嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的製備方法,及在水產動物上的應用的製作方法
2023-10-19 10:46:37 3
專利名稱：嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的製備方法,及在水產動物上的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種生物免疫技術，特別是一種適用於水產動物被動免疫預防和治療的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的製備方法、及它們在水產動物疾病防治上的應用。
背景技術：
卵黃抗體(IgY)作為新一類藥物和飼料營養添加劑已廣泛應用於預防和治療豬、牛等畜類及雞、鴨、鵝等禽類的細菌或病毒性疾病。研究證明提純卵黃抗體和蛋黃液可凍幹保存或噴霧乾燥保存，抗體活性不受損失，且耐酸、耐熱及性能穩定。多價卵黃抗體無毒副作用，長期使用不會導致病原菌產生耐藥性，是一種應用前景廣泛的、性質穩定的免疫球蛋白。由於卵黃抗體在一定時間內具有耐受胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用，因此能通過經口被動免疫途徑，有效地發揮其免疫學活性或生物學活性(Hatta H)。大部分IgY都是通過在口腔或胃腸道內直接作用於病原細菌，阻止細菌對腸道細胞的黏附、侵入而發揮抗病、保健作用。
水產動物病害防後不同於陸生動物的一個主要區別是難以通過注射免疫的方式進行防治，卵黃抗體的上述特性有利於將卵黃抗體應用於水產疾病的防治。嗜水氣單胞菌是水產動物的重要病原菌，胞外產物和外膜蛋白是其主要的致病因子之一，同時也是主要的保護性抗原。研製嗜水氣單胞菌主要的致病因子的卵黃抗體有可能通過阻斷嗜水氣單胞菌在腸道的黏附、侵入，抑制其繁殖，達到抑制嗜水氣單胞菌對動物侵染的作用。但到目前為止，製備卵黃抗體及卵黃抗體在水產疾病的防治上的應用尚處於起步階段，少見實際的報導。中國專利申請申請號為200510060325.X的專利申請提供了一種抗嗜水氣單胞菌免疫球蛋白製備技術，但是該技術的缺點在於1)所採用的抗原為全菌滅活抗原，抗原顆粒較大、成分複雜，抗原特異性較差，特異性抗體效價較低；2)採用福氏佐劑(FCA)作為免疫佐劑的缺點在於①FCA油能通過肌膜層造成組織損傷，局部形成結節和無菌性肉芽腫，損壞肉質；②FCA含有分枝桿菌，能使結核菌素試驗呈陽性反應；③FCA可能有致癌作用；④粘稠，注射比較費力；⑤免疫佐劑福氏佐劑對動物的刺激性和毒副作用偏大，可導致蛋雞的產蛋率明顯下降，也不符合肉用動物的食品安全性要求，故臨床上被禁止使用。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術的不足之處，而提供一種製作簡單、成本低廉、穩定高效價的、對動物刺激性小的、安全性好的、嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法。
本發明的另一目的在於提供一種含有特異性地針對各種主要保護性抗原的多價卵黃抗體的製備方法。
本發明的目的還在於提供嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產動物疾病防治上的應用。
本發明提供了一種嗜水氣單胞菌各種主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其由下述方法製得首先從嗜水氣單胞菌中提取主要保護性抗原；將提取的各主要保護性抗原分別製成保護性抗原免疫刺激複合物ISCOMs；將各主要保護性抗原的免疫刺激復物分別對蛋雞進行免疫；取經免疫一定時間後的經同種保護性抗原免疫刺激複合物免疫的雞蛋取其蛋黃，在蛋黃中加入1-9倍生理鹽水或磷酸緩衝液(PBS)混合均勻，即為卵黃抗體懸液。
將嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原製成卵黃抗體產品，只需少量的主要保護性抗原製成的免疫刺激複合物免疫蛋雞，即可生產出大量的、高效價的卵黃抗體，因此有以下優點一是對被免疫的蛋雞刺激性小，不影響產蛋率。二是卵黃抗體產量高，成本低，採收方便、生產效率高於血清抗體，便於產業化生產。三是以卵黃抗體阻斷病原微生物嗜水氣單胞菌對水產養殖動物的侵染效果好，且無公害，無殘留。卵黃抗體只針對特定的抗原，不會影響腸道內的正常菌落。四是卵黃是動物飼料的常規營養添加成分，賦予卵黃防病、保健功能是飼料配方設計上的一種創新。五是卵黃抗體的防病、保健功能可以根據臨床需求進行設計，應用範圍廣。六是與主動免疫製劑相比(如疫苗)，卵黃抗體作用快捷、不存在安全性問題。七是對於免疫系統發育進化水平較低，以非特異性免疫為主的水產動物，卵黃抗體擁有獨特的優勢。八是卵黃抗體製成乾粉後性質穩定，易於保存。
所述的嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原或為外膜蛋白(MOMP)、或為胞外產物(ECPs)、或為黏附素。
所述的胞外產物(ECPs)的製備方法為28℃ 200r/min搖床24h培養復甦嗜水氣單胞菌，以1％的量接種於TSB培養液，200r/min 28℃培養約36h。10000r/min 4℃離心20min，取上清，0.45μm濾膜過濾，70％飽和硫酸銨沉澱，隔夜靜置，離心收集，沉澱用0.02mol/L Tris(PH7.5)重懸，4℃，對500mlTris緩衝液透析，每6小時更換液體1次，共三次，Bradford法測蛋白濃度，-20℃保存備用。
所述的外膜蛋白(MOMP)的製備方法為接種細菌於含1％氯化鈉的TSB培養基中，30℃ 150r/min搖床約24h，10 000r/min，0.02mol/L Tris-HCL(pH7.5)洗滌3次，重懸於約10mL上述緩衝液中，200W超聲波破碎共約6min，7000r/min4℃，10min收集上清，添加N-十二烷基肌氨酸鈉(N-lauroylsarcosine sodium salt)使其終濃度為1.2％(W/V)，混勻，4℃，隔夜靜置。40 000r/min 4℃ 40min，下層沉澱即為主要外膜蛋白，蒸餾水重懸Bradford法測定蛋白濃度，分裝，-20℃保存備用。
所述的黏附素製備方法同外膜蛋白，或用基因工程技術表達的嗜水氣單胞菌粘附素(方法略)。
將嗜水氣單胞菌中的各主要保護性抗原製成疫刺激複合物ISCOMs的方法之一為1.濃縮保護性抗原至2mg/ml；2.用0.25M檸檬酸酸化處理2小時，使其pH降到2.5；3.加入Mega-10至終濃度為2％，37℃，作用4小時；4.加入Quil A至終濃度為0.05％～0.1％，然後加入膽固醇(事先用氯仿溶解)、卵磷脂至終濃度為125ug/ml；5.冰浴超聲波處理8～10mins，真空負壓去氯仿；6.用0.01M檸檬酸處理透析4h；7.用0.01M PBS(pH 7.2)透析72小時，每4小時換液一次，經透析過的反應液即為保護性抗原ISCOMs。-20℃保存。
嗜水氣單胞菌各保護性抗原製成的免疫刺激複合物的鑑定方法、以胞外產物、外膜蛋白與黏附素三種製成的免疫刺激複合物為例胞外產物免疫刺激複合物、外膜蛋白和黏附素免疫刺激複合物的觀察與鑑定取三者的樣品10ul滴銅網，用2％磷鎢酸鈉染色，在JEM-120EX電鏡上觀察鑑定，胞外產物免疫刺激複合物、外膜蛋白免疫刺激複合物和黏附素免疫刺激複合物應為典型的籠格狀結構，大小約為40nm(見圖1)。
將主要保護性抗原製成的免疫刺激複合物分別對蛋雞進行免疫的具體步驟可為對蛋雞進行免疫的方法為將各保護性抗原免疫刺激複合物對蛋雞進行一次或一次以上的免疫，每次的免疫劑量為30μg-60μg/只雞，兩次免疫之間的間隔為15天左右，收集最後一次免疫過後15-75天蛋雞所生的雞蛋。
所述的各保護性抗原免疫刺激複合物免疫蛋雞的最佳方法為採用對蛋雞進行三次免疫的方法進行第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫後15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫後15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫後第15天後開始連續60天收集雞蛋。
所述的從雞蛋中提取蛋黃的做法為對雞蛋外殼進行消毒後，再取蛋黃使用。
將雞蛋外殼消毒後、再取蛋黃可防止蛋殼上粘附的細菌汙染蛋黃產品。
對雞蛋外殼進行消毒的方法有很多，它或者是用碘酒消毒雞蛋外殼後再取蛋黃、或者用1ppm易克林(10％雙鏈氯化聚胺鹽)或其他表面消毒劑消毒外殼後再取蛋黃。
一種含有嗜水氣單胞菌各種主要保護性抗原的多價卵黃抗體的製備方法，是按上述的方法製備出的各主要保護性抗原ISCOMs、將其分別對蛋雞進行免疫，分別取蛋黃，在所取的所有蛋黃中加1-9倍滅菌生理鹽水或磷酸緩衝液(PBS)製成懸液，將二種或二種以上卵黃抗體懸液等比例混合液即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原多價卵黃抗體。
為表明本發明製備方法的先進性和良好效果，本發明對採用本方法製備的嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體進行了效價測定及特異性測定。
對上述所製備的嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體的效價進行如下測定1.上述所製備的卵黃抗體ELISA效價的測定將嗜水氣單胞菌的胞外產物、外膜蛋白和黏附素分別按10μg·mL-1蛋白質濃度的量包被酶標板，每孔50μL，4℃過夜。甩幹孔內溶液，用含2％BSA的PBS-T溶液室溫封閉1小時，洗滌後加入待檢卵黃抗體樣品(從1∶20開始作倍比稀釋)，每孔50μL，室溫反應1小時，PBS-T洗滌3次，然後加入1∶20000稀釋的羊抗雞HRP標記抗體，每孔50μL，室溫反應1h，同上洗滌3次，用蒸餾水衝洗1次，最後加入50μL的底物OPD，室溫顯色15min，用2mol·L-1H2SO4終止反應。用酶聯儀在495nm處讀取OD值。抗體陽性判定標準為P/N≥2.1(即陽性孔/陰性對照孔比值≥2.1)。
2.採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及免疫印跡(Western-blot)進行特異性測定採用不連續垂直凝膠電泳，3％濃縮膠，12％分離膠。蛋白質採用考馬斯亮蘭R-250染色觀察、分析所提取的嗜水氣單胞菌的各蛋白質組分。
免疫印跡上述菌體蛋白經SDS-PAGE)電泳分離後的不經考馬斯亮蘭R-250染色直接將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，取轉印後的硝酸纖維素膜，放置於3％BSA的PBAT緩衝液中，室溫緩慢振蕩封閉1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘後，加入1∶100稀釋卵黃抗體(一抗)，室溫緩慢振蕩1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘，然後加入1∶20000稀釋的HRP酶標記的羊抗雞血清IgG(二抗)，室溫緩慢振蕩1小時，用PBAT洗滌3次，每次3分鐘，用無菌水洗滌1次，最後加沉澱型底物DAB(Sigma)進行顯色。
凝膠電泳用未預覽蛋白標準M1(97kD，66kD，43kD，31kD，20.1kD，14.4kD)(華美)，印跡試驗採用預覽蛋白標準M2(175KD，83kD，62kD，48kD，33kD，25kD，17kD，7kD)(紐英倫生物技術公司)。
嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產動物疾病防治上的應用。
下面以實驗為例，說明嗜水氣單胞菌主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體在水產疾病防治動物上的應用。
飼餵多價卵黃抗體後動物的攻毒保護試驗1.小鼠的攻毒保護試驗試驗小鼠為昆明鼠，購自福建醫科大學實驗動物養殖場，規格20g/只。攻毒分試驗組和對照組兩組進行，每組13隻小鼠。試驗組每天下午3點-6點用含10％多價卵黃抗體混合液的自來水給小鼠飲用，連餵12天。對照組飲用正常自來水。第13天試驗組和對照組小鼠各取2隻採血，其餘每隻由腹腔注射5×107CFU的嗜水氣單胞菌(ZN1株)，每天觀察2次，連續7天，計算小鼠存活率。結果顯示，經過多價卵黃抗體投餵的昆明鼠存活率為72.7％，而未投餵卵黃抗體的昆明鼠存活率僅27.3％。
表1實驗組和對照組小鼠攻毒後的存活率
2.鰻鱺的攻毒保護試驗實驗歐洲鰻鱺購自福建省長樂某鰻鱺養殖場，規格80g/尾。攻毒分試驗組和對照組兩組，每組10尾鰻魚。鰻鱺在實驗室40L水族箱中養殖，溫度22-25℃左右，每日換水1/3。試驗組每天上午和下午各飼餵含10％多價卵黃抗體混合液的黑子料，日投餵量為鰻魚體重的0.8-1.0％，連餵15天。對照組正常用自來水拌料投喂。投餵後第13天試驗組和對照組各取1尾鰻魚採集血清，其餘的鰻魚每尾由腹腔注射1×108CFU的嗜水氣單胞菌(ZN1株)，每天觀察2次，連續2周，計算鰻魚存活率。結果顯示，經過卵黃抗體投餵的鰻魚存活率為77.8％，而未投餵卵黃抗體的鰻鱺存活率僅44.4％。顯示卵黃抗體投餵組的歐鰻對嗜水氣單胞菌攻毒的抗性明顯增強。
表2實驗組和對照組鰻鱺攻毒後的存活率
由此可見，依據本方法製備的外膜蛋白卵黃抗體及胞外產物卵黃抗體經飼料添加方式投餵動物，能夠賦予小鼠和鰻鱺抵抗嗜水氣單胞菌的浸染能力。
下面將對以外膜蛋白和胞外產物為抗原分別製成的卵黃抗體進行效價和特異性分析、並將兩者混合製成的多價卵黃抗體的抗病原理進行細緻的闡述。
當將嗜水氣單胞菌的外膜蛋白(MOMP)、胞外產物(ECPs)或黏附素抗原免疫刺激複合物免疫蛋雞，第三次免疫後的15天起，每7天測一次，連續60天檢測卵黃抗體ELISA效價，同時用大腸桿菌菌毛蛋白製備的卵黃抗體作對照。
ELISA分析顯示，在第三次免疫後的15-60天內所製備的嗜水氣單胞菌MOMP、ECPs及大腸桿菌菌毛蛋白卵黃抗體，對各自相應的免疫抗原反應滴度均達到1∶10280以上，見表3。其中嗜水氣單胞菌主要保護性抗原的卵黃抗體和大腸桿菌菌毛蛋白卵黃抗體能與嗜水氣單胞菌MOMP抗原發生反應，表明所製備的嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體可識別外膜蛋白的特定抗原成分，同時提示嗜水氣單胞菌的MOMP和大腸桿菌菌毛蛋白在抗原結構上存在相似的抗原決定簇。
嗜水氣單胞菌ECPs卵黃抗體對ECPs的ELISA效價為1∶2560，低於該卵黃抗體對MOMP抗原的效價，嗜水氣單胞菌MOMP卵黃抗體與ECPs抗原有弱交叉反應，由此推測ECPs抗原中也存在MOMP的成分，而且這些MOMP成分雖然含量不多，但抗原性較強；大腸桿菌菌毛卵黃抗體與嗜水氣單胞菌ECPs抗原不發生反應，推測ECPs抗原與大腸桿菌菌毛抗原不存在共同抗原決定簇，或共同抗原決定簇含量稀少，或ECPs抗原中含有的MOMP組分很少，見表3。
與嗜水氣單胞菌MOMP、ECPs和黏附素卵黃抗體在製備中用生理鹽水等量稀釋不同的是，卵黃抗體混合物在製備過程中，由於將2種卵黃抗體先混合和後再加等量生理鹽水的稀釋，因此單種成分的ELISA效價減半(表3)。這一結果也說明兩種方法都能有效製備卵黃抗體。卵黃抗體混合物製備過程簡單，在效價不變的同時保留了卵黃營養物質，適合作為動物營養添加劑。
表3MOMP、ECP卵黃抗體抗體效價測定
免疫印跡(Western-blot)結果顯示，外膜蛋白(MOMP)卵黃抗體對7株不同血清型的嗜水氣單胞菌的外膜蛋白和黏附素特異條帶均能結合，說明所製備的卵黃抗體對不同血清型的嗜水氣單胞菌均具有廣譜性的抗原抗體反應特性(圖2)。
同時本發明製備的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原免疫刺激複合物具有如下優點本實驗室通過對4種嗜水氣單胞菌菌株ACTT10501、L316、TPS30、WC-2的外膜蛋白(MOMP)製成的嗜水氣單胞菌外膜蛋白ISCOMs免疫複合物，分別對鰻魚進行免疫，免疫後40天對鰻魚進行嗜水氣單胞菌TPS30攻毒，結果顯示，經嗜水氣單胞菌MOMP-ISCOMs免疫的鰻魚對嗜水氣單胞菌攻毒的保護率分別達到80％-100％，而未免疫的鰻魚保護率為0(董傳甫等，2005)。
嗜水氣單胞菌胞外產物(ECPs)對鰻魚的免疫保護試驗也取得相似結果。方勤美等(2004)將嗜水氣單胞菌菌株TPS30的胞外產物(ECPs)製成的嗜水氣單胞菌ECPs-ISCOMs，分一次免疫組和二次免疫組對鰻魚進行免疫。於一次免疫後45天，或二次免疫後15，用嗜水氣單胞菌TPS30對免疫魚進行攻毒，結果顯示，一次免疫後保護率經達到87.5％，二次免疫後保護率經達到100％，而未免疫鰻魚攻毒後保護率為0。
但外膜蛋白、胞外產物或黏附素直接製成免疫製劑進行免疫存在以下幾個缺點1)需要提取大量胞外產物、外膜蛋白，大量製備免疫刺激複合物技術要求高、成本大；2)對水產動物進行注射免疫操作難度大，實用性差；直接免疫產生效應時間需二周以上。
圖1是免疫刺激複合物的電鏡觀察2是嗜水氣單胞菌外膜蛋白卵黃抗體對7種不同血清型的嗜水氣單胞菌MOMP的Western-blot染色結果。
具體實施例方式
實施例一
一種製備嗜水氣單胞菌外膜蛋白保護性抗原單價卵黃抗體的方法，首先從所述的嗜水氣單胞菌中獲得保護性抗原—外膜蛋白，所述的外膜蛋白為由下述方法製得接種細菌於含1％氯化鈉的TSB培養基中，30℃150r/min搖床約24h，10000r/min，0.02mol/L Tris-HCL(pH7.5)洗滌3次，重懸於約10mL上述緩衝液中，200W超聲波破碎共約6min，7000r/min 4℃，10min收集上清，添加N-十二烷基肌氨酸鈉(N-lauroylsarcosine sodium salt)使其終濃度為1.2％(W/V)，混勻，4℃，隔夜靜置。40 000r/min 4℃ 40min，下層沉澱即為主要外膜蛋白，蒸餾水重懸Bradford法測定蛋白濃度，分裝，-20℃保存備用。接著將所獲得的主要外膜蛋白製成免疫刺激複合物ISCOMs，製成免疫刺激複合物的方法為1.濃縮保護性抗原至2mg/ml；2.用0.25M檸檬酸酸化處理2小時，使其pH降到2.5；3.加入Mega-10至終濃度為2％，37℃裂解4小時；4.加入Quil A至終濃度為0.05％～0.1％，然後加入膽固醇(事先用氯仿溶解)、卵磷脂至終濃度為125ug/ml；5.冰浴超聲波處理8～10mins，真空負壓去氯仿；6.用0.01M檸檬酸處理透析4h；7.用0.01M PBS(pH 7.2)透析72小時，每4小時換液一次，經透析過的反應液即為外膜蛋白免疫刺激複合物ISCOMs，將其冷凍保存。
再將外膜蛋白免疫刺激複合物對蛋雞進行免疫，免疫為採用一次的免疫，取免疫一定時間後的蛋雞的雞蛋蛋黃(通常為15天以上)，在蛋黃中加入3倍左右的生理鹽水混合均勻，即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原卵黃抗體。所述的卵黃抗體冷凍保存備用。
本實施例未述部分與現有技術相同。
實施例二本實施例其餘步驟與方法與實施例一相同，只是其中的將所獲得的主要外膜蛋白免疫刺激複合物免疫蛋雞的方法改為三次免疫進行，其具體方法為第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫後15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫後15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫後第15天後開始連續60天收集雞蛋。而從雞蛋中提取蛋黃的方法為用碘酒消毒雞蛋外殼後再取蛋黃。
實施例三本實施例的其餘步驟與實施例二相同，只是其中提取蛋黃的方法為採用10％雙鏈氯化聚胺鹽對雞蛋外殼消毒後再取蛋黃。
實施例四本實施例的步驟與方法與實施例一相同，只是將其中的生理鹽水改為磷酸緩衝液。
實施例五本實施例與實施例一的方法與步驟基本相同，只是將其中的外膜蛋白改為胞外產物，一種製備嗜水氣單胞菌胞外產物保護性抗原單價卵黃抗體的方法，首先從嗜水氣單胞菌中獲得胞外產物，其方法採用常規的方法進行，具體為28℃200r/min搖床24h培養復甦嗜水氣單胞菌，以1％的量接種於TSB培養液，200r/min 28℃培養約36h。10000r/min 4℃離心20min，取上清，0.45μm濾膜過濾，70％飽和硫酸銨沉澱，隔夜靜置，離心收集，沉澱用0.02mol/L·Tris(PH7.5)重懸，4℃對Tris緩衝液充分透析，Bradford法測蛋白濃度，-20℃保存備用。將所獲得的胞外產物按照實施例一的方法製得嗜水氣單胞菌胞外產物卵黃抗體。
本實施例未述部分與實施例一相同。
實施例六本實施例與實施例一的方法與步驟基本相同，只是將其中的外膜蛋白改為黏附素，一種製備嗜水氣單胞菌黏附素保護性抗原單價卵黃抗體的方法，將所獲得的黏附素按照實施例一的方法製得嗜水氣單胞菌黏附素卵黃抗體。
實施例七一種製備嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體的製備方法，其中的主要保護性抗原為外膜蛋白、胞外產物和黏附素，三者先按上述實施例中的方法分別製成免疫刺激複合物後，對蛋雞進行免疫，將所獲得的雞蛋分別取蛋黃後，混合再加入3倍的生理鹽水進行混合，即為嗜水氣單胞菌主要保護性抗原卵黃抗體混合物。
實施例八將實施例七所獲得的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體應用於鰻魚及其他魚類的防治。將製備的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原卵黃抗體混合物按3％的比例添加入鰻魚飼料，混合後投喂，15天為一療程。也可作為鰻魚飼料添加劑長期服用。其使用方法可參照普通的鰻魚飼料添加劑的方法使用。
實施例九其與實施例八基本相同，只是將其中的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原多價卵黃抗體改為單價的卵黃抗體。
權利要求
1.一種嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其由下述方法製得首先從嗜水氣單胞菌中提取主要保護性抗原；將提取的各主要保護性抗原分別製成保護性抗原免疫刺激複合物ISCOMs；將各主要保護性抗原的免疫刺激復物分別對蛋雞進行免疫；取經免疫一定時間後的經同種保護性抗原免疫刺激複合物免疫的雞蛋取其蛋黃，在蛋黃中加入1-9倍生理鹽水或磷酸緩衝液(PBS)混合均勻，即為卵黃抗體懸液。
2.根據權利要求1所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於所述的嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原或為外膜蛋白、或為胞外產物、或為黏附素。
3.根據權利要求2所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於將各保護性抗原免疫刺激複合物對蛋雞進行一次或一次以上的免疫，每次的免疫劑量為30μg-60μg/只雞，兩次免疫之間的間隔為15天左右，收集最後一次免疫過後15-75天蛋雞所生的雞蛋。
4.根據權利要求3所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於對蛋雞進行三次的免疫，第一次免疫劑量30μg-60μg/只雞，第一次免疫後15天進行第二次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞；第二次免疫後15天進行第三次免疫，免疫劑量40μg-80μg/只雞，第三次免疫後第15天後開始連續60天收集雞蛋。
5.根據權利要求4所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於從雞蛋中提取蛋黃的方法為對雞蛋外殼進行消毒後，再取蛋黃使用。
6.根據權利要求5所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價卵黃抗體的製備方法，其特徵在於用碘酒消毒雞蛋外殼後再取蛋黃、或者用1ppm易克林。
7.一種含有嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原的多價卵黃抗體的製備方法，是按權利要求1所述的方法製備出各主要保護性抗原ISCOMs、再將其分別對蛋雞進行免疫，分別取蛋黃，在所取的所有蛋黃中加1-9倍生理鹽水或磷酸緩衝液(PBS)製成懸液，將二種或二種以上卵黃抗體懸液等比例混合液即為嗜水氣單胞菌的主要保護性抗原多價卵黃抗體。
8.一種如權利要求1或7所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價或多價卵黃抗體在水產動物疾病防治上的應用。
9.一種如權利要求1或7所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價或多價卵黃抗體作為水產動物飼料添加劑的應用。
10.一種如權利要求8所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、或多價卵黃抗體在鰻鱺疾病防治上的應用。
11.一種如權利要求9所述的嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、或多價卵黃抗體作為鰻鱺飼料添加劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種嗜水氣單胞菌各主要保護性抗原單價、多價卵黃抗體的製備方法，及在水產動物疾病防治上的應用。本發明的優點在於通過將嗜水氣單胞菌中的主要保護性抗原製成卵黃抗體產品。只需少量的保護性抗原製成的免疫刺激複合物免疫蛋雞，即可生產出大量的、高效價的卵黃抗體，所生產的卵黃抗體阻斷病原微生物嗜水氣單胞菌對水產養殖動物的侵染效果好，且無公害，無殘留。卵黃抗體只針對特定的抗原，不會影響腸道內的正常菌落。卵黃是動物飼料的常規營養添加成分，賦予卵黃防病、保健功能是飼料配方的一種創新，其作用快捷、不存在安全性問題。對於免疫系統發育進化水平較低，以非特異性免疫為主的水產動物，卵黃抗體擁有獨特的優勢。
文檔編號A61P31/04GK101074260SQ20071000872
公開日2007年11月21日 申請日期2007年3月20日 優先權日2007年3月20日
發明者林天龍, 宋鐵英, 俞伏松, 曾麗莉 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所, 林天龍, 宋鐵英, 俞伏松, 曾麗莉