突變體青黴素g醯基轉移酶的製作方法

2023-10-22 16:02:32

突變體青黴素g醯基轉移酶的製作方法
【專利摘要】本發明涉及突變體青黴素G醯基轉移酶。本發明涉及源自野生型青黴素G醯基轉移酶的突變體原核青黴素G醯基轉移酶，其特徵在於所述突變體在選自下組的一個或多個胺基酸位置上具有胺基酸取代，所述組由根據具有SEQ?ID?No:1中所示胺基酸序列的Escherichia?coli青黴素G醯基轉移酶的胺基酸編號的胺基酸位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460和B488組成。
【專利說明】突變體青黴素G醯基轉移酶
[0001]本發明是申請日為2009年12月22日、申請號為200980152465.6、題為「突變體
青黴素G醯基轉移酶」的申請的分案申請。
發明領域
[0002]本發明涉及經突變的青黴素醯基轉移酶和用於製備β -內醯胺抗生素的方法，其中在存在經突變的青黴素醯基轉移酶時藉助於活化的側鏈將內醯胺核心醯化。
[0003]發明背景
[0004]β_內醯胺家族的抗生素是臨床應用中最重要的一類抗菌化合物。天然存在的β -內醯胺抗生素的較窄殺菌譜、它們較低的酸穩定性和越來越多的抗性問題引起了對於半合成抗生素(SSA』 s)(例如半合成青黴素(SSP』 s)和半合成頭孢菌素(SSC』 s))的開發。通常，半合成β_內醯胺抗生素的化學合成在低溫下使用反應性中間產物和有機溶劑在嚴苛條件下進行，這導致較高的下遊加工成本和環境不友好的過程。因此人們持續努力，以通過酶促轉化代替傳統化學方法，以便獲得更加可持續的半合成β -內醯胺抗生素生產。
[0005]天然內醯胺典型地由內醯胺核心(例如6-氨基-青黴烷酸(6-ΑΡΑ)、7-氨基-去乙醯氧基-頭孢烷酸(7-ADCA)及其他)和所謂的側鏈組成，所述側鏈通過醯胺鍵與核心連接。青黴素G醯基轉移酶(EC3.5.1.11)是一種水解酶，其被廣泛用於去除青黴素G(PenG)、頭孢菌素G(CefG)和相關抗生素的側鏈，從而生產相應的脫醯的核心6-ΑΡΑ和7-ADCA以及各自被釋放的側鏈(在PenG和CefG的情況下為苯乙酸(ΡΑΑ))。這些脫醯的內醯胺中間產物是SSA (例如氨苄西林、阿莫西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、氟氯西林、頭孢氨苄、頭孢羥氨苄、頭孢拉定、頭孢克洛、頭孢丙烯、頭孢噻I虧等等)的構造塊(building blocks)。關於PenG醯基轉移酶的最近綜述見 Rajendhran J, and Gunasekaran P., J Biosc1.Bioeng.(2004), 97, 1-13, Arroyo Met al., Appl Microbiol Biotechnol.(2003)60, 507-14,Sio CF and Quax WJ.CurrOpin Biotechnol.(2004), 15., 349-55, Chandel, A.K.et al.Enzyme and MicrobialTechnology(2008), 42, pp.199-207。
[0006]除了對β -內醯胺化合物脫醯基之外，已發現PenG醯基轉移酶和氨基酯水解酶也可以被用於合成β_內醯胺抗生素。在該過程中，PenG醯基轉移酶催化被活化的側鏈與脫醯的β -內醯胺中間產物(例如6-APA、7-ADCA、7-ACA及其他)的縮合。酶催化的β -內醯胺抗生素合成可以在平衡受控的轉化過程中發生，或在動力學受控的轉化過程中發生。在平衡受控的轉化條件下，可以達到的產物累積水平受到反應熱動力學平衡的控制，這在半合成抗生素的合成中是不想要的，特別是當反應在水性介質中進行時。在動力學受控的轉化中，酶催化醯基從活化的側鏈(即醯基供體)轉移到內醯胺核心(即親核受體)。為了製備半合成的青黴素，被活化的側鏈可以是醯胺衍生物或是芳香族羧酸的甲基酯。在這種情況下，產物累積水平受酶的催化特性控制，並且可瞬時獲得醯基轉移產物的高的非平衡濃度。SSA’s的合成中使用的側鏈的例子是經活化的苯基甘氨酸、經活化的羥苯基甘氨酸、經活化的二氫苯基甘氨酸等等。[0007]PenG醯基轉移酶通過醯基-酶中間產物催化醯胺和酯的水解，所述中間產物中β -亞基的N-端絲氨酸被酯化至醯基。在水解的情況下，水攻擊醯基-酶並且驅動水解完成。存在添加的外界親核試劑(例如6-APA、7-ADCA)的氨基時，親核試劑和水均攻擊醯基酶，分別產生想要的醯基-轉移產物(抗生素)和不想要的經水解的醯基供體。
[0008]PenG醯基轉移酶發揮醯基轉移酶(即合成SSA』 s)的能力已經在多種半合成的β -內醯胺抗生素的酶促生產中以工業規模利用。然而，在SSA’s的生產中，由於經活化的前體側鏈的損失，水導致的水解反應降低了轉移反應的效率。合成速率(S)和水解速率(H)之間的比例是評價PenG醯基轉移酶合成性能的重要參數。S/Η比例等於酶促醯基轉移反應期間確定的條件下合成的產物(SSA)與水解產物相比的摩爾比。合成的產物在本文中被定義為從經活化的側鏈和內醯胺核心形成的內醯胺抗生素。水解產物在本文中被定義為經活化的側鏈的相應酸。對經濟上有吸引力的方法而言，期望S/Η比較較高，同時酶活性優選地也足夠高。
[0009]轉化中觀察到的S/Η比例依賴於反應物、反應條件和轉化的進行。Youshkoet al.顯示S/Η比例的初始值既依賴於酶的動力學特性，又依賴於親核受體(例如 6-APA)的濃度一見 Youshko, M.1.and Svedas, V.K., Biochemistry (Moscow)(2000),65, 1367-1375和 Youshko, Μ.1.et al.Biochimica et Biophysica Acta-Proteinsand Proteomics (2002).1599.134-140。在固定的條件和親核試劑濃度下，初始S/H比例可被用於比較不同PenG醯基轉移酶和/或不同PenG醯基轉移酶突變體的性能。另外，可以通過測量作為時間函數的轉化期間的合成和水解，來比較不同PenG醯基轉移酶的性能，所述測量允許計算轉化不同階段的S/Η比例。醯化反應中PenG醯基轉移酶的合成活性(=形成合成產物的速率=合成速率=生產速率)指:定義的條件下每單位時間在醯化反應中形成的β_內醯胺抗生素的量。優選地測定初始活性。初始酶活性可如下測定:進行醯化反應，然後構建合成的產物量與反應時間相比的圖表，即所謂的發展曲線。通常在轉化開始時，產物形成速率相對恆定，並且可以從發展曲線的斜率直接推導活性。在轉化開始時合成活性已經開始降低的情況下，可通`過發展曲線的外推和t=0時斜率的計算獲得初始速率。為了比較不同PenG醯化酶的活性，合成活性應當被標準化至相同量的蛋白質。通過與合成初始速率相同的方式，可以從經活化的經水解側鏈量比反應時間的圖表來測定水解的初始速率。
[0010]PenG醯基轉移酶已成為涉及PenG醯基轉移酶突變體的若干研究的對象。在上文Rajendhran and Gunasekara(2004)中給出了對公開的突變的詳盡列表。近期更多研究由Gabor, E.M.and Janssen, D.B., Protein Engineering, Design and Selection(2004), 17,571-579;Jager, S.A.ff.et al.Journal of Biotechnology(2008), 133, 18-26;Wang, J., etal.Applied Microbiology and Biotechnology (2007), 74, 1023-1030 公開。
[0011]Gist-brocades的國際專利申請W096/05318教導了如何通過突變一個或多個胺基酸位置上的底物結合位點來修飾PenG醯基轉移酶的特異性。顯示也可以通過這種方式調整PenG醯基轉移酶的S/Η比例。
[0012]另外，國際專利申請W098/20120 (Bristol-Meyers Squibb)、W003/055998(Gist-brocades)和中國專利申請 CN101177688 (Shanghai Institute for BiologicalSciences的)描述了由β _內醯胺核心和經活化的側鏈，藉助於PenG醯基轉移酶突變體酶促製備β -內醯胺抗生素的方法。W098/20120公開了 Escherichia coli PenG醯基轉移酶α -亞基中胺基酸位置142和146上和β -亞基中胺基酸位置24、56或177上的突變。特別地，在β 24上具有突變(其中苯丙氨酸被丙氨酸代替，F β 24Α)的PenG醯基轉移酶變體似乎在青黴素和頭孢菌素合成中生產顯著更高的產率。然而在W003/055998中顯示，在使用醯胺前體代替酯前體與所述突變體Fβ24Α組合的方法中，S/Η比例仍然教導，但是酶促活性如此之低，使得該突變體在經濟上吸引力小得多。相反，W003/055998中顯示，其中α -亞基中第145位精氨酸被亮氨酸(Ra 145L)、半胱氨酸(Ra 145C)或賴氨酸(Ra 145Κ)代替的PenG醯基轉移酶突變體也顯示經改進的S/Η比例，但是除此之外還保持了更高水平的合成活性，特別是使用醯胺前體時。然而，所有這些突變體的合成活性都比野生型PenG醯基轉移酶的合成活性小。
[0013] CN101177688 公開了對 Bacillus megaterium PenG 酸基轉移酶的突變體而言，S/H比例的改進也伴隨著合成活性的降低。
[0014]TUHH-Technologie GmbH 的 EP-1418230 公開了 Alcaligenes faecalis PenG酸基轉移酶，其中α -亞基的翻譯後成熟是不完全的，導致對青黴素G和6-硝基-3-苯乙醯胺苯甲酸(也稱作ΝΙΡΑΒ)更高的水解活性。所述α-亞基的不完全加工由α和β亞基之間所謂的連接子區域中的胺基酸取代引起。沒有描述此類突變是否也能提高合成活性。
[0015]上文討論的現有技術顯示，儘管可能提高PenG醯基轉移酶的多種突變體的S/Η比例，但是與野生型PenG醯基轉移酶相比，S/Η比例的此類改進伴隨著合成活性的降低。因此，這些突變體的缺點是在此類轉化中需要長的轉化時間或非常高濃度的突變體PenG醯基轉移酶，這使得此類突變體的工業應用在經濟上沒有吸引力，如果不是不可能的話。
[0016]本發明的一個目的是提供下述突變體PenG醯基轉移酶，所述酶與野生型酶相比具有提高的S/Η比例，同時維持或更優選地提高合成活性，從而適用於工業方法。
[0017]發明詳沭
[0018]在第一方面中，本發明提供了源自野生型青黴素G醯基轉移酶的突變體原核青黴素G醯基轉移酶，其特徵在於，所述突變體具有位於選自下組的一個或多個胺基酸位置上的胺基酸取代，所述組由胺基酸位置A3、Α77、Α90、Α144、Α192、Β24、Β109、Β148、Β313、Β460和Β488組成,所述胺基酸位置根據具有SEQ ID No:1所示胺基酸序列的Escherichiacoli青黴素G醯基轉移酶的胺基酸編號，如下文所示:
【權利要求】
1.源自野生型青黴素G醯基轉移酶的突變體原核青黴素G醯基轉移酶，其特徵在於，所述突變體: a.在胺基酸位置B460或[B148+B460]或[B24+B460]或[B24+B148+B460]上具有胺基酸取代，所述胺基酸位置基於具有SEQ IDNo:1中所示胺基酸序列的Escherichia coli青黴素G醯基轉移酶的胺基酸編號；並且 b.其中B24、B148和B460上的突變分別為F24A、V148L和F460L;並且 c.其中所述野生型青黴素G醯基轉移酶具有與SEQID N0:1中所示胺基酸序列80%-100%同源的胺基酸序列。
2.編碼權利要求1所述的突變體青黴素G醯基轉移酶的核酸序列。
3.包含如權利要求2所述的核酸序列的表達載體。
4.包含如權利要求3所述的表達載體的宿主細胞。
5.用於生產半合成的β_內醯胺抗生素的方法，所述方法包括經活化的側鏈與β_內醯胺核心的酶促偶聯，其特徵在於使用如權利要求1所述的突變體原核青黴素G醯基轉移酶。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述半合成的β-內醯胺抗生素選自由半合成的青黴素和半合成的頭孢菌素組成的組。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述半合成的青黴素是阿莫西林或氨苄西林。
8.根據權利要求6所述的方法，其中所述半合成的頭孢菌素是頭孢氨苄、頭孢羥氨苄或頭孢拉定。
9.用於在存在權利要求1定義的醯基轉移酶時生產阿莫西林的方法，所述酶催化活化形式的HPG與6-ΑΡΑ的偶聯，其中經活化的HPG與6-ΑΡΑ的摩爾比≤3.0，並且以6-ΑΡΑ(摩爾/摩爾)為基礎並且在所述酶促偶聯反應後測量的阿莫西林產率≥90%，其中所述酶具有下述特性:從500mmole/升HPGM和530mmole/升6-APA生產阿莫西林，並且在測試A中所述條件下進行的轉化結束時產生少於5mmole/升的6-APA。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述經活化的HPG是選自甲基酯和乙基酯組成的組的酯
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述經活化的HPG與6-APA的摩爾比≤2.5。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述經活化的HPG與6-APA的摩爾比≤2.0。
13.根據權利要求9所述的方法，其中所述經活化的HPG與6-APA的摩爾比≤1.5。
14.根據權利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林產率≥91%。
15.根據權利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林產率≥92%。
16.根據權利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林產率≥93%。
17.根據權利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林產率≥94%。
18.根據權利要求9所述的方法，其中所述阿莫西林產率≥95。
【文檔編號】C12N15/55GK103642780SQ201310325865
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2009年12月22日 優先權日:2008年12月23日
【發明者】簡·米特斯卡·拉恩·范德, 哈羅德·莫洛·穆迪, 理察·克爾曼, 託馬斯·杜斯·范德 申請人:中化帝斯曼製藥有限公司荷蘭公司