一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法

2023-10-24 04:34:57

專利名稱：一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法
技術領域：
本發明涉及一種製備大豆異黃酮苷元的方法，尤其是一種從雉科動物家雞的 乾燥砂囊內膜的雞內金中提取出雞內金酶，以雞內金酶水解大豆異黃酮苷糖基 製備其苷元的方法。
背景技術：
大豆異黃酮是一種含有芳香環的非類固醇化合物，迄今為止從大豆中共分
離出12種大豆異黃酮異構體，分為結合型的糖苷和游離型的苷元兩類，結合型 糖苷主要有染料木苷、大豆苷和黃豆苷等九種形式；苷元包括染料木素、大豆 素和黃豆黃素三種形式。此12種大豆異黃酮異構體因其母環特定位置上基團的 不同而具有不同的名稱。本發明下文提及的染料木苷、大豆苷和黃豆苷均為大 豆異黃酮異構體形式之一，本發明統稱為大豆異黃酮苷；而染料木素、大豆素 和黃豆黃素為染料木苷、大豆苷和黃豆苷被水解掉糖基後所對應的相應形式的 苷元，發明統稱為大豆異黃酮苷元。
大豆中約有50% 60%的異黃酮為染料木苷，染料木苷及其苷元染料木素 是目前研究比較多的一種大豆異黃酮成分。大豆異黃酮屬植物雌激素，是一類 重要的生理活性物質，許多研究表明大豆皂苷具有多種生理活性和良好的藥理 作用，如抗癌，調節免疫能力，防止心血管疾病，降血壓，降低血清中膽固醇 含量，以及抗血栓等作用，主要應用於醫藥、保健及化妝品等領域。
近年來的研究發現，大豆異黃酮苷中的糖基與其生物活性之間有著密切的 聯繫。大豆異黃酮苷元的雌激素受體活性比帶糖基的大豆異黃酮糖苷高至少倍 30倍。但目前市售的大豆異黃酮多是帶糖基的糖苷型，其活性較低。對於如何 將大豆異黃酮糖苷的糖基去掉，使其轉化為高活性的苷元，國內外都進行了較 多的研究。
申請號為200710029119.1的中國專利申請公開了一種大豆異黃酮的製備方 法，該專利申請利用鹽酸-乙醇回流水解的方法水解大豆異黃酮苷糖基，然而酸 鹼水解法存在對苷元破壞性大，汙染大，目的性差的缺點。
專利號為ZL 03133637X的中國專利公開了用微生物發酵的方法水解大豆 異黃酮苷糖基的方法，其水解酶來源於微生物發酵，轉化率為50 80%。
通過微生物發酵法產大豆異黃酮糖苷酶，成本較低，但其酶活力普遍不高， 且操作繁瑣。

發明內容
本發明為了克服現有技術所存在的技術問題，提供了一種操作簡單、 成本低廉而轉化率高的雞內金酶水解大豆異黃酮苷的糖基製備其苷元的方法。
本發明是這樣實現的
(1) 雞內金酶的製取
0)雞內金用不鏽鋼粉碎機粉碎成小於20目的顆粒成雞內金粉；
Cb)用磷酸或醋酸緩衝液浸提(a)的產物，磷酸或醋酸緩衝液濃度為0.2M/L， pH在3.0 7.0範圍，(a)的產物與磷酸或醋酸緩衝液按l:3 10的質量比混勻， 在4'C浸提3 36h;離心棄渣，得上清液；
(c) 往(b)的產物中添加硫酸銨至飽和或過飽和以沉澱雞內金酶蛋白，硫酸銨 濃度為35 70%;離心棄去清液，得到雞內金酶蛋白；
(d) 用磷酸或醋酸緩衝溶液溶解(c)的產物，磷酸或醋酸緩衝溶液濃度為 0.2M/L， pH為3.0 7.0， (c)的產物與磷酸或醋酸緩衝溶液按1:3 5的質量比混 勻；用玻璃紙袋透析除去硫酸銨，離心棄渣，即得雞內金酶液；
(2) 大豆異黃酮苷元的製備
(e) 大豆異黃酮苷用磷酸或醋酸緩衝液配製成1 100g/L的工作液；磷酸或 醋酸緩衝溶液濃度為0.2M/L， pH為3.0 7.0;
(f) 將(d)和(e)的產物混勻後進行酶反應，酶反應條件為溫度為10 40°C， 反應時間為3 30h， (d)與(e)的產物比例為l: 0.5 5;
(g) 在(f)歩驟反應終止後，加入乙酸乙酯，(g)的體積與乙酸乙酯比例為1:
1 3;採用機械震蕩或人工震蕩，充分震蕩萃取，靜置分層，上層即為製得的 大豆異黃酮苷元乙酸乙酯溶液；萃取2次，分別合併上層和下層；上層乙酸乙 酯通過蒸發回收後再次投入使用；下層磷酸或醋酸緩衝溶液通過濃縮可以回收 再次投入使用；
(h) 濃縮(g)的產物即為大豆異黃酮苷元，大豆異黃酮苷轉化率可達到60 97%。
本發明可用乙醇或硫酸銨兩種方法收集雞內金蛋白。如果用乙醇沉澱雞內
金酶蛋白時，上述(c)歩驟中加入上清液3 6倍的95%的乙醇以沉澱雞內金 酶蛋白；由於沉澱不用硫酸銨，所以在(d)步驟中就無需透析除去硫酸銨了。 實踐證明，以下為較佳的實踐方式
(1) 雞內金酶的製取將雞內金粉用0.2M/L、 pH5.0 7.0的磷酸或醋酸緩 衝溶液按1:6 8的質量比，4。C浸提取5 25h，離心棄渣，往上清液(含酶混 合物)屮加入3倍95%的乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上清液，收集酶蛋白，溶於 3倍浸提液體積的0.2M/L、 pH5.0 7.0磷酸或醋酸緩衝液中，即為雞內金酶液；
(2) 大豆異黃酮苷元的製備
① 酶解將大豆異黃酮苷用0.2M/L， pH5.0 7.0磷酸或醋酸緩衝液配製成 10 50g/L，與雞內金酶液混合，雞內金酶液和磷酸或醋酸緩衝液體積比為1: l 3，在溫度25 4(TC下反應12 24h。
② 提取反應混合液中加入2 3倍體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置 分層，上層是乙酸乙酯層，下層再用乙酸乙酯提取1 2次，合併上層即為大豆 異黃酮苷元乙酸乙酯溶液；
③ 濃縮通過蒸發揮幹乙酸乙酯層後，可得到轉化率為60 97%相應大豆 異黃酮異構體的苷元。
所述的大豆異黃酮苷為大豆苷、染料木苷及黃豆苷單體形式或大豆苷、染 料木苷及黃豆苷的混合物形式，通常統稱為大豆異黃酮苷；所述染料木素、大 豆素和黃豆黃素為染料木苷、大豆苷和黃豆苷被水解掉糖基後所對應的相應形 式的苷元，統稱為大豆異黃酮苷元。
本發明同現有技術相比，具有如下突出特點
1、 具有較高的食用安全性用動物酶水解大豆異黃酮苷糖基，製備大豆異 黃酮苷元。克服了現有技術酸鹼水解法所存在的對苷元破壞性大，汙染大，目 的性差等缺點；
2、 簡便易行，轉化率高較之微生物酶水解法該酶提取簡單，酶活力也較 高，轉化率可達到96%以上。
3、 水解較徹底該酶不僅可以水解單體苷一一大豆苷、染料木苷、黃豆苷，
變成相應的苷元，該酶也能把大豆苷、染料木苷、黃豆苷等混合苷水解成大豆 素、染料木素、黃豆黃素等混合苷元。
4、成本低廉水解酶的酶源取自動物體內，尤其是雞內金——食用時棄之 的稚科動物家雞的乾燥胃(沙囊內膜)內壁中獲取。
具體實施例方式
以下實施例的實驗結果是通過高效液相進行檢測後計算而得的 —— 水解後增加的大豆苷元含量
甘兀<守率=水解前大豆異黃酮苷總量 xioo%
實施例l:
a. 雞內金粉與0.2M/L, pH6.0的磷酸緩衝按1:5的質量比混合後，4。C浸 提取24h，離心棄渣，往上清液中添加硫酸銨至飽和以沉澱酶蛋白，收集蛋白， 溶於0.2M/L， pH6.0磷酸緩衝液中，用玻璃紙袋透析除去硫酸銨，離心棄渣， 即為酶液。
b. 將濃度為10g/L的大豆苷100mL和a.所述酶液100mL混合，在溫度25°C 條件下反應30小時。
c. 反應混合液中加入2倍反應體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層。 反應產物中大豆苷轉化成大豆素的轉化率為97.1%。
實施例2:
a. 雞內金粉和0.2M， pH5.0的醋酸緩衝按l:6的質量比混合後，4"C浸提取 3h，離心棄渣，往上清液中加入3倍體積的95%乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上清 液，收集蛋白，溶於醋酸緩衝液(0.2M， pH5.0)中，即為酶液。
b. 將40g/L的染料木苷100mL醋酸緩衝液(0.2M, pH5.0)和a.所述酶液 200mL混合，在溫度40。C條件下反應30小時。
c. 反應混合液中加入3倍反應體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層。 反應產物中染料木苷轉化成染料木素的轉化率為90.4%。
實施例3:
a.雞內金粉和0.2M， pH6.0的醋酸緩衝按1:10的質量比混合後，4"C浸提 取36h，離心棄渣，往上清液中加入6倍體積95%的乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上
清液，收集蛋白，溶於醋酸緩衝液(0.2M， pH7.0)中，即為酶液。
b. 將70g/L染料木苷100mL醋酸緩衝液(0.2M，pH7.0)和a.所述酶液200mL
混合，在溫度4(TC條件下反應18小時。
c. 反應混合液中加入3倍反應體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層。 反應產物中染料木苷轉化成染料木素的轉化率為93.6%。
實施例4:
a. 雞內金粉和0.2M， pH5.0的醋酸緩衝按1:8的質量比混合後，3(TC浸提 取20h，離心棄渣，往上清液中加入4倍體積95%的乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上 清液，收集蛋白，溶於醋酸緩衝液(0.2M， pH5.0)中，即為酶液。
b. 將100g/L染料木苷、100mL醋酸緩衝液(0.2M， pH5.0)和a.所述酶液 50mL混合，在溫度40。C條件下反應20小時。
c. 反應混合液中加入3倍反應體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層。 反應產物中染料木苷轉化成染料木素的轉化率為79.1%。
實施例5:
a. 雞內金粉和0.2M， pH3.0的醋酸緩衝按1:5的質量比混合後，25"C浸提 取30h，離心棄渣，往上清液(含酶混合物)中加入5倍體積95%的乙醇沉澱酶 蛋白，離心棄上清液，收集蛋白，溶於醋酸緩衝液(0.2M， pH3.0)中，即為酶液。
b. 將40g/L染料木苷100mL醋酸緩衝液(0.2M， pH3.0)和a.所述酶液20mL 混合，在溫度5(TC條件下反應12小時。
c. 反應混合液中加入3倍反應體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層。 反應產物中染料木苷轉化成染料木素的轉化率為65.8%。
實施例6:
a. 雞內金粉用0.2M， pH4.0的醋酸緩衝按l:4的質量比混合後，4。C浸提取 18h，離心棄渣，往上清液(含酶混合物)中加入飽和硫酸銨沉澱酶蛋白，離心 棄上清液，收集蛋白，溶於醋酸緩衝液(0.2M， pH4.0)中，用玻璃紙袋透析， 即為酶液。
b. 用實施例1的方法處理黃豆苷，提純和檢驗酶反應產物的結果黃豆苷 轉化成黃豆黃素，轉化率86.7%。 實施例7:
a. 雞內金粉用0.2M， pH4.0的醋酸緩衝按1:8的質量比混合後，l(TC浸提 取10h，離心棄渣，往上清液中加入4倍體積95%的乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上 清液，收集蛋白，將蛋白復溶於pH4.0的醋酸緩衝中，即為酶液。
b. 將60g/L大豆異黃酮苷加入a.中所得酶液，在溫度45"C條件下反應15 小時。
c. 反應混合液中加入2.5倍反應體積的乙酸乙酯，混合器充分震蕩萃取， 靜置分層。反應產物中大豆異黃酮苷轉化成大豆異黃酮苷元的轉化率為85.6%。
權利要求
1.一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於包括以下工藝步驟(1)雞內金酶的製取(a)雞內金粉碎成小於20目的粒度；(b)用磷酸或醋酸緩衝液在4～30℃浸提雞內金粉3～36h；雞內金粉與磷酸或醋酸緩衝液的質量比為1∶6～10；離心棄渣，得上清液；(c)在上清液中添加硫酸銨至飽和或過飽和以沉澱雞內金酶蛋白；離心棄去清液，得到雞內金酶蛋白；(d)用磷酸或醋酸緩衝溶液溶解雞內金酶蛋白，雞內金酶蛋白與磷酸或醋酸緩衝溶液的質量比為1∶3～5；透析除去硫酸銨，離心棄渣，即得雞內金酶液；(2)大豆異黃酮苷元的製備(e)大豆異黃酮苷用磷酸或醋酸緩衝液配製成1～100g/L的工作液；(f)將雞內金酶液和(e)的工作液按1∶0.5～5的體積比混勻後，於10～50℃進行為3～30h酶解反應；(g)酶解反應終止後，加入乙酸乙酯，酶解反應液與乙酸乙酯的體積比為1∶1～3，充分震蕩萃取，靜置分層，上層即為大豆異黃酮苷元乙酸乙酯溶液，下層再用乙酸乙酯萃取1～2次，合併上層製得的大豆異黃酮苷元溶液；(h)將(g)中大豆異黃酮苷元溶液通過濃縮蒸發除去乙酸乙酯後，可得到轉化率60～97％相應大豆異黃酮異構體的苷元；所述磷酸或醋酸緩衝液濃度為0.2M/L，pH為3.0～7.0。
2. 根據權利要求1 一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於其中 在(1)雞內金酶的製取的(c)步驟中，用95%的乙醇沉澱雞內金酶蛋白；乙醇用 量為(b)的上清液3 6倍；(d)步驟為用磷酸或醋酸緩衝溶液溶解雞內金酶蛋白， 雞內金酶蛋白與磷酸或醋酸緩衝溶液的質量比為l:3 5;即得雞內金酶液。
3. 根據權利要求1 一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於其中 在(d)的步驟中，透析用玻璃紙袋進行。
4. 根據權利要求1 一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於其中 在(g)的步驟中，萃取後的下層用乙酸乙酯再萃取1 2次，合併上層進行(f) 濃縮。
5. 根據權利要求1或2—種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於(1) 雞內金酶的製取將雞內金粉用0.2M/L、 pH5.0 7.0的磷酸或醋酸緩 衝溶液按1:6 8的質量比，4。C浸提取5 25h，離心棄渣；上清液中加入3倍體 積95%的乙醇沉澱酶蛋白，離心棄上清液，收集酶蛋白；將其溶於3倍浸提液 體積的0.2M/L、 pH5.0 7.0磷酸或醋酸緩衝液中，即為雞內金酶液；(2) 大豆異黃酮苷元的製備① 酶解將大豆異黃酮苷用0.2M/L， pH5.0 7.0磷酸或醋酸緩衝液配製成 10 50g/L工作液，與雞內金酶液混合，雞內金酶液和磷酸或醋酸緩衝液體積比 為l: 1 3，在溫度25 40。C下反應12 24h;② 提取反應混合液中加入2 3倍體積的乙酸乙酯，充分震蕩萃取，靜置分層，上層是乙酸乙酯層，下層再用乙酸乙酯提取1 2次，合併上層即為大 豆異黃酮苷元乙酸乙酯溶液；③ 濃縮通過蒸發揮幹乙酸乙酯層後，可得到轉化率為60 97%相應大豆 異黃酮異構體的苷元。
6. 如權利要求1 一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，其特徵在於所述 的大豆異黃酮苷為大豆苷、染料木苷及黃豆苷單體形式或大豆苷、染料木苷及 黃豆苷的混合物形式；所述染料木素、大豆素和黃豆黃素為染料木苷、大豆苷 和黃豆苷被水解掉糖基後所對應的相應形式的苷元，統稱為大豆異黃酮苷元。
全文摘要
一種大豆異黃酮苷製備其苷元的方法，步驟為將雞內金粉和0.2M/L，pH3.0～7.0的磷酸或醋酸緩衝液按1∶3～10的質量比混合，4～40℃浸提3～36h，離心棄渣，上清液添加硫酸銨或乙醇沉澱出的雞內金酶蛋白溶於0.2M/L，pH3.0～7.0的磷酸或醋酸緩衝溶液中，得雞內金酶液；將酶、大豆異黃酮苷及緩衝溶液混合在溫度10～50℃、pH3.0～7.0的條件下反應3～30小時；提取大豆異黃酮苷元。本發明克服了酸鹼水解法對苷元破壞性大，汙染大，目的性差的缺點；微生物酶水解法酶活力普遍不高的缺點。發明工藝簡便易行，酶解徹底而轉化率高，具有較高的食用安全性。適合於工業化生產。
文檔編號C12N9/24GK101348811SQ200810013109
公開日2009年1月21日 申請日期2008年9月4日 優先權日2008年9月4日
發明者波 劉, 劉英新, 康少華, 蘆明春, 金鳳燮 申請人:大連工業大學