一種酶法製備瑞鮑迪甙m的方法
2023-10-24 10:54:22
一種酶法製備瑞鮑迪甙m的方法
【專利摘要】本發明涉及一種酶法製備瑞鮑迪甙M的方法，該方法以瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D為底物，使底物在蔗糖、UDP的存在下，在UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的混合物或含有UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的重組細胞的催化下反應生成瑞鮑迪甙M，反應在溫度20℃~60℃以及pH5.0~9.0的水相體系中進行。本發明提供的酶法製備瑞鮑迪甙M的方法具有重要的應用價值。與已有從甜菊葉中提取瑞鮑迪甙M的技術相比，本發明方法生產周期顯著縮短，產能提高，成本較低，且可提供純度更高的產品，因而能更經濟的用於食品飲料業。
【專利說明】一種酶法製備瑞鮑迪甙M的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種瑞鮑迪甙M的製備方法，特別涉及一種瑞鮑迪甙M的生物製備方法。
【背景技術】
[0002]糖的替代物可以分為四類，它們對人體健康的影響各不相同。第一類是果汁、蜂蜜及楓樹糖漿等天然甜味劑，這些甜味劑的熱量及碳水化合物的含量與蔗糖相似。第二類是人工甜味劑，如阿斯巴甜及糖精等，無熱量，被認為是無營養的甜味劑。第三類是糖醇，如木糖醇及山梨醇等，主要來自蔬菜及水果。第四類是從天然植物中提取的甜味物質，如從甜菊中提取的甜菊糖。人工甜味劑，糖醇和提取甜味劑的甜度均比蔗糖高很多倍，有的能達到數百倍，所以添加量相對蔗糖可以大量的減少。
[0003]甜菊是一種具有重要經濟價值的作物，甜菊葉片中含有很高含量的甜菊糖。目前已經在甜菊中鑑定出來100多種化合物，最為人們熟知的就是甜菊糖，特別是甜菊糖苷和瑞鮑迪式A (J.Agric.Food Chem.，2012，60，886-895)。最近一種新型的甜菊糖在一株甜菊雜交株 Morita 中被發現(2010，J.Appl.Glycosc1.，57，199-209)。
[0004]申請號為201310353500.9的專利公開了瑞鮑迪甙M的生物製備方法，該方法以瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D為底物，使底物在葡萄糖基供體存在下，在UDP-葡萄糖基轉移酶和/或含有UDP-葡萄糖基轉移酶的重組細胞的催化下反應生成瑞鮑迪甙M。但是該專利中的工藝不夠優化，轉化率最高僅為80%左右，且純度僅為95%，底物濃度較低，生產成本較高，不適合產業化生產。
【發明內容】
`[0005]本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種酶法製備瑞鮑迪甙M的方法，該方法可以較低的成本生產出更高純度的瑞鮑迪甙M產品。
[0006]為解決以上技術問題，本發明採取如下技術方案:
[0007]一種酶法製備瑞鮑迪甙M的方法，該方法以瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D為底物，使所述底物在蔗糖、m)P的存在下，在UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶(AtSUSl)的混合物或含有UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的重組細胞的催化下反應生成瑞鮑迪甙M，所述反應在溫度20°C~60°C以及pH5.0~9.0的水相體系中進行，在反應體系中，所述的瑞鮑迪甙A的濃度大於等於10g/L，所述的瑞鮑迪甙D的濃度大於等於15g/L，所述反應結束後，反應液經離心後，將上清液經大孔吸附樹脂分離即得瑞鮑迪甙M粗品溶液，將所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中結晶，即得純度大於98%的所述瑞鮑迪甙M產品。
[0008]優選地，在起始反應體系中，所述的瑞鮑迪甙A的濃度為10~30g/L，所述的瑞鮑迪甙D的濃度為15~50g/L。
[0009]優選地，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A和/或來自水稻的UGT-B。[0010]優選地，使所述反應在溫度35°C~45°C以及pH6.5~8.5的水相體系中進行。
[0011]優選地，採用含有UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的重組細胞來進行所述催化，所述反應的體系中還含有體積比濃度為1%~3%的甲苯或其它細胞通透劑。
[0012]優選地，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶和所述的蔗糖合成酶的重量比為1:0.2~
0.4。
[0013]優選地，所述的方法實施如下:將反應所用的全部原料加入到反應釜中，用所述的水相體系定容，混合均勻後，置於設定溫度下，攪拌反應。
[0014]優選地，所述的重組細胞為微生物細胞。
[0015]更優選地，所述的微生物為大腸埃希氏桿菌、釀酒酵母或畢赤酵母。
[0016]優選地，所述的底物為瑞鮑迪甙A，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A和來自水稻的UGT-B的混合物，所述來自甜菊的UGT-A的胺基酸序列與序列2具有至少80%的一致性；所述來自水稻的UGT-B的胺基酸序列與序列4具有至少80%的一致性。
[0017]更優選地，所述混合物中，來自甜菊的UGT-A和來自水稻的UGT-B的重量比為3~
5:1。
[0018]優選地，所述的底物為瑞鮑迪甙D，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A，所述甜菊的UGT-A的胺基酸序列與序列2具有至少80%的一致性。
[0019]優選地，所述的反`應液在所述的離心前，先在50~60°C下加熱並超聲處理50~70分鐘。
[0020]優選地，所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中結晶的具體步驟為:將所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液通過減壓蒸餾濃縮後離心，棄上清液，沉澱加水洗滌後離心，棄上清液，沉澱用體積比濃度為40%~70%的乙醇水溶液懸浮，加熱至60~70°C溶解，加水至乙醇水溶液的體積比濃度為20~30%，逐漸冷卻至室溫，結晶並析出固體後，抽濾並真空乾燥。
[0021]優選地，反應體系中還含有用於幫助所述的底物溶解的體積比濃度為3%~5%的二甲亞碸。
[0022]由於以上技術方案的實施，本發明與已有技術相比具有如下優勢:
[0023]本發明提供的酶法製備瑞鮑迪甙M的方法具有重要的應用價值，通過對助溶劑、反應溫度及PH的優化及控制，使得轉化率和純度都得到提高，生產成本降低，適合工業化生產。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明實施例7所得產品的氫核磁譜圖。
【具體實施方式】
[0025]本發明提供了一種酶法合成瑞鮑迪甙M的工藝，原料可以是瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D。
[0026]
【權利要求】
1.一種酶法製備瑞鮑迪甙M的方法，該方法以瑞鮑迪甙A或瑞鮑迪甙D為底物，使所述底物在蔗糖、UDP的存在下，在UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的混合物或含有UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的重組細胞的催化下反應生成瑞鮑迪甙M，所述反應在溫度20°C飛(TC以及pH 5.(T9.0的水相體系中進行，其特徵在於:在反應體系中，所述的瑞鮑迪甙A的濃度大於等於10g/L，所述的瑞鮑迪甙D的濃度大於等於15g/L，所述反應結束後，反應液經離心後，將上清液經大孔吸附樹脂分離即得瑞鮑迪甙M粗品溶液，將所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中結晶，即得純度大於98%的所述瑞鮑迪甙M產品。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:在起始反應體系中，所述的瑞鮑迪甙A的濃度為l(T30g/L，所述的瑞鮑迪甙D的濃度為15飛Og/L。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A和/或來自水稻的UGT-B。
4.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:使所述反應在溫度35°C~45°C以及pH6.5^8.5的水相體系中進行。
5.根據權利要求1 所述的方法，其特徵在於:採用含有UDP-葡萄糖基轉移酶和蔗糖合成酶的重組細胞來進行所述催化，所述反應的體系中還含有體積比濃度為1%~3%的甲苯或其它細胞通透劑。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的UDP-葡萄糖基轉移酶和所述的蔗糖合成酶的重量比為1:0.2、.4。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的方法實施如下:將反應所用的全部原料加入到反應釜中，用所述的水相體系定容，混合均勻後，置於設定溫度下，攪拌反應。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的重組細胞為微生物細胞。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於:所述的微生物為大腸埃希氏桿菌、釀酒酵母或畢赤酵母。
10.根據權利要求1至9中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於:所述的底物為瑞鮑迪甙A，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A和來自水稻的UGT-B的混合物，所述來自甜菊的UGT-A的胺基酸序列與序列2具有至少80%的一致性；所述來自水稻的UGT-B的胺基酸序列與序列4具有至少80%的一致性。
11.根據權利要求10所述的方法，其特徵在於:所述混合物中，來自甜菊的UGT-A和來自水稻的UGT-B的重量比為3~5:1。
12.根據權利要求1至9中任一項權利要求所述的方法，其特徵在於:所述的底物為瑞鮑迪甙D，所述的UDP-葡萄糖基轉移酶為來自甜菊的UGT-A，所述甜菊的UGT-A的胺基酸序列與序列2具有至少80%的一致性。
13.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的反應液在所述的離心前，先在5(T60°C下加熱並超聲處理50-70分鐘。
14.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液在乙醇水溶液中結晶的具體步驟為:將所述的瑞鮑迪甙M粗品溶液通過減壓蒸餾濃縮後離心，棄上清液，沉澱加水洗滌後離心，棄上清液，沉澱用體積比濃度為40%~70%的乙醇水溶液懸浮，加熱至6(T70°C溶解，加水至乙醇水溶液的體積比濃度為20-30%，逐漸冷卻至室溫，結晶並析出固體後，抽濾並真空乾燥。
【文檔編號】C12P19/56GK103757074SQ201410019981
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】陶軍華, 李國慶, 梁曉亮, 託馬斯·李, 格雷戈瑞·葉普, 侯茂奇, 陶鼎合 申請人:蘇州漢酶生物技術有限公司, 百事可樂公司