近幾年來在進行含有外來蛋白質的蠶繭的生產，對在不損害外來蛋白質特性的同時從繭產生生絲的技術存在需求。下文列示本發明的現有技術文件。[現有技術文件][專利文件][專利 文件 1]Low-Temperature Chemical Cocoon Boiling Apparatus Matsumoto, Τ.，Masago, Y.，Katsuno Μ.日本實用新型申請公布號 S55-11197[專利文件 2]Vacuum Cocoon Boiler :Nishio，Μ·(授權 / 登記)日本專利號 S49-13926發明概述本發明要解決的問題本發明是鑑於上述情況完成的。本發明的目的是提供一種用於在不損害外來蛋白質特性、且不使絲心蛋白蛋白質和絲膠蛋白蛋白質遭受熱變性的同時，從表達外來基因的蠶繭產生生絲的方法。用於解決問題的手段為了解決上文所提及的問題，本發明人嘗試了在比那些常規使用的溫度條件低的溫度條件(大約80°C或更低)下，而不是迄今為止在從繭生成生絲時使用的高於100°C的條件下進行繭的乾燥。此外，在煮繭中，嘗試了在低於常規溫度的溫度且在真空條件(減壓處理)下的滲透處理，而不是常規採用的於100°c或更高的高溫蒸汽處理或用近沸點熱水的處理。作為一種備選的繭煮沸方法，嘗試了進行組合處理，包括利用鹼使絲膠蛋白膨脹， 並藉助表面活性劑、酶等使熱水滲透入繭層中。此外，本發明人嘗試了在比常規溫度低的溫度進行繅絲。結果，本發明人發現，可以在不損害表達外來基因的蠶繭中所含的外來蛋白質的特性且不使絲心蛋白蛋白質和絲膠蛋白蛋白質遭受熱變性的同時，從絲腺中表達外來基因的蠶繭生成生絲。本發明基於該發現，提供了下文所描述的[1]至[18][1], 一種從由轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其中該方法包括使用包含鹼劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液來進行真空滲透。[2], [1]的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；以及(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[3], [2]的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下乾燥所述繭。[4], [2]的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下乾燥所述繭。[5], [1]至W]中任一項的方法，其中所述鹼劑選自下組碳酸鈉和碳酸氫鈉；所述表面活性劑選自下組非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、和兩性表面活性劑；而所述酶是蛋白酶。[6], 一種從由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[7], [6]的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下乾燥所述繭。[8], [6]的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下乾燥所述繭。[9], [1]至[8]中任一項的方法，其中所述外來蛋白質選自下組螢光蛋白質、具有細胞附著活性的蛋白質、主要包含酸性和鹼性胺基酸的肽、和源自非蠶生物的絲心蛋白蛋白質和絲膠蛋白蛋白質。[10].可以通過[1]至[9]中任一項的方法獲得的生絲。[11].可以自[10]的生絲獲得的針織或梭織織物。[12].可以自[10]的生絲獲得的三維結構。[13].自[10]的生絲製成的醫學材料。[14]. [13]的醫學材料，其選自下組手術縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、 人工骨、和角膜培養的薄膜。[15]. —種產生經遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[16]. —種產生經遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。[17]. [15]或[16]的方法，其中在步驟(a)中在大約80°C或更低的條件下乾燥所述苗。[18]. [15]或[16]的方法，其中在步驟(a)中在真空條件下乾燥所述繭。附圖簡述

圖1描繪了顯示繭的乾燥百分比的時間過程變化的圖。圖2描繪了絲腺中表達外來基因的蠶繭的煮繭的實例。圖3顯示了標示使用螢光轉基因繭絲作為內部輔助材料的照片。圖4顯示了自具有細胞附著特性的轉基因繭絲製成的人工血管的照片。圖5顯示了顯示將自轉基因繭絲製成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型樹脂)製成的人工血管材料移植入大鼠後的狀態的照片。圖6顯示了顯示將自轉基因繭絲製成的人工血管材料和自PTFE(Teflon 型樹脂)生成的人工血管材料移植入大鼠後3個月的狀況的照片。
發明詳述本發明涉及用於自由絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其包括使用包含鹼劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液進行真空滲透。本發明還涉及用於產生經遺傳工程化改造的生絲的方法。更具體而言，本發明涉及用於自由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其包括下列步驟。本發明還涉及用於產生經遺傳工程化改造的生絲的方法， 其包括下列步驟(a)在大約80°C或更低的條件下、在真空條件下、或在常溫且在真空條件下乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b) 的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d) 的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。(1)由轉基因蠶所結的繭在本發明中，獲得絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶。絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶可以例如通過將編碼外來蛋白質的DNA與編碼後絲腺中特異性表達的蛋白質的 DNA(例如編碼絲心蛋白H鏈或L鏈蛋白的基因)連接，然後生成攜帶此融合基因的轉基因蠶來獲得。本領域技術人員可以依照下列文件中所描述的已知方法，例如遵循下列文件中所披露的內容來生成並獲得絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶。然而，方法不限於此。·日本專利申請特開2006-137739(未審查、公布的日本專利申請)· WO 2008/081922· Tamura, T. , Thibert, C. , Royer, C. , Kanda, Τ. , Abraham, Ε. , Kamba, Μ. , Komoto, N. , Thomas, J. L. , Mauchamp, B. , Chavancy, G. , Shirk, P. , Fraser, Μ. , Prudhomme, J. C., Couble, P. , Toshiki, Τ. , Chantal, Τ. , Corinne, R. , Toshio, K. , Eappen, Α. , Mari, K., Natuo, K. , Jean—Luc, Τ. , Bernard, Μ. , Gerard, C. , Paul, S. , Malcolm, F. , Jean-Claude, P.禾口Pierre,C. (2000)Germline transfirmation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat Biotechnol,18,81-84*Tomita,M. ,Munetsuna, H. , Sato, Τ. , Adachi, Τ. , Hino, R. , Hayashi,M. , Shimizu, K. , Nakamura, N. , Tamura, T.禾口 Yoshizato, K. (2003)Transgenicsilkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons. NatBiotechnol, 21,52-56· Yamao, Μ. , Katayama, N. , Nakazawa, H. , Yamakawa, Μ. , Hayashi, Y. , Hara, S., Kamei,K.禾口Mori,H. (1999)Gene targeting in the silkworm by use of a baculovirus. Genes Dev, 13,511-516· Kojima K. , Kuwana Y. , Sezutsu H. , Kobayashi I. , Uchino K. , Tamura Τ.,Tamada Y. (2007)New Method for Modification of Fibroin Heavy Chain Protein in Transgenic Silkworm. Biosci Biotechnol Biochem· 71，2943—2951· Kurihara H.，Sezutsu H.，Tamura Τ.，Yamada K. (2007) Production of an active feline interferon in the cocoon of transgenic silkworms using the fibroin H—chain expression system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 355,976-980· Tamura, T.，Kuwabara, K.，Uchino，K.，Kobayashi，I.禾口 Kanda，Τ. (2007) An Improved DNA Injection Method for Silkworm Eggs Drastically Increases the Efficiency of Producing Transgenic Silkworms. J. Insect Biotechnol. Sericol. 76， 155-159· Yanagisawa S.，Zhu Ζ.，Kobayashi I.，Uchino K.，Tamada Y.，Tamura Τ.， Asakura Τ. (2007)Improving Cell-Adhesive Properties of Recombinant Bombyx mori Silk by Incorporation of Collagen or Fibronectin Derived Peptides Produced by Transgenic Silkworms. Biomacromolecules 8 (11)，3487-3492 等。本發明的轉基因蠶在絲腺中具有外來蛋白質。絲腺中含有的外來蛋白質的例子包括螢光蛋白質/色蛋白諸如CFP、GFP、YFP、DsRed, K0、KikGr, KaedeJP Dronpa ；具有細胞附著活性的蛋白質諸如膠原和纖連蛋白、和細胞生長因子；主要含有酸性和鹼性胺基酸諸如天冬氨酸、穀氨酸、賴氨酸、精氨酸、和組氨酸的肽；和源自非蠶生物諸如蜘蛛、野生蠶天蠶(Antheraea yamamai)、和珍珠貝(pearl shell)的絲心蛋白蛋白質和絲膠蛋白蛋白質、 和源自其一級結構的肽；但是不限於此。若可以獲得絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶，則本領域技術人員可以容易地由此蠶獲得繭。(2)繭的乾燥在本發明中，將絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭在大約80°C或更低 (例子包括 79 V、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、73°C、72°C、和 71 °C，但不限於此)的溫度條件下乾燥。更優選地70°C或更低，甚至更優選地60°C以上及70°C以下(例子包括61°C、 62 °C、63 °C、64°C、65 °C、66 °C、67 °C、68 °C、和 69 °C，但不限於此)，且特別優選地 55 °C 以上及 65°C或以下(例子包括 56°C、57°C、58°C、59°C、60°C、6rC、62°C、63°C、和 64°C，但不限於此)的溫度條件下乾燥繭。在使用熱空氣型乾燥器的繭乾燥外，也可以使用真空型乾燥器或微波(電磁波)。繭乾燥的程度隨種類和特徵而有所不同，但是乾燥直至達到乾燥百分比36%至 44% (例子包括 36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、和 44%，但不限於此)是優選的。或者，乾燥20至24小時左右(例子包括20小時、21小時、22小時、23小時、和24小時，但不限於此)是優選的。本領域技術人員可以依照繭的特徵適當地確定乾燥百分比。例如，對於普通的蠶繭諸如「 shunrei χ syogetsu，，，42 %至43 %的乾燥百分比是合適的，但是當蛹的重量相對於繭層的重量而言較重時，可以選擇較低的乾燥百分比(例如36%至38% 左右的乾燥百分比變為可能)。在本發明中，優選在恆定的溫度條件下實施繭乾燥。在本發明中，還有可能在真空條件下，或在正常溫度且在真空條件下乾燥由絲腺中含有外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭，代替在大約80°C或更低的條件下乾燥它們。在 80°C或更低、在真空條件下、或在正常溫度且在真空條件下的乾燥，如上文所描述地，可以使用熱空氣型乾燥器，或者利用真空型乾燥器或微波(電磁波)來實施。例如，當於恆定溫度60°C乾燥繭時，如圖1中所顯示的，可以花費約M小時來達到大約45%的乾燥百分比。 因此，能夠如此獲得的繭可以不生黴地貯存。在通過此類方法乾燥繭時，必須從乾燥器快速排出來自蛹的水分。這是因為如果幹燥器內部充滿水分，繭絲分離會變差。在通過產生真空同時提高溫度來在真空條件下乾燥時，可以比僅通過熱空氣乾燥更高效地實現乾燥。(3) &鋪■劑、胃碰_、_白棚夜Φ胃泡I在本發明中，在含有鹼劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的溶液中浸泡繭。更優選地，在含有鹼劑和表面活性劑的溶液中，或在含有酶和表面活性劑的溶液中浸泡繭。本發明的鹼劑的例子包括碳酸鈉和碳酸氫鈉，但不限於此。此外，本發明的表面活性劑的例子包括非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、和兩性表面活性劑，但不限於此。非離子型表面活性劑的例子包括聚氧乙烯烷基醚、山梨聚糖脂肪酸酯、烷基多聚葡萄糖苷、脂肪酸二乙醇醯胺、和烷基單甘油酯，但不限於此。陰離子型表面活性劑的例子包括脂肪酸鈉、單烷基硫酸酯、烷基聚氧乙烯硫酸酯、 烷基苯磺酸酯、和單烷基磷酸酯，但不限於此。陽離子型表面活性劑的例子包括烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、和烷基苄基二甲基銨鹽，但不限於此。兩性表面活性劑的例子包括烷基二甲基氧化胺和烷基羧基甜菜鹼，但不限於此。
此外，本發明的酶包括蛋白酶，但不限於此。蛋白酶的例子包括絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、木瓜蛋白酶、和鹼性蛋白酶(alkalase)，但不限於此。可以例如如下實施浸泡處理，但其不限於此。將放置在金屬籃中的繭在例如 0. 15%碳酸鈉和0. 3%非離子型表面活性劑的混合溶液(處理水)中浸泡20分鐘。這導致水分可以浸入繭層表面中的條件。本領域技術人員可以依照繭的特性適當地調節碳酸鈉和表面活性劑的濃度和處理時間。在本發明中，含有酶和表面活性劑的溶液是更優選的。酶和表面活性劑的組合的例子包括可以由本文中所描述的酶和表面活性劑規定的各種組合。(4)在含有鹼齊H、表g活+牛齊Ι|、_等的溶液中的真空滲誘在本發明中，在含有鹼劑、表面活性劑、和酶中的至少一項的溶液中對蠶繭進行真空滲透。更優選地，在含有鹼劑和表面活性劑的溶液，或含有酶和表面活性劑的溶液中浸泡蠶繭。鹼劑、表面活性劑、和酶的例子是那些在上文所提及的。可以例如通過如下方法實施真空滲透處理(低壓滲透處理)。將接受浸泡處理的繭在仍處於處理水中的狀態下轉移至真空裝置，並產生真空。合適的真空度(vacuumizing degree)是-620mmHg 左右(例如 _640mmHg 至 _600mmHg，或更優選地-630mmHg 至-6IOmmHg 等)，但不限於此。例如當真空度達到-620mmHg時，歷時5至10分鐘將壓力恢復至正常壓力。這樣，處理水由於繭腔內部和外部間的壓力差而逐漸滲透入繭層中。若在此點突然恢復壓力，則處理水會試圖立即進入繭腔，繭可能由於壓力差異而崩潰。此外，因為處理水會通過繭層的薄的部分或繭層的容易透過的部分，所以有可能無法獲得均勻煮沸的繭。因此，應
9當避免突然的壓力恢復。本領域技術人員可以依照繭的特性來設置合適的壓力恢復時間。在本發明中，當上述浸泡處理在含有鹼劑和表面活性劑的溶液中進行時，優選地， 真空滲透處理也使用含有鹼劑和表面活性劑的溶液來實施。此外，當上述浸泡處理在含有酶和表面活性劑的溶液中進行時，優選地，真空滲透處理也使用含有酶和表面活性劑的溶液來實施。在本發明中，真空不限於絕對真空，而且還包括減壓。(5)真空脫水在本發明中，使用含有鹼劑、表面活性劑、和酶中的至少一項的溶液進行滲透後， 在真空中對蠶繭進行脫水。用於真空脫水的方法沒有特別限制，但是例如可以通過如下方法在真空中對繭進行脫水。將接受過真空滲透處理的繭從處理水中取出，並使用真空裝置來進行真空處理。與上文所描述的內容相似，真空度優選設置於-620mmHg左右(例子包括但不限於-640mmHg至-600mmHg，或更優選地-630mmHg至-610mmHg)，但不限於此。優選地， 此真空處理是逐漸實施的，例如歷時5至10分鐘。通過逐漸地實施真空處理，可以逐漸地將繭腔中的處理水排出至繭層外。若突然實施真空處理，則溶液會穿透繭層的薄部分或容易透過的空間，可能導致無法進行均勻的煮繭處理。(6) &鋪鹼劑、胃碰_、_白棚夜雜誘在本發明中，將真空中脫水後的繭在含有鹼劑和表面活性劑的溶液，或含有酶和表面活性劑的溶液中再次進行真空滲透處理。真空滲透處理可以通過例如上文所描述的方法來實施，但其不限於此。通過重複真空滲透和真空脫水，可以提高繭絲的解離(dissociative)特性。另一方面，重複真空滲透和真空脫水也具有不利的影響，諸如增加首次索緒的廢料和降低生絲產率。因此，依照繭的特性來調節真空滲透和真空脫水的次數是至關重要的。例如，將真空滲透、真空脫水、和真空滲透的循環實施一次或者重複兩次。如在上文中所述的那樣，對於此處理而言，同樣在通過真空處理來使處理水滲透入繭腔中的過程中優選地隨時間逐漸將壓力從真空狀態恢復至正常壓力。相似地，在通過真空處理將處理水從繭腔內部排出至外部時，優選地，花費時間來完成向真空狀態的轉變。在煮繭處理中，逐漸膨脹並軟化繭層中繭絲膠著點處的絲膠蛋白是重要的。在本發明中，鹼劑、酶等承擔膨脹和軟化絲膠蛋白的作用，而表面活性劑擔當滲透入繭層中的繭絲膠著點中的作用。當使用含有鹼基和表面活性劑的溶液來實施上述浸泡處理和真空滲透處理時，優選地，真空滲透處理也通過使用含有鹼基和表面活性劑的溶液來重複實施。或者，當使用含有酶和表面活性劑的溶液來實施上述浸泡處理和真空滲透處理時，優選地，真空滲透處理也通過使用含有酶和表面活性劑的溶液來重複實施。(7)在水中浸泡繭在本發明的方法中，接著，在水中浸泡繭。通過到(6)為止的煮繭處理所獲得的繭表面覆蓋著鹼。若置之不理，則絲膠蛋白由於粘附於繭層表面的鹼而趨於膨脹，並且索緒廢料會增加。因此，在正常溫度的水中浸泡以收斂(converge)繭層表面上的絲膠蛋白是必要的。在水中浸泡繭，直至粘附於繭層表面的鹼被除去，且繭層表面上的絲膠蛋白收斂(例如 10至20分鐘左右)。
(8)繅絲在本發明中，在60°C或更低的溫度下實施繅絲。更優選地於50°C或更低，且甚至更優選地在；35 V至45 V的條件下(例如包括；35 V、36°C、37 V、38°C、39°C、40°C、41°C、 42°〇、431、441、和451，但不限於此)實施繅絲。繅絲可以使用自動繅絲機、多頭繅絲機 (multi-end reeling machine)、$#雲力||@豐；1^$11。繅絲包括從通過上文所提及的方法進行繭層絲膠蛋白膨脹和軟化的繭抽出繭絲， 並將數根這樣的細絲與絲膠蛋白耦合來生成單股生絲。繅絲前，在大約80°C或更低的溫水中用索緒帚(一束稻穗)摩擦繭表面，並在抽出數股繭絲(這稱為索緒(brushing))後，進一步將細絲抽出，直至細絲的單一末端露出，該末端就成為正確的繭絲末端(這稱為理緒 (picking end))。將從繭(繭絲末端正確的繭)抽出的幾股繭絲集中起來到期望的粗度， 並將其穿過集緒器(cocoon filament guide button)(例如由陶瓷等製成，具有鈕扣形狀， 在中央具有小洞)。將如此獲得的生絲通過集緒器上的兩個離合輪返回到集緒器附近，將其與剛剛從集緒器產生的細絲線捻合在一起(這稱作kennel捻絲)後，纏繞在捲軸(reel) 上。手動繅絲機和多端繅絲機依照想要的細度(fineness)使用一定數目的繭(恆定數目的繭)進行繅絲，而自動繅絲機使用細度檢測儀來調節細度，使得粗度是恆定的(恆定的絲大小)°關於繅絲，可以參考文獻(Sogo Sanshigaku(General Sericultural Science),Nihon Sanshi Gakkai (Japanese Society of Sericultural Science)編第 358 頁-第 369 頁， 1979 ^Nihon Seishi Gijyutsu Shi (History of Japanese Reeling Technology)Kato, S.第 59 頁-第 144 頁，1976)。此外，本發明提供了用於從由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其包括下列(a)至(g)的步驟。本發明還提供了用於生成經遺傳工程化改造的生絲的方法，其包括下列(a)至(g)的步驟(a)在大約80°C或更低的條件下、在真空條件下、或在正常溫度且在真空條件下乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(C)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。在上述方法中，獲得轉基因蠶的繭、繭乾燥、在低溫溫水中浸泡繭、繭的真空滲透、 繭的真空脫水、繭的水中浸泡、和自繭繅絲都可以通過上文所描述的方法來實施。在本發明中，使用80°C或更低(例子包括79°C、78°C、77°C、76°C、75°C、74°C、 73°C、72°C、和71°C，但不限於此)的低溫溫水，更優選地70°C或更低(例子包括69°C、 68 °C、67 °C、66 °C、65 °C、64°C、63 °C、62 °C、和61°C，但不限於此)的低溫溫水，甚至更優選地 55 0C或更高和60 °C或更高(例子包括56 °C、57 °C、58 °C、和59 V，但不限於此)的低溫溫水。此外，本發明提供了可以通過上文所提及的方法獲得的生絲。此外，本發明提供了可以自生絲獲得的針織織物或梭織織物。另外，本發明提供了可以自生絲獲得的三維結構。 三維結構的例子包括燈罩、連衣套裝(one-piece suit)、外套、披肩等西式服飾、日本服裝(和服)、日本腰帶(寬腰帶)、西式服裝、面板(panel)、壁紙、椅子座席、名片、和書的表裝 (binding)，但不限於此。燈罩、連衣套裝、外套、披肩等西式服飾、日本服裝(和服)、日本腰帶(寬腰帶)、西式服裝、面板、壁紙、椅子座席、名片、和書的表裝等可以通過公知的方法來生產。此外，本發明提供了可以通過本發明的方法獲得的自生絲生成的醫學材料。醫學材料的例子包括手術縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、人工骨、和角膜培養薄膜，但不限於此。可以通過本領域技術人員已知的方法來實施醫學材料中使用的本發明生絲的加工。通過提及而將本說明書中所引用的所有在先技術參考文獻收入本文。 實施例在下文中，本發明會具體參照實施例進行描述，但是不應解釋為局限於此。[實施例1]使用絲腺中表達外來基因的蠶繭進行制絲1.方法1. 1乾燥步驟通常，在經過了約5. 5小時後，乾燥方法將溫度從115°C至120°C的最大溫度逐漸降低至60°C。這會得到大約42%的乾燥百分比。然而，在此實施例中，不使用溫度梯度，而將繭放置於60°C恆定溫度維持的乾燥器中，並在20至M小時內乾燥。結果，獲得了期望的乾燥百分比(圖1)。1. 2煮繭步驟在本發明中，為了在低溫(60°C或更低)條件下膨脹並軟化繭層絲膠蛋白，使用鹼劑、表面活性劑、酶等來實施煮繭。下面給出使用鹼劑和表面活性劑的實施例。首先，生成0. 1 %至0. 4%碳酸鈉和0. 2%至0. 4%非離子型表面活性劑的溶液，並將表達外來基因的蠶的繭在其中浸泡20分鐘。然後，將在真空容器中抽真空至-600mmHg， 使其在此狀態下放置，然後將壓力逐漸恢復以引起溶液向繭腔中的逐漸滲透。此後，從真空容器中的溶液取出繭，並以此狀態創建真空條件以使繭腔中的溶液脫水。這使得溶液滲透繭層繭絲的格子結構，從而使得導致繭絲膠著的絲膠蛋白得以膨脹和軟化。然後，再次將繭放進溶液中，再次創造真空條件，並將溶液滲透入繭腔中，並在完成後，使用正常溫度的水來收斂絲膠蛋白。圖2中顯示了上文所提及的步驟。1. 3繅絲步驟通常，為了從繭引出索緒廢料，將繭放置在85°C至90°C的熱水中，並當膨脹並軟化繭層表面上的絲膠蛋白的同時使用索緒帚來實施抽出繭絲的處理。此外，在繅絲中，自 40°C的繅絲槽(reeling basin)中的煮熟繭分離繭絲，並在大約60°C的氣氛下將生絲纏繞在捲軸上。在本發明中，在進行索緒和繅絲時，索緒溫度和繅絲槽溫度是50°C，而捲軸部分的溫度是40°C。2.結果表1顯示了使用絲腺中表達外來基因的蠶繭來實施繅絲的結果。常規地，通過於60°C或更低的低溫繅絲來實施繅絲是不可能的，但是通過使用本發明的方法使其變得可能。
表 權利要求
1.一種從轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其中該方法包括使用包含鹼劑、表面活性劑、酶等中的至少一種的低溫溶液來進行真空滲透。
2.權利要求1的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；以及(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
3.權利要求2的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下乾燥所述繭。
4.權利要求2的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下乾燥所述繭。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述鹼劑選自下組碳酸鈉和碳酸氫鈉；所述表面活性劑選自下組非離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、 和兩性表面活性劑；而所述酶是蛋白酶。
6.一種從在絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭產生生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
7.權利要求6的方法，其中在步驟(a)中，在大約80°C或更低的條件下乾燥所述繭。
8.權利要求6的方法，其中在步驟(a)中，在真空條件下乾燥所述繭。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述外來蛋白質選自下組螢光蛋白質、具有細胞附著活性的蛋白質、主要包含酸性和鹼性胺基酸的肽、和源自非蠶生物的絲心蛋白蛋白質和絲膠蛋白蛋白質。
10.可以通過權利要求1至9中任一項的方法獲得的生絲。
11.可以自權利要求10的生絲獲得的針織或梭織織物。
12.可以自權利要求10的生絲獲得的三維結構。
13.自權利要求10的生絲製成的醫學材料。
14.權利要求13的醫學材料，其選自下組手術縫合線、人工血管、人工皮膚、人工腱、 人工骨、和角膜培養的薄膜。
15.一種產生經遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟 (a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中浸泡步驟(a)的繭；(c)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在包含鹼劑和表面活性劑或包含酶和表面活性劑的溶液中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
16.一種產生經遺傳工程化改造的生絲的方法，其中該方法包括下列步驟(a)乾燥由絲腺中包含外來蛋白質的轉基因蠶所結的繭；(b)在低溫溫水(大約80°C或更低)中浸泡步驟(a)的繭；(c)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(b)的繭；(d)使步驟(c)的繭真空脫水；(e)在低溫溫水(大約80°C或更低)中真空滲透步驟(d)的繭；(f)在水中浸泡步驟(e)的繭；並(g)在低溫(大約50°C或更低)條件下自步驟(f)的繭繅絲。
17.權利要求15或16的方法，其中在步驟(a)中在大約80°C或更低的條件下乾燥所述苗。
18.權利要求15或16的方法，其中在步驟(a)中在真空條件下乾燥所述繭。
全文摘要
在低溫(60℃或更低)條件下，而不是在從繭生成生絲時常規採用的高於100℃的溫度的條件下乾燥繭。此外，通過於低溫進行真空滲透處理(減壓處理)，而不是常規採用的100℃以上的高溫處理或者用接近沸點的熱水處理來實施煮繭。作為一種替代的煮繭方法，實施組合處理，其包括用鹼使絲膠蛋白膨脹，並利用表面活性劑、酶等使熱水滲透入繭層中。此外，在比常規採用的溫度更低的溫度進行繅絲。結果發現，可以從表達外來基因的蠶繭生成生絲而不損害該蠶繭中所含的外來蛋白質的特性。
文檔編號D01F9/18GK102257192SQ20098015079
公開日2011年11月23日 申請日期2009年10月19日 優先權日2008年10月20日
發明者中村敬, 吉井圭, 唐澤智司, 宮崎榮子, 宮脅敦史, 山口純次, 山田勝成, 朝倉哲郎, 木下晴夫, 慄原宏徵, 桑原伸夫, 瀬筒秀樹, 田村俊樹, 町井博明, 立松謙一郎, 青木裡步, 飯塚哲也, 高林千幸 申請人:獨立行政法人農業生物資源研究所