固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀的製作方法

2023-10-19 17:31:12

固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀的製作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀。它包括鋁製散熱器、半導體致冷片、ITO玻璃加熱片、固體蛋白質樣品壓片、貼片式鉑熱電阻、高阻矽片、飛秒雷射器、斬波器、分束器、光電導天線、第一拋面鏡、分束矽片、聚四氟乙烯透鏡、延遲線、反射鏡、薄膜分束鏡、ZnTe晶體、四分之一波片、沃拉斯頓稜鏡、光電平衡探測器、鎖相放大器、溫度採集模塊、可調電源、計算機、第二拋面鏡。本實用新型可以充分利用太赫茲無損檢測的優勢，在不破壞蛋白質活性的情況下測量其熱穩定性。
【專利說明】固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀

【技術領域】
[0001]本實用新型屬於太赫茲波【技術領域】，具體涉及一種固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀。

【背景技術】
[0002]太赫茲(Terahertz or THz)波通常是指頻率在0.1?1THz區間的電磁波，其光子的能量約為I?1meV,正好與分子振動及轉動能級之間躍遷的能量大致相當。大多數極性分子如水分子、氨分子等對THz福射有強烈的吸收,許多有機大分子(DNA、蛋白質等)的振動能級和轉動能級之間的躍遷也正好在THz波段範圍。因此，物質的THz光譜(包括發射、反射和透射光譜)包含有豐富的物理質和化學信息，其吸收和色散特性可以用來做爆炸物、藥物等化學及生物樣品的探測和識別，在物理學、化學、生物醫學、天文學、材料科學和環境科學等方面具有重要的應用價值。
[0003]THz光譜和成像技術對生物分子、水、非極性物體等獨特的作用形式，可使得這種新型檢測技術在材料檢測領域取得突破。相對於近紅外和中紅外波段，THz輻射的優勢在於其波長較長，物體的散射較小，THz輻射能透射大多數非極性物體，而只有極少的介質對近紅外和中紅外輻射是透明的。同時，利用THz時域光譜技術(THz-TDS)可同時獲得樣品的折射率、吸收係數和介電常數等全面的光學參數，為定量和全面分析提供更多有用信息。
[0004]目前用於蛋白質結構研究的有示差掃描量熱法(DifferentialScanningCalorimetry, DSC)、NMR、X射線衍射、微波介電譜和各類光譜法。介電譜和光譜法具有快速、無損的特點而更具應用潛力。目前已應用到蛋白質藥物檢測的光譜法包括紫外吸收譜、可見光吸收譜、圓二色譜(CD)、螢光光譜、傅立葉變換紅外光譜(FTIR)和拉曼光譜等等。其中大部分技術缺乏提供對蛋白質功能起決定性作用的分子整體構象和分子間作用信息的能力。
[0005]人們發現反映DNA、RNA和蛋白質等生物大分子結構和構象的分子集體振動轉動能級位於THz波段，雖然我們可以用FTIR、自由電子雷射、可調諧ρ-Ge雷射和(TerahertzTime Domain Spectroscopy, THz-TDS)等多種技術得到物質的寬帶THz譜，但THz-TDS技術的出現才真正改變了 THz譜研究的面貌。THz-TDS系統不僅工作在常溫下，系統體積小，並可方便的對樣品用激勵源進行激發，光路靈活，可隨時監測。尤其是可以同時測量得到太赫茲波電場的幅度和相位，
[0006]這樣可以直接得到樣品的樣品的吸收係數和折射率，或復介電常數，比單一的吸收譜可提供更多的樣品信息。這利於對分子的振動/轉動模式進行極化響應建模，利用各種動力學理論在THz波段研究蛋白質熱變性問題。THz-TDS除了可對物質的復介電響應表徵以外，還可以進行具有時間解析度的測量，即對分子構象改變而引起的振動/轉動模式演化進行實時測量。
[0007]在研究膠原蛋白等蛋白質從室溫到120°C升溫過程THz的介電譜研究發現，可以用單一弛豫時間Debye模型擬合這些介電譜以獲得相應的弛豫時間，這些弛豫時間隨溫度升高逐漸變大，與在加熱過程中分子內部構象的解摺疊變性過程對應，並可以用Arrhenius方程擬合，得到活化能，獲得了評價蛋白質加熱變性難易程度的定量指標。並可以在此基礎上預測蛋白質藥物在不同溫度下穩定儲存時間。表明THz-TDS技術是研究蛋白質藥物熱穩定性的有力工具。


【發明內容】

[0008]本實用新型的目的是克服現有檢測固體蛋白質熱穩定性方法的不足，提供一種固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀。
[0009]固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀包括鋁製散熱器、半導體致冷片、ITO玻璃加熱片、固體蛋白質樣品壓片、貼片式鉬熱電阻、高阻矽片、飛秒雷射器、斬波器、分束器、光電導天線、第一拋面鏡、分束矽片、聚四氟乙烯透鏡、延遲線、反射鏡、薄膜分束鏡、ZnTe晶體、四分之一波片、沃拉斯頓稜鏡、光電平衡探測器、鎖相放大器、溫度採集模塊、可調電源、計算機、第二拋面鏡；高阻矽片上放置圓片形固體蛋白質樣品，在圓片形固體蛋白質樣品上緊貼ITO玻璃加熱器，在ITO玻璃加熱器上面放置半導體致冷片，ITO玻璃加熱器下表面邊緣布置貼片式鉬熱電阻，半導體致冷片的製冷面向下，在半導體致冷片的制熱面上放置鋁製散熱器；飛秒雷射器產生雷射光源，經過斬波器，被分束器分為較強的泵浦光和較弱的探測光，泵浦光射向光電導天線激發THz脈衝，THz脈衝經過經第一拋面鏡準直，被分束矽片反射，再經聚四氟乙烯透鏡聚焦入射到載有固體蛋白質樣品的高阻矽片下表面上，經高阻矽片的上下表面反射，被聚四氟乙烯透鏡準直後，再透過分束矽片，被第二拋面鏡聚焦，並透過薄膜分束鏡到達ZnTe晶體，與經過延遲線、反射鏡並被薄膜分束鏡反射的探測光匯合，探測光透過ZnTe晶體、四分之一波片、沃拉斯頓稜鏡後被光電平衡探測器探測，所測電信號被鎖相放大器放大後顯示，同時根據鉬熱電阻經溫度採集模塊採集的溫度數據控制可調電源進而控制半導體致冷片製冷或ITO玻璃加熱器制熱使蛋白質樣品穩定達到目標溫度。
[0010]本實用新型可以充分利用太赫茲無損檢測的優勢，在不破壞蛋白質活性的情況下測量其熱穩定性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀；
[0012]圖2為太赫茲脈衝垂直入射聞阻娃片時傳播不意圖；
[0013]圖3為膠原蛋白從25°C到120°C加熱變性過程(空心符號)及從120°C返回25°C的THz復介電譜(實心符號)((a)和(b)來自測量數據，(C)和(d)是單一弛豫時間Debye模型擬合)；
[0014]圖4為1η( τ )和1000/Τ(K)的關係及Arrihenius方程擬合曲線
[0015]圖中，鋁製散熱器1、半導體致冷片2、ΙΤ0玻璃加熱片3、固體蛋白質樣品壓片4、貼片式鉬熱電阻5、高阻矽片6、飛秒雷射器7、斬波器8、分束器9、光電導天線10、第一拋面鏡
11、分束矽片12、聚四氟乙烯透鏡13、延遲線14、反射鏡15、薄膜分束鏡16、ZnTe晶體17、四分之一波片18、沃拉斯頓稜鏡19、光電平衡探測器20、鎖相放大器21、溫度採集模塊22、可調電源23和第二拋面鏡24。

【具體實施方式】
[0016]如圖1所示，利用固體蛋白質熱穩定性的太赫茲譜檢測裝置包括鋁製散熱器1、半導體致冷片2、IT0玻璃加熱片3、固體蛋白質樣品壓片4、貼片式鉬熱電阻5、高阻矽片6、飛秒雷射器7、斬波器8、分束器9、光電導天線10、第一拋面鏡11、分束矽片12、聚四氟乙烯透鏡13、延遲線14、反射鏡15、薄膜分束鏡16、ZnTe晶體17、四分之一波片18、沃拉斯頓稜鏡19、光電平衡探測器20、鎖相放大器21、溫度採集模塊22、可調電源23、第二拋面鏡24 ;高阻矽片6上放置圓片形固體蛋白質樣品4，在圓片形固體蛋白質樣品4上緊貼ITO玻璃加熱器3，在ITO玻璃加熱器3上面放置半導體致冷片2，ITO玻璃加熱器3下表面邊緣布置貼片式鉬熱電阻5，半導體致冷片2的製冷面向下，在半導體致冷片2的制熱面上放置鋁製散熱器I ;飛秒雷射器7產生雷射光源，經過斬波器8，被分束器9分為較強的泵浦光和較弱的探測光，泵浦光射向光電導天線10激發THz脈衝，THz脈衝經過經第一拋面鏡11準直，被分束矽片12反射，再經聚四氟乙烯透鏡13聚焦入射到載有固體蛋白質樣品的高阻矽片6下表面上，經高阻矽片6的上下表面反射，被聚四氟乙烯透鏡13準直後，再透過分束矽片12，被第二拋面鏡25聚焦，並透過薄膜分束鏡16到達ZnTe晶體17，與經過延遲線14、反射鏡15並被薄膜分束鏡16反射的探測光匯合，探測光透過ZnTe晶體17、四分之一波片18、沃拉斯頓稜鏡19後被光電平衡探測器20探測，所測電信號被鎖相放大器21放大後顯示，同時根據鉬熱電阻5經溫度採集模塊22採集的溫度數據控制可調電源23進而控制半導體致冷片
(2)製冷或ITO玻璃加熱器3制熱使蛋白質樣品穩定達到目標溫度。
[0017]固體蛋白質熱穩定性的太赫茲譜檢測方法的步驟如下:
[0018]I)在太赫茲時域譜反射測量裝置上，探測器探測的反射信號中包含空氣矽界面反射脈衝和矽樣品界面反射脈衝兩部分，其中空氣矽界面反射脈衝為參考信號eMf(t)，矽樣品界面反射脈衝作為測量樣品信號<_的?
[0019]2)計算參考信號的傅立葉變換EMf (ω)，ω為角頻率；
[0020]3)勻值材料的實折射率η和消光係數k均為頻率的函數，用復折射率?(ω) = η(ω) -1k(m)統一表示，而對應的復介電常數為Α? = ?..'(Λ)) + /'￡."(ω} = 52(Λ>)，太赫茲波在材料毛(圳中的傳播係數為= e p'mJ，在材料S3(CP)和界面的透射和反
? 一2 η
射係數為Λβ?>(?!) = ^^和=在折射率為運(的的氮氣中太赫茲波正入射厚度為Cl1的聞阻娃片，聞阻娃片的折射率為乓(?)，與聞阻娃片緊貼蛋白質樣品的折射率為ηΛω)，得到參考信號和樣品信號之間傳輸函數的理論模型
[0021 ] f 『 (1)
Eni (ω) Rm { c J
[0022]其中Ttll為氮氣到矽片的透射係數，T10為矽片到氮氣的透射係數，R01為氮氣到矽片的反射係數，R12為矽片到蛋白質樣品的反射係數；
[0023]4)利用參考信號的傅立葉變換Em(ω)和傳輸函數HtheOTy(co)重建樣品信號
[0024]e:m,XO = ^f(2)
2π..
[0025]5)用單一弛豫時間Debye介電馳豫模型來表徵固態蛋白質分子在溫度變化過程中由於分子結構改變導致的介電弛豫響應過程，其表達式為
[0026]ε{ω) = s.+......-(3)

ι + ιωτ
[0027]其中es為直流介電常數，ε⑵為高頻介電常數，τ為馳豫時間，
[0028]蛋白質在溫度升高時越過能壘Λ Ε，對應一個激活反應，相應分子結構變化和鍵的破壞與重排導致偶極子運動變化，則弛豫時間τ描述為:
[0029]T = roe.'L kJ(,
[0030]其中kb是玻爾茲曼常數，T為絕對溫度，^稱為指前因子，Λ E稱為活化能，在蛋白質加熱變性過程中τ符合Arrhenius方程描述的規律，活化能ΛΕ作為固體蛋白質熱穩定性的衡量指標；
[0031]6)假設高阻矽片的吸收率為零，取折射率Ii1 = 3.42，通過公式(I)得到蛋白質樣品折射率和吸收係數的為
Ii /2, (I — R~)/ r V
[0032]Ilj: ?~?---.(5)
2 l-f r+2/?cos#
[0033]k!、].(6)
2 !---R- + 2/? cos^

r> ,.jx E:1m((d) Rin (, 2ωηχcL \
[0034]其中R 和 Φ 來自公式Λexp(/^) =I exp i^,

匕ref、(0、1V CJ
[0035]代入盡=/i22(i?)=[rt2(fy) + /it2(_]2得到當前測量溫度下的樣品復介電常數，測量20°C時0.2-2.0THz的蛋白質介電常數，用公式(3)擬合得到單一弛豫時間Debye模型參數記為荊4 ο把<25、4乃和4作為初始值，並以用公式⑶換算成樣品的折射率，代入Hth_y(?)並根據公式(2)重建<_,)，然後定義重建樣品信號和測量樣品信號代價函數
[0036]ι =—CJm2(7)

t
[0037]並使用Nelder-Mead尋優法得到蛋白質樣品在20°C時0.2-2.0THz太赫茲波段的精確的單一弛豫時間Debye模型參數ε ^ es，2(l和τ 2(| ;
[0038]7)測量20°〇、251:、301:、351:、401:下蛋白質樣品的1'取時域反射脈衝信號，模型參數ε '2(1、es，2(1作為公式(3)中單一弛豫時間Debye模型的固定參數，並用同樣的代價函數擬合優化得到這些溫度下的弛豫時間參數τ2(ι、τ25、τ3(|、τ 35和τ4(|，然後利用公式(4)擬合各溫度下的弛豫時間參數得到固體蛋白質樣品的活化能ΛΕ，用于衡量樣品蛋白質熱穩定性。
[0039]實施例
[0040]利用固體蛋白質熱穩定性的太赫茲譜檢測裝置測量膠原蛋白的熱穩定性。鈦藍寶石飛秒鎖模脈衝雷射器產生中心波長為800nm、重複頻率為80MHz、脈衝寬度為10fs的雷射光源，輸出功率960mW。進入THz系統後，光束經分束鏡分為較強的泵浦光和較弱的探測光。泵浦光被斬波器調製，經透鏡聚焦後射向光電導天線砷化鎵(GaAs)晶體激發THz脈衝。THz脈衝經過一個離軸金屬拋面鏡準直，然後被一片高阻矽片反射，經聚四氟乙烯透鏡聚焦入射到載有固體蛋白質樣品的另一片高阻矽片的下表面上。經高阻矽片的上下表面反射，被四氟乙烯透鏡準直後，再透過作為THz波半透半反鏡的第一片高阻矽片，最後被另一個金屬拋面鏡聚焦，並透過薄膜分束鏡到達2mm厚的碲化鋅ZnTe晶體，與經過延遲線並反射的探測光匯合。這時THz電磁輻射脈衝的電場通過線性電光效應調製電光晶體ZnTe的折射率橢球，探測光偏振態隨之發生改變，由平衡二極體進行探測，信號送入鎖相放大器進行放大。並通過改變延遲線長度的方法探測THz信號的整個時域波形。為了防止空氣中水蒸氣對THz信號的影響，從產生THz信號的GaAs、樣品池到探測晶體ZnTe的這一段光路被密封在充有氮氣的箱體內。箱內的相對溼度小於1%，在信號掃描過程中，實驗系統的信噪比為60dB，譜解析度好於40GHz。
[0041]圖3 (a)-(d)分別由計算和公式(3)擬合的膠原蛋白的THz介電譜虛部和實部。可以更加清晰的看到膠原蛋白分子的脫水過程和解摺疊期間發生了顯著的偶極矩變化，對應的弛豫時間相應變化。圖3(c) (d)擬合的結果說明可以用單一弛豫時間Debye模型來表徵固態蛋白質分子在加熱過程中由於分子結構改變導致的介電弛豫響應過程加熱過程中樣品在溫度25°C、50°C、75°C、120°C以及返回25°C時擬合得到的單一弛豫時間τ的單一弛豫時間Debye模型的各個參數。本文發現可以利用公式(4)給出Arrhenius方程擬合加熱過程中的弛豫時間τ (如圖4所示)，計算得到了熱變性過程的活化能為5.53kJ/(K*mol)，可以定量刻畫加熱變性過程的難易程度。
【權利要求】
1.一種固體蛋白質熱穩定性太赫茲譜檢測儀，其特徵在於包括鋁製散熱器(I)、半導體致冷片(2)、ITO玻璃加熱片(3)、固體蛋白質樣品壓片(4)、貼片式鉬熱電阻(5)、高阻矽片(6)、飛秒雷射器(7)、斬波器(8)、分束器(9)、光電導天線(10)、第一拋面鏡(11)、分束矽片(12)、聚四氟乙烯透鏡(13)、延遲線(14)、反射鏡(15)、薄膜分束鏡(16)、ZnTe晶體(17)、四分之一波片(18)、沃拉斯頓稜鏡(19)、光電平衡探測器(20)、鎖相放大器(21)、溫度採集模塊(22)、可調電源(23)、第二拋面鏡(24);高阻矽片(6)上放置圓片形固體蛋白質樣品(4)，在圓片形固體蛋白質樣品(4)上緊貼ITO玻璃加熱器(3)，在ITO玻璃加熱器(3)上面放置半導體致冷片(2)，ITO玻璃加熱器(3)下表面邊緣布置貼片式鉬熱電阻(5)，半導體致冷片(2)的製冷面向下，在半導體致冷片(2)的制熱面上放置鋁製散熱器(I);飛秒雷射器(7)產生雷射光源，經過斬波器(8)，被分束器(9)分為較強的泵浦光和較弱的探測光，泵浦光射向光電導天線(10 )激發THz脈衝，THz脈衝經過經第一拋面鏡(11)準直，被分束矽片(12)反射，再經聚四氟乙烯透鏡(13)聚焦入射到載有固體蛋白質樣品的高阻矽片(6)下表面上，經高阻矽片(6)的上下表面反射，被聚四氟乙烯透鏡(13)準直後，再透過分束矽片(12)，被第二拋面鏡(24聚焦，並透過薄膜分束鏡(16)到達ZnTe晶體(17)，與經過延遲線(14)、反射鏡(15)並被薄膜分束鏡(16)反射的探測光匯合，探測光透過ZnTe晶體(17)、四分之一波片(18)、沃拉斯頓稜鏡(19)後被光電平衡探測器(20)探測，所測電信號被鎖相放大器(21)放大後進行顯示，同時根據鉬熱電阻(5)經溫度採集模塊(22)採集的溫度數據控制可調電源(23)進而控制半導體致冷片(2)製冷或ITO玻璃加熱器(3)制熱使蛋白質樣品穩定達到目標溫度。
【文檔編號】G01N21/3586GK203929627SQ201420189416
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】李向軍 申請人:中國計量學院