一種重組人血小板生成素的製備方法及其製劑的製作方法
2023-10-23 21:36:52 1
一種重組人血小板生成素的製備方法及其製劑的製作方法
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及到一種重組人血小板生成素的製備方法及其製劑。本發明的製備方法為：設計PCR引物擴增目的基因，構建重組表達質粒，篩選高表達細胞克隆，培養工程細胞，純化。其中，純化的步驟為：超濾濃縮、DEAE離子交換層析、Source15反相層析、超濾濃縮、分子篩層析。本發明還涉及一種含有重組人血小板生成素的製劑，所述的製劑為液體製劑，含有重組人血小板生成素、穩定劑和緩衝鹽，穩定劑為磺丁基醚β環糊精，濃度為1～2wt%。本發明的方法製備得到的重組人血小板生成素的純度為98.0～99.9%，活性為3.0×105～3.6×105U/mg，並且重組人血小板生成素的得率提高。
【專利說明】一種重組人血小板生成素的製備方法及其製劑
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥【技術領域】，具體涉及到一種重組人血小板生成素的製備方法及其製劑。
【背景技術】
[0002]上世紀50年代，Kelemen等發現並提出體內存在著一種能夠刺激血液中血小板生成的體液因子，並命名為ThiOmbopoietin(TPO),它對巨核細胞系統的發育和成熟有明顯促進作用，但由於來源不足和缺乏適當的純化手段，一直沒有得到高純度的TPO樣品，致使幾十年來對其研究幾乎沒有進展。直到1994年，美國、日本等幾個研究小組相繼報導了人、鼠TPO cDNA的全長序列，並完成了基因克隆、表達、純化和鑑定。
[0003]國際專利W09518858公開了重組人血小板生成素cDNA序列及合成、所採用的質粒的構建及培養和純化手段，該專利採用的純化手段操作工序複雜、產率較低、蛋白純度不能滿足臨床需要，700L培養液最後僅獲得蛋白250mg，純度僅能保證90%以上。
[0004]專利ZL01126803.4公開了一種新的重組人血小板生成素cDNA序列，該序列前N-39個胺基酸密碼子發生了突變，從而可提高重組人血小板生成素的表達，但未見該專利公開其蛋白表達量和純化方法。
[0005]專利ZL00109612.5公開了重組人血小板生成素特定的培養條件、純化方法和製劑組成，該專利所採用的純化工藝複雜，需經過超濾、陽離子交換層析、凝膠層析、陰離子交換層析、反相高效液相層析和凝膠過濾層析等多個步驟方可獲可藥用的蛋白，且最後40L培養液僅獲得260mg蛋白，收率較低，不適合大規模生產。
[0006]綜上所述，目前仍需對表達系統的選擇、培養方法的選擇、純化工藝的建立等方面進行深入的研究已獲得高收率、低成本的重組人血小板生成素。
[0007]專利ZL01126803.4公開了重組人血小板生成素製劑所採用的穩定劑為人血白蛋白，由於國內人血白蛋白資源緊張且存在一定的安全風險，因而我們對穩定劑進行了研究和選擇，發現在檸檬酸和檸檬酸鈉的緩衝鹽體系下，磺丁基醚β環糊精對重組人血小板生成素有良好的穩定作用。
【發明內容】
[0008]本發明的首要發明目的在於提出了一種重組人血小板生成素的製備方法。
[0009]本發明的第二發明目的在於提出了一種重組人血小板生成素的製劑。
[0010]為了實現本發明的目的，採用的技術方案為:
[0011]一種重組人血小板生成素的製備方法，具體包括以下步驟:
[0012](I)設計PCR引物擴增目的基因:將人胚腎細胞獲得的TPO-cDNA序列與設計的引物進行
[0013]擴增，擴增重組人血小板生成素cDNA序列的PCR引物為:上遊引物的核苷酸序列如[0014]SEQ ID NO:1所示，下遊引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；
[0015](2)構建重組表達質粒:將質粒pLIOl和擴增得到的TPO-cDNA重組，得到重組pLIOl/TPO 質粒；
[0016](3)篩選高表達細胞克隆:pL101/TP0轉化至CHO細胞後通過反覆轉染、硫氨甲硫氨酸篩選獲得高表達的克隆細胞，作為工程細胞；
[0017](4)培養工程細胞；
[0018](5)純化:培養獲得的上清液依次採用第一次超濾、DEAE離子交換層析、SourCel5反相層析、第二次超濾濃縮、分子篩層析的純化手段獲得重組人血小板生成素。
[0019]本發明的第一優選技術方案為:在步驟(4)中，工程細胞的培養條件為:採用ExCel 1325-PF無血清培養基，葡萄糖的添加量為0.5~1.5g/L，無水碳酸氫鈉的添加量為1.0 ~2.5g/L。 [0020]本發明的第二優選技術方案為:在步驟(5)中，DEAE離子交換層析的條件為:用平衡緩衝液平衡層析柱(填料DEAE-S印harose FF，層析柱規格XK50/100)，經過第一次超濾後的樣品上柱，流速20~30ml/min ;上樣完畢，用平衡緩衝液衝洗至UV值接近基線；用洗滌緩衝液洗滌樣品，流速為40~50mL/min ;用平衡緩衝液平衡柱子，流速40~50mL/min ;平衡完畢，用洗脫液洗脫，流速40~50mL/min ;收集洗脫過程的紫外峰。其中，平衡緩衝液為20mmol/L PB 的溶液，pH7.0 ;洗漆緩衝液為含有 6mol/L Urea、1.2mmol/L 甘氨酸、0.6ml/LHAc的混合溶液，所述的洗脫液為含有20mmol/L PBU50mmol/LNacl的混合溶液，pH7.0 ；用量為3~5個柱體積。
[0021]本發明的第三優選技術方案為:在步驟(5)中，S0urcel5RPC反相層析的條件為:用平衡緩衝液平衡S0urcel5RPC反相層析柱，流速20~30mL/min ;樣品上柱，流速10~20mL/min ;用平衡緩衝液衝洗至UV值接近基線，流速20~30mL/min ;連續梯度洗脫樣品，起始梯度 100%Buffer A、0%Buffer B ;最終梯度 0%Buffer A、100%Buffer B ;梯度時間60min,流速30mL/min ;收集洗脫梯度從45%Buffer B到75%Buffer B的蛋白洗脫峰；梯度結束，換用梯度，從0%Buffer A、100%Buffer B到 100%Buffer A、0%Buffer B，梯度時間 IOmin ;BufferA為Smmol /T, Tris/Hcl溶液，pH8.5, Buffer B為85%乙醇溶液。其中，平衡緩衝液為5mmol/LTris/HCl的溶液，pH8.5，用量為3~5個柱體積。
[0022]本發明的第四優選技術方案為:在步驟(5)中，所述的S-200分子篩層析(填料粒徑為ΙΟμπι~40μπι，層析柱規格XK50/100)的條件為:檸檬酸緩衝液平衡柱子，把得到的超濾濃縮液分幾次上樣，上樣體積為柱體積的3~5%，流速為5~10mL/min ;上樣完畢，用檸檬酸緩衝液洗脫，流速5~10mL/min，收集洗脫峰。其中，檸檬酸緩衝液為含有20mmol/L檸檬酸、150mmol/L NaCl的混合溶液，pH6.9。
[0023]本發明的第五優選技術方案為:本發明製備得到的重組人血小板生成素的純度為98.0 ~99.9%,活性為 3 X IO5 ~3.6 X 105U/mg。
[0024]本發明還涉及採用製備方法製備的重組人血小板生成素的製劑，所述的製劑為液體製劑，所述的製劑中含有重組人血小板生成素、穩定劑和緩衝鹽，所述的穩定劑為磺丁基醚β環糊精，所述的緩衝劑為檸檬酸與檸檬酸鈉組成的緩衝體系。
[0025]其中，所述製劑中每毫升含有重組人血小板生成素40~80 μ g、檸檬酸鈉5.2~
6.6mg、檸檬酸0.04~0.08mg、NaC15.2~6.6mg、磺丁基醚β環糊精10~20mg ;優選含有重組人血小板生成素60 μ g、檸檬酸鈉5.8mg、檸檬酸0.06mg、NaC15.8mg、磺丁基醚β環糊精 10 ~15mg，pH 為 6.4 ~7.4，優選 6.8 ~7.2。
[0026]下面對本發明的技術方案做進一步的解釋和說明:
[0027]本發明在文獻(GenebankL33410, Human c_mpl ligand (ML) mRNA, complete cds)報導TPO的cDNA序列的基礎上，從新設計引物，構建新的TPO的cDNA序列，並構建了該重組蛋白的真核細胞表達載體，轉染CHO細胞，經大量篩選，獲得了一株可穩定高表達重組蛋白的細胞株，表達產物經初步鑑定，確定為完整的目的蛋白分子。在此基礎上，本發明開發了相應的CHO細胞無血清高密度連續培養技術，高效表達重組蛋白，根據該蛋白的特性，又開發和優化了下遊純化技術，進行了中試工藝研究，經離子交換層析、反相層析和分子篩層析，獲得了純度和其它主要理化、安全及活性指標滿足臨床試驗用途基本要求的重組蛋白，其純度在98%以上，原液蛋白表達量在60mg~100mg/L水平，50L培養液可獲得純度98%以上的 TPO 為 800 ~1200mg。
[0028]本發明針對人胚腎細胞獲得的TPO-cDNA序列5』 -端起始密碼子ATG附近的序列及3』 -端終止密碼後的序列設計PCR引物，示意圖如圖1所示。
[0029]5，-端引物為:5，-ACGCCCGGGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTG-3，；
[0030]3，-端引物為:5，-ACGTGATCAT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA-3，。
[0031]本發明選用表達載體pLIOl,總長約9kb,該質粒的示意圖如圖2所示。該質粒帶有人巨細胞病毒(CMV)增強子、SV40病毒的加「polyA」信號，另外還有穀氨醯胺合成酶基因作為基因擴增及篩選標誌。此外，還有一些在大腸桿菌中擴增質粒所必須的元件，如青黴素抗性基因、原核複製起始點等。該質粒轉染至CHO細胞後，在不含有穀氨醯胺的培養基中，加入穀氨醯胺合成酶的抑制劑硫胺甲硫氨酸(MSX)，可殺死未轉染入該質粒的細胞，從而篩選出含有該質粒細胞克隆`。將質粒PLlOl和擴增得到的TPO-cDNA重組，得到進行BclI和smal雙酶切後按照質粒pLIOl操作說明書將擴增的TPO-cDNA插入到質粒pLIOl獲得pLIOl/TPO。pLIOl/TPO轉化至CHO細胞後通過反覆轉染及硫氨甲硫氨酸篩選獲得高表達的克隆細胞，作工程細胞。擴增的工程細胞，採用連續灌注懸浮培養工藝，採用ExCell325-PF無血清培養基，添加的葡萄糖量為0.5~1.5g/l，添加的無水碳酸氫鈉量為1.0~2.5g/l。培養結束獲得的上清液依次採用了超濾、DEAE離子交換層析、Sourcel5反相層析、超濾濃縮、分子篩層析的純化手段獲得純度大於98%的重組人血小板生成素。
[0032]本發明還涉及該重組人血小板生成素的製劑，所述的製劑中含有重組人血小板生成素、穩定劑和緩衝鹽，所述的穩定劑為磺丁基醚β環糊精，所述的緩衝劑為檸檬酸與檸檬酸鈉組成的緩衝體系，穩定劑的濃度為I~2wt%。其中，所述製劑中每毫升含有重組人血小板生成素40~80 μ g、檸檬酸鈉5.2~6.6mg、檸檬酸0.04~0.08mg、NaC15.2~6.6mg、磺丁基醚β環糊精10~20mg ;優選含有重組人血小板生成素60 μ g、檸檬酸鈉5.8mg、檸樣酸 0.06mg、NaC15.8mg、橫丁基釀 β 環糊精 10 ~15mg, pH 為 6.4 ~7.4。
[0033]採用本發明的穩定劑對於人血小板生成素具有非常好的穩定作用，並且價格低廉，安全性高。而普遍採用的人血白蛋白不僅資源緊張，並且具有一定的安全隱患。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0034]圖1為PCR引物設計示意圖；[0035]圖2為質粒pLIOl結果示意圖；
[0036]圖3為SEC-HPLC檢測DEAE離子交換層析收集液的色譜圖；
[0037]圖4為SEC-HPLC檢測S-200分子篩層析洗脫液的色譜圖。
[0038]下面的實施例將對本發明作更具體的解釋，但本發明並不僅僅局限於這些實施例，同樣這些實施例也不以任何方式限制本發明。
[0039]實施例1:重組人血小板生成素的製備
[0040]1.以下為國外報導的人TPO cDNA序列，針對其5』 -端起始密碼子ATG附近的序列及3』 -端終止密碼後的序列設計了一對PCR引物，示意圖如圖1。
[0041]上遊引物為:5，-ACGCCCGGGGCCAGAATGGA GCTGACTGAA TTG-3』其中 CCCGGG 為 smaI酶切位點；
[0042]下遊引物為:5』-ACGTGATCAT GATGTCGGCA GTGTCTGAGA-3』 其中 TGATCA 為 Bcl I酶切位點。
[0043]2.構建重組表達質粒:
[0044]將人胚腎細胞獲得的TPO-cDNA與設計的引物進行cDNA擴增。表達載體為pLIOl，總長約9kb，示意圖如圖2。帶有人巨細胞病毒(CMV)增強子、SV40病毒的加「polyA」信號，另外還有穀氨醯胺合成酶基因作為基因擴增及篩選標誌。此外，還有一些在大腸桿菌中擴增質粒所必須的元件，如青黴素抗性基因、原核複製起始點等。該質粒轉染至CHO細胞後，在不含有穀氨醯胺的培養基中，加入穀氨醯胺合成酶的抑制劑硫胺甲硫氨酸(MSX)，篩選出含有該質粒細胞克隆。
[0045]3.篩選高表達細胞克隆:
[0046]將質粒pLIOI和擴增的TPO-cDNA進行Bcl I和sma I雙酶切後按照質粒pLIOl操作說明書將擴增的TPO-cDNA插入到質粒pLIOl獲得pL101/TP0。裝有rh_TP0 cDNA的表達載體pLIOl/TPO，經細菌培養、QIAGEN公司試劑盒純化，獲得可用於轉染CHO細胞的高純度質粒。將CHO傳代入0 60mm培養皿中，待細胞生長至50~60%滿時，準備進行轉染。
[0047]取無血清DMEM培養基各0.3mL，分別加入2支無菌凍存管中，分別加入轉染用質粒10 μ L和Lipofectamine?20 μ L，室溫放置30min，將兩管混合，室溫繼續放置5~lOmin。將培養皿中的含血清培養基吸掉，用不含血清的培養基輕輕衝洗細胞，加入2mL無血清培養基和混合好的試劑。將細胞置37°C二氧化碳培養箱中繼續孵育5~12h。加入5mL完全培養基，繼續培養48h。將細胞用0.25%胰蛋白酶溶液消化後，傳代入IOOmm培養皿中繼續培養過夜。次日，細胞貼壁後，更換培養液。換為含10%透析血清(GIBC0 BRL)的DMEM培養液，加入25 μ mol/L的篩選劑硫氨甲硫氨酸(MSX, sigma)。約10~14天後,細胞開始大量死亡，並出現一些小島狀的克隆。用記號筆在平皿底部標記肉眼可見的克隆，用克隆環挑選克隆，加入24孔培養板中培養。待細胞在24孔培養板中生長至半滿以上後，取上清檢測TPO活性，挑選出陽性克隆。並進一步反覆比較各克隆的目標蛋白活性，篩選出3~5個最高的表達細胞株，編號，凍存細胞。反覆重複上述轉染、篩選過程，比較各批保留的相對較高表達量的細胞克隆，從至少5批轉染和400個原始克隆中最終篩選出3個表達量最高的克隆。將最終確定的3個克隆用I個月以上的時間，逐步適應到無血清培養基。並用無血清凍存液凍存細胞。繼續對上述3個細胞克隆及其產物進行比較，確定一個表達量最高的克隆。[0048]細胞株經鑑定後，將在含有篩選劑，但不含有血清的培養基中培養擴增，凍存，建立原始細胞庫。原始細胞庫的細胞用不含有血清、不含有篩選劑的培養液培養擴增，凍存，建立主細胞庫。主細胞庫的細胞復甦後，應凍還，同時擴增建立生產用細胞庫。
[0049]4.培養工程細胞:
[0050]細胞罐採用溶積為IOL的連續細胞反應器(B.BRAUN生物反應器)，加入ExCell325-PF無血清培養基7L(每升中另加入葡萄糖0.9g，無水碳酸鈉1.8g)。將已經過方瓶培養的1800ml細胞接種液加入其中，控制反應器專屬50~60rp/min，溫度37±0.3°C,含氧量40 ±5%，pH7.2~7.4，日灌流量10L，日收穫上清液10L。
[0051]5.純化:
[0052]5.1培養上清超濾濃縮:
[0053]連接好管道和蠕動泵，以70L/m2注射用水衝洗濾膜，開始濃縮離心後的培養上清，至體積小於500mL，將超濾液用純水稀釋5倍，繼續超濾濃縮至原體積，收穫超濾濃縮液，以500mL緩衝液(20mmol/L PB, pH7.0)衝洗出殘留濃縮液。以70L/m2注射用水(事先經0.45 μ m濾膜過濾)衝洗濾膜後，用40°C預熱的0.lmol/L NaOH (體積按10L/m2)循環清洗濾膜及管道lh，濾膜4°C保存於0.lmol/L NaOH中。將濃縮後上清9000rpm，20min離心。
[0054]5.2DEAE離子交換層析:
[0055]用3個柱體積平衡緩衝液(20mmol/L PB, pH7.0)平衡柱子(填料DEAE-S印haroseFF，層析柱規格XK50/100)，流速50mL/min ;超濾後樣品上柱，流速30mL/min ;上樣完畢，用平衡緩衝液衝洗柱子，至UV值接近基線，流速50mL/min ;用3個柱體積洗滌緩衝液(6mol/LUrea, 1.2mmol/L甘氨酸,0.6ml/L HAc)洗漆樣品,流速50mL/min ;用3個柱體積平衡緩衝液平衡柱子，流速50mL/min `;平衡完畢，用洗脫液(20mmol/L PB, 150mmol/LNacl,pH7.0)洗脫柱子，流速50mL/min ;收集洗脫過程的紫外峰；3個柱體積2mol/L Nacl溶液再生柱子，流速50mL/min ;用5個柱體積注射用水衝洗柱子,流速50mL/min ;離子交換柱使用多次後應用0.5mol/L NaOH清洗再生柱子，流速50mL/min，清洗完畢用注射用水衝洗柱子流速50mL/min。層析結束用3個柱體積的20%乙醇保存柱子，流速50mL/ml，收集液採用SEC-HPLC檢測，色譜圖如圖3所示。
[0056]5.3Sourcel5RPC 反相層析(FineLine Pilot35):
[0057]用3個柱體積平衡緩衝液(5mmol/L Tris/HCl, pH8.5)平衡柱子，流速30mL/min ；樣品上柱，流速20mL/min ;用平衡緩衝液衝洗柱子，至UV值接近基線，流速30mL/min ;連續梯度洗脫樣品，起始梯度 100%Buffer A (Smmol/T, Tris/Hcl, ρΗ8.5)、0%Buffer B (85%乙醇溶液)；最終梯度0%Buffer A、100%Buffer B ;梯度時間60min，流速30mL/min ;收集洗脫梯度從45%Buffer B到75%Buffer B的蛋白洗脫峰；梯度結束，換用梯度，從0%BufferA、100%Buffer B 到 100%Buffer A、0%Buffer B，梯度時間 lOmin。梯度結束，Buffer A 衝洗2個柱體積，流速30mL/min ;使用2個柱體積0.5mol/L NaOH溶液清洗再生柱子，流速30mL/min,然後，再次以5個柱體積Buffer A平衡柱子，流速30mL/min ;換用梯度，從100%Buffer A、0%Buffer B 到 0%Buffer A、100%Buffer B，梯度時間 lOmin，梯度結束，3 個柱體積BufferB平衡並保存柱子,流速30mL/min ；
[0058]5.4超濾濃縮
[0059]連接好管道和蠕動泵，以70L/m2注射用水衝洗濾膜，開始濃縮合併的反相層析洗脫液，至體積小於IOOmL,收穫超濾濃縮液，以50mL20mmol/L檸檬酸緩衝液(內含150mmol/LNaCl, pH6.9)衝洗出殘留濃縮液。以70L/m2注射用水(事先經0.45 μ m濾膜過濾)衝洗濾膜後，用40°C預熱的0.lmol/L NaOH (體積按10L/m2)循環清洗濾膜及管道lh，濾膜4°C保存於保存液0.lmol/L NaOH中。
[0060]5.5S-200分子篩層析
[0061]用20mmol/L檸檬酸緩衝液(內含150mmol/L NaCl, pH6.9)平衡柱子(填料粒徑為ΙΟμπι~40μπι，層析柱規格XK50/100)，流速10mL/min。把超濾濃縮液分幾次上樣(上樣體積不大於柱體積的5%),流速10mL/min。上樣完畢，用20mmol/L檸檬酸緩衝液(內含150mmol/LNaCl,pH6.9)洗脫柱子，流速10mL/min，收集洗脫峰。洗脫液採用SEC-HPLC檢測，色譜圖如圖4所示。層析結束，用3個柱體積的20%乙醇保存柱子,流速10mL/min。上述5天獲得的50L培養液共分離得rh-TPO約為1020mg，蛋白純度為98.5%，活性為3.6 X IO5U/mg。
[0062]實施例2:
[0063]按照表1的比例，取實施例1製備得到的重組人血小板生成素進一步製備液體製劑，製備方法為:先按重量比配製含有檸檬酸鈉、檸檬酸、NaCl的緩衝溶液，然後按重量比加入重組人血小板生成素、磺丁基醚β環糊精；最後經除菌過濾後灌裝。
[0064]表1:
[0065]
【權利要求】
1.一種重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)設計PCR引物擴增目的基因:將人胚腎細胞獲得的TPO-CDNA序列與設計的引物進行擴增，擴增重組人血小板生成素cDNA序列的PCR引物為:上遊引物的核苷酸序列如SEQID NO:1所示，下遊引物的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示； (2)構建重組表達質粒:將質粒pLIOl和擴增得到的TPO-cDNA重組，得到重組pLlOl/TPO質粒； (3)篩選高表達細胞克隆:pL101/TP0轉化至CHO細胞後通過反覆轉染、硫氨甲硫氨酸篩選獲得高表達的克隆細胞，作為工程細胞； (4)培養工程細胞； (5)純化:培養獲得的上清液依次採用第一次超濾、DEAE離子交換層析、SourCel5反相層析、第二次超濾濃縮、分子篩層析的純化手段獲得重組人血小板生成素。
2.根據權利要求1所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，在步驟(4)中，工程細胞的培養條件為:採用ExCell325-PF無血清培養基，葡萄糖的添加量為0.5~1.5g/L,無水碳酸氫鈉的添加量為1.0~2.5g/L。
3.根據權利要求1所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中，DEAE離子交換層析的條件為:用平衡緩衝液平衡層析柱，經過第一次超濾後的樣品上柱，流速20~30ml/min ;上樣完畢，用平衡緩衝液衝洗至UV值接近基線；用洗滌緩衝液洗滌樣品，流速為40~50mL/m in ;用平衡緩衝液平衡柱子，流速40~50mL/min ;平衡完畢，用洗脫液洗脫，流速40~50mL/min ;收集洗脫過程的紫外峰。
4.根據權利要求2所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，平衡緩衝液為20mmol/L PB的溶液，pH7.0 ;洗漆緩衝液為含有6mol/L Urea、1.2mmol/L甘氨酸、0.6ml/LHAc的混合溶液，所述的洗脫液為含有20mmol/L PBU50mmol/LNacl的混合溶液，pH7.0 ；用量為3~5個柱體積。
5.根據權利要求1所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中，Sourcel5RPC反相層析的條件為:用平衡緩衝液平衡S0urcel5RPC反相層析柱，流速20~30mL/min ;樣品上柱,流速10~20mL/min ;用平衡緩衝液衝洗至UV值接近基線,流速20~30mL/min ;連續梯度洗脫樣品，起始梯度100%Buffer A、0%Buffer B ;最終梯度0%Buffer A、100%Buffer B ;梯度時間 60min,流速 30mL/min ;收集洗脫梯度從 45%BufferB到75%Buffer B的蛋白洗脫峰；梯度結束，換用梯度，從0%Buffer A、100%Buffer B到100%Buffer A、0%Buffer B,梯度時間 IOmin ；Buffer A 為 5mmol/L Tris/Hcl 溶液，ρΗ8.5,Buffer B為85%乙醇溶液。
6.根據權利要求4所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，平衡緩衝液為5mmol/L Tris/HCl的溶液，pH8.5，用量為3~5個柱體積。
7.根據權利要求1所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，在步驟(5)中，所述的S-200分子篩層析的條件為:檸檬酸緩衝液平衡柱子，把得到的超濾濃縮液分幾次上樣，上樣體積為柱體積的3~5%,流速為5~10mL/min ;上樣完畢,用檸檬酸緩衝液洗脫，流速5~10mL/min,收集洗脫峰；所述的檸檬酸緩衝液優選為含有20mmol/L檸檬酸、1 SOmmoI /T, NaCl 的混合溶液，pH6.9。
8.根據權利要求1~7任意一項權利要求所述的重組人血小板生成素的製備方法，其特徵在於，所述的重組人血小板生成素的純度為98.0~99.9%，活性為3.0X105~`3.6X105U/mg。
9.一種含有如權利要求1所述的製備方法製備的重組人血小板生成素的製劑，其特徵在於，所述的製劑為液體製劑，含有重組人血小板生成素、穩定劑和緩衝鹽，所述的穩定劑為磺丁基醚β環糊精，濃度優選為I~2wt% ;所述的緩衝劑為檸檬酸與檸檬酸鈉組成的緩衝體系。
10.根據權利要求8所述的的製劑，其特徵在於，所述的製劑中每毫升含有重組人血小板生成素40~80 μ g、檸檬酸鈉5.2~6.6mg、檸檬酸0.04~0.08mg、NaC15.2~6.6mg、磺丁基醚β環糊精10~20mg ;優選含有重組人血小板生成素60 μ g、檸檬酸鈉5.8mg、檸檬酸 0.06mg、NaC15.8mg、橫`丁基釀 β 環糊精 10 ~15mg ；pH 為 6.4 ~7.4,優選 6.8 ~7.2。
【文檔編號】C07K14/52GK103555760SQ201310491722
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】鍾正明 申請人:江蘇康禾生物製藥有限公司