一種雞常見食源性細菌四重螢光pcr檢測試劑盒及使用方法
2023-10-22 09:22:07 3
一種雞常見食源性細菌四重螢光pcr檢測試劑盒及使用方法
【專利摘要】本發明公開了一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒及使用方法，試劑盒包含了螢光PCR反應液以及產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7和空腸彎曲桿菌的標準品，其中螢光PCR反應液含有TaqDNA聚合酶、PCR反應緩衝液、Mg2+、dNTPs、四對細菌的特異性引物和相應的四種螢光探針。本發明運用四重螢光PCR，能快速、準確地檢測產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157：H7和空腸彎曲桿菌4種雞攜帶的主要食源性病原菌，可用於細菌的鑑定、疾病的診斷和流行病學調查。
【專利說明】—種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物檢測【技術領域】，具體涉及一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒，還涉及一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒的使用方法。
【背景技術】
[0002]產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌是雞攜帶的4種最常見的食源性致病細菌，它們不僅嚴重危害我國養禽業，而且通過食品汙染感染人類，給人類健康造成威脅。
[0003]產氣莢膜梭菌為人畜共患病病原，也是食源性病原菌。雞群為產氣莢膜梭菌的主要宿主之一，產氣莢膜梭菌在雞體內為條件性致病菌，可引起雞壞死性腸炎，也有很多帶菌不發病的情況。人類誤食該菌汙染的雞肉製品等，可引起食物中毒。產氣莢膜梭菌是引起人食物中毒和氣腫疽的主要病原體。
[0004]沙門氏菌是一種常見的人畜共患病病原，該菌不僅能引起雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒等禽類疾病，危害養禽業，還能夠感染人類，引起胃腸炎、傷寒、敗血症及腸外灶性感染等多種疾病。據統計，沙門氏菌引起的食物中毒常列世界各國細菌性食物中毒榜首，我國內陸地區也以沙門氏菌為首位。其中沙門氏菌感染禽是經食物鏈傳染給人類的一個重要中介。
[0005]大腸桿菌0157:H7感染是一種食源性疾病，該菌可從雞肉、牛肉、奶牛或奶製品、蔬菜、飲料及水中分離到，其中雞群也是該菌的宿主之一。該菌為一種腸道出血性大腸桿菌，是食物中毒的原因之一。感染者通常發生出血性腹瀉，尤其在年輕兒童和年長者中，有時導致腎衰竭。世界各地多次爆發 大腸桿菌0157:H7感染，嚴重危害了公共衛生安全。
[0006]空腸彎曲菌是一種食源性人畜共患病病原菌，其中家禽特別是雞群為空腸彎曲桿菌的主要宿主之一,通常成年雞感染空腸彎曲桿菌無明顯症狀,然而食入空腸彎曲桿菌汙染的雞肉製品等，極易引起人類感染，導致急性腸胃炎，隨後還可以引起自身免疫性併發症，如格巴氏症候群和關節炎。空腸彎曲菌也是引起全世界人類細菌性腹瀉的主要原因之
O
[0007]雞群是以上4種細菌的主要宿主之一，然而這些細菌通常被雞攜帶卻未表現出對雞的致病性，或無明顯的病變，容易被被養殖者忽視，但是這些病原菌一旦汙染雞肉等食品，則會引起食品安全問題。世界各國已對食品安全高度重視，對雞肉製品等食品中微生物攜帶提出了明確的要求，從養殖開始控制與清除這些食源性細菌是避免食品汙染的關鍵。因此迫切需要一種可同時快速、準確地檢測雞群或雞肉製品中多種食源性致病菌的檢測方法。目前實驗室的診斷方法主要是依靠細菌的分離鑑定，但是該方法檢測時間長、操作繁瑣，也難以大批量進行。目前也有針對單個病原建立的PCR等檢測方法，但是尚未有能系統檢測雞或雞肉製品中多種食源性致病菌的方法與標準。實時螢光PCR快速、高效、敏感性好、特異性強，而且可以同時進行多種病原菌的檢測，已成為病原菌檢測的一種重要的方法。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是在於提供了一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒由螢光PCR反應液、陽性對照(產氣莢膜梭菌標準品、沙門氏菌標準品、大腸桿菌0157:H7標準品和空腸彎曲桿菌標準品)以及陰性對照品組成。以往在家禽中檢測病原菌多通過細菌的分離鑑定或運用針對單個菌的PCR檢測，本檢測試劑盒針對雞源最常見的4種食源性細菌，設計並篩選出互不幹擾的4對檢測引物與4條探針，4種雞主要食源性細菌檢測在一個反應中完成，更為高效，且敏感性好，特異性強，檢測下限達到lOcfu。
[0009]本發明還有一個目的是在於提供了一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒的使用方法，方法簡單，快速，所有檢測步驟可在2個小時內完成。
[0010]為了實現上述目的，本發明採取以下技術措施:
[0011]一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒，含有以下成分:
[0012]螢光PCR反應液:Taq DNA聚合酶、不含Mg2+的PCR反應緩衝液、Mg2+、dNTPs、產氣莢膜梭菌、沙門氏菌、大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌這4種細菌的特異性引物和相應的4種螢光探針。試劑盒中包含4對引物和4條探針序列如下:
[0013]表I特異性引物序列表
[0014]
【權利要求】
1.一種雞常見食源性細菌四重螢光PCR檢測試劑盒，該試劑盒包括:螢光PCR反應液、陽性對照，四對細菌的特異性引物:CPO1、CP02、SEO1、SE02、ECO 1、EC02、CJO1、CJ02和四種螢光探針:CPP、SEP、ECP、CJP ； 所述的螢光PCR反應液為:rTaq DNA聚合酶、不含Mg2+的10XPCR反應緩衝液、25mMMg2+ 和 IOmM dNTPs ； 所述的陽性對照為:產氣莢膜梭菌；沙門氏菌；大腸桿菌0157:H7和空腸彎曲桿菌的標準品或產氣莢膜梭菌基因陽性質粒；沙門氏菌基因陽性質粒；大腸桿菌0157:H7rfbB基因陽性質粒和空腸彎曲噶桿菌ccoN基因陽性質粒； 所述的特異性引物為:
2.權利要求1所述試劑盒的使用方法，具體如下: 1)樣品的處理與DNA模板的提取: 使用試劑盒提取DNA模板，取5 μ I作為待測樣品，每次檢測均應設立陽性對照和陰性對照； 2)反應體系與反應參數: 反應體系如下:
【文檔編號】C12Q1/68GK103436626SQ201310417980
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】張騰飛, 王紅琳, 羅玲, 張蓉蓉, 羅青平, 溫國元, 邵華斌 申請人:湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所