用於降解菸葉中果膠的SMXP‑58菌株及其應用的製作方法

2023-10-22 14:11:38 1

本發明屬於捲菸菸葉醇化技術領域，具體涉及一株用於降解菸葉中果膠的芽孢桿菌屬SMXP-58菌株及其在菸葉醇化中的應用。

背景技術：

菸草是我國的重要經濟作物之一。實際製備捲菸產品時，未經陳化的菸葉含有較多大分子物質，如蛋白質、果膠、纖維素、澱粉和高級脂肪酸等，其在燃燒過程中，會產生令人不舒服的氣味，因而不宜直接吸食，需要經過一定時間的醇化處理後才能用於生產應用。

菸葉結構中，以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸為基本結構的果膠，和纖維素一樣是重要的細胞壁成分，也是菸草中的重要成分。已有研究表明，若果膠類物質含量過高，會造成菸草燃燒不完全，產生甲醇，甲醇進一步氧化成甲醛、甲酸等，對菸草吸食及安全性產生不利影響，而且對捲菸品質有很大的影響。因此，果膠含量已成為評價菸草及菸草製品品質的重要指標，降低菸草中果膠含量對提高菸草品質有重要意義。

為合理降低菸葉中果膠及其他物質含量，通常做法是將新鮮收穫的菸葉置於特定倉庫中進行長期存放，利用環境及菸葉自身的變化促使菸葉中蛋白質、果膠等大分子物質降解，從而改善菸葉品質，這一過程稱為菸葉的醇化。由於菸葉醇化周期通常較長，一般在2~3年甚至更長，對於實際煙支生產往往具有較大影響，因而極有必要適當縮短或者改進這一菸葉醇化操作過程。

技術實現要素：

在對現有菸葉醇化操作過程中的菸葉表面及菸葉內部所含微生物篩選基礎上，本發明目的在於提供一株能夠較好降解菸葉中果膠物質的芽孢桿菌屬SMXP-58菌株，從而能夠促進菸葉陳化，加快菸葉醇化過程。

本申請所採取的詳細技術方案如下。

一株用於降解菸葉中果膠的SMXP-58菌株，該菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），最初是由2013年三門峽產的復烤菸葉中分離而來，其保藏名稱為：枯草芽孢桿菌 SMXP-58，分類學名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，現保藏於武漢中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083。

利用所述用於降解菸葉中果膠的SMXP-58菌株所製備的菌劑，通過如下步驟製備而成：

（1）活化菌種，將SMXP-58菌株置於LB平板上，37℃條件下培養1~2d；

（2）製備種子液，刮取步驟（1）中所培養的菌體，接種於液體LB培養基中，30℃、150 rpm條件於搖床過夜培養；

（3）擴大培養，將步驟（2）中種子液按1%的體積比轉接液體LB培養基，30℃、150 rpm條件於培養至OD600=2.0左右；

（4）製備菌劑，將步驟（3）中發酵液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然後加入無菌水進行充分懸浮，調整活菌數為（9~10）×107個/mL左右後，即為用於降解菸葉中果膠的菌劑。

所述利用SMXP-58菌株所製備的菌劑在降解菸葉果膠中的應用，按菸葉質量的1~3%比例用無菌水稀釋後，均勻噴灑於菸葉表面，25~30℃、50~70%溼度條件下，發酵處理60~84h，發酵完成後，再將菸葉加熱處理（例如80℃條件下保溫10~20min），使細菌及其產生的果膠酶失活。

上述用無菌水稀釋菌劑時，無菌水體積用量一般為菌劑用量的10倍，其主要用途在於使菌體較為均勻的分不到菸葉表面。

本發明中以菸葉中含量較高的果膠為作用目標，通過特定菌株篩選，以及特定劑量使用，在較短時間內較好地降低了菸葉中的果膠含量。初步測定結果表明，菸葉中果膠的降解率可達50%以上，表現出較好地降低菸葉中果膠含量的技術效果。

總體而言，本發明通過特定菌株的篩選，設計了較為簡便的菌劑處理菸葉的技術方案，使得本發明具有：工藝流程較為簡便，菸葉處理成本較低，且處理周期較短，可明顯降低菸葉中的果膠含量並改善菸葉品質等技術優點，因而在捲菸製造技術領域具有較好地推廣應用價值。

附圖說明

圖1為SMXP-58菌株在油鏡下的形態圖；

圖2為基於SMXP-58菌株 16S rDNA基因序列構建的系統發育進化樹。

具體實施方式

下面結合實施例對本申請做進一步解釋說明，在介紹具體實施例前就下述實施例中涉及部分物料、實驗設備等情況簡要介紹如下。

菸草物料：菸草醇化評吸時所採用菸草原料為2015年河南平頂山產復烤菸葉，由河南中煙有限責任公司提供。

實施例1

本實施例僅就SMXP-58菌株的篩選及鑑定過程簡要介紹如下。

SMXP-58菌株，最初是由2013年三門峽產的復烤菸葉中分離獲得。其菌落在NA培養平板上圓形或不規則，呈乳白色，沒有光澤，菌落表面平整或出現不規則褶皺凸起，表面粗糙不光滑，菌落不透明。油鏡下形態如圖1所示，可觀察到細菌分布均勻，為杆狀，很少呈鏈狀，大小為(0.7~0.9)×(1.6 ~2)μm。

採用16S rDNA基因片段為通用引物，對該菌株進行PCR以及克隆測序，可獲得1416bp序列，進行系統進化分析，顯示菌株SMXP-58與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的同源性高達99%，即，與枯草芽孢桿菌的親緣關係最近（如圖2所示）。

最終，鑑定認為SMXP-58菌株屬芽孢桿菌屬（Bacillus），其分類學名稱為Bacillus subtilis SMXP-58，現保藏於武漢中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏編號為CCTCC NO：M 2016083。

實施例2

為將實施例1中篩選所得SMXP-58菌株用於降解菸葉中果膠，需首先將該菌株製備成易於使用的菌劑，具體製備過程如下。

（1）活化菌種：將SMXP-58菌株置於LB平板上，37℃條件下於生化氣候箱中培養1~2d；

（2）製備種子液：在超淨工作檯中刮取步驟（1）中所培養的菌體，接種於含有5mL液體LB培養基的18×180的試管中，30℃、150 rpm條件於搖床過夜培養；

（3）擴大培養：將步驟（2）中種子液按1 mL菌懸液/100 ml LB培養基（1%的體積比）轉接於含100mL液體LB培養基的滅菌的250mL錐形瓶中，30℃、150 rpm條件於培養至OD600=2.0左右；

（4）製備菌劑：將步驟（3）中菌液3600 rpm離心10min，棄上清夜，然後加入無菌水充分懸浮，調整活菌數為9.6×107個/mL左右後，即為用於降解菸葉中果膠的菌劑。

實施例3

利用實施例2中所製備菌劑處理菸葉時，具體步驟為：

處理菸葉時，用噴霧器將上述菌劑均勻噴灑於菸葉表面，然後調整菸葉水分含量為25%；最後置於30℃恆溫恆溼箱（噴灑菌劑後的菸葉放入密封袋中，然後置於恆溫恆溼箱中黑暗條件下發酵，故其溼度不受恆溫恆溼箱中溼度的影響）中，發酵處理60~84h；發酵結束後，80℃處理20min，使細菌及其產生的果膠酶失活。

為確定菌劑與菸葉物料間的較佳使用比例，發明人進一步進行了正交實驗篩選，相關實驗過程簡要介紹如下。

菸葉樣品：取抽取煙梗後的菸葉，分割成片狀，然後均勻分成多份，每份100 g。

菌劑用量、發酵時間、施水量：分別以發酵時間、施用菌劑量、添加水量（無菌水）為影響因素，進了3因素水平設計（水平因素表（L9(3)3）），具體設計如下：

註：A為發酵時間；B為施用菌液量；C為添加水量。

依據上述3因素水平設計，進行了三因素三水平正交實驗設計：

表中Ck為對照，不施加菌劑，不施加水。

菸葉處理完成後，對菸葉中的果膠含量採用咔唑硫酸分光光度測定法進行測定。測定時首先繪製標準曲線，然後依據測定結果換算獲得果膠含量變化情況，具體步驟為：

（一）製作標準曲線

（1）準確稱取分析純半乳糖醛酸（G.A.）0.0500g，用蒸餾水溶解後定容於50mL容量瓶中(濃度1000mg/L)，

（2）於6個50mL容最瓶中分別吸取此液0、1、2、3、4、5mL，稀釋至刻度(濃度0~100mg/L)。

（3）分別吸取不同濃度的標準稀釋液1mL於6支試管(20mm×150mm)中，然後各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫，

（4）然後各加人0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，繪製A一C標準曲線。

（二）樣品測定

（1）準確稱取0.040g菸葉樣品粉末於50mL燒杯中，

（2）加入10mL、0.5mol/L硫酸、15mL水，攪勻，在75℃水浴中水解15min，冷卻至室溫後定容於50mL容量瓶中，

（3）然後，準確移取5.00mL該液於另一50 mL容量瓶，稀釋至刻度，吸取10倍稀釋液1mL於6支試管(20mm×150mm)中，然後各加人濃硫酸6mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫，

（4）然後各加入0.30mL、0.15%(1.500g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；

（5）在室溫下暗處放置1.5h，在540nm波長下用1cm比色皿，以試劑空白（G.A.濃度為0的稀釋液）作參比，測定吸光度(A)，再根據標準曲線計算其濃度。

（三）計算

計算公式為，G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×106]×100%，

式中：C為從標準曲線查得的所測果膠液中G.A.的濃度(mg/L)，W為菸葉樣品粉末質量(g)；根據不同菸葉樣品中G.A.的含量不同，可換算出相應菸葉中果膠的含量。並進一步進行極差分析，結果如下表：

。

結論：由於在一定範圍內，菸葉果膠含量越低越好，而k1＜k3＜k2，因此選擇A1為因素A（A代表時間）的優水平，同理B、C（分別代表菌劑量、水量）的優水平分別為B1、C2，所以最優水平組合為A1B1C2，即時間為60 h、菌劑量為1 mL、水量為20 mL；比較R值可知RB>RC>RA，菌劑量對整個作用條件的影響最大，其次是水量，而時間的影響最小。

由於最優化組合併不在9組正交處理方案中，因此對優化處理方案進行了驗證實驗，結果如下表：

。

綜上所述，當菌劑在發酵時間為60 h、施用菌劑量為1 mL、施用水水量為20 mL條件下（此時，菌體數量為9.6×107）施用於發酵期時，菸葉中的果膠降解率可達52.9%。因而本發明在降低菸葉中果膠含量，從而提升菸葉品質方面具有較好地應用前景。

總體而言，本申請中篩選獲得的SMXP-58菌株，其來源於菸葉中原有菌株，當利用其所製備菌劑處理菸葉時，在確保對於菸葉中果膠降解同時，不具有明顯的副作用，可較為有效的促進菸草中大分子物質降解形成各類有利於提高菸草品質的小分子物質，進而達到降低捲菸煙氣中的有害成分，改善菸葉的內在品質的目的。