以醯胺鍵連接的聚乙二醇－幹擾素及其製法和用途的製作方法

2023-10-07 18:39:49

專利名稱：以醯胺鍵連接的聚乙二醇－幹擾素及其製法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及用聚乙二醇(簡稱PEG)對幹擾素進行化學修飾的PEG-幹擾素複合物及其製法。
背景技術：
各種天然和重組蛋白質具有治療作用，一旦將他們純化、分離並製備成藥物，就可以將它們經非腸道途徑進行給藥，而用於不同的醫療適應症。然而，非腸道途徑給藥的蛋白質具有免疫原性，且血漿半衰期較短，因此，難以使藥用蛋白質在患者體內保持有治療作用的血藥濃度。
通過將蛋白質與高分子聚合物結合成複合物，可以有效的克服這些難題。現已公認，聚乙二醇是對人體安全的高分子聚合物。Davis等在美國專利4,179,337中公開了將聚乙二醇(PEG)與蛋白質諸如酶和胰島素結合以獲得具有生理活性的複合物的技術方案。Veronese等(《實用生物化學和生物技術(AppliedBiochem and Biotech)》11141-152，1985)公開了用氯甲酸苯酯使聚乙二醇活化以修飾核糖核酸酶和超氧化物歧化酶的技術方案。Katre等在美國專利4,766,106和4,917,888中還公開了通過聚合物結合重組蛋白質使蛋白質增溶的技術方案。同樣，可以將PEG和其他聚合物與重組蛋白質結合以便降低免疫原性並延長半衰期(參見Nitecki等，美國專利4,902,502，；Enzon，國際專利申請PCT/US 990/02133；Nishimur等，歐洲專利申請154,316和Tomasi，國際專利申請PCT/US85/02572)。眾所周知，α幹擾素可有效的治療急性和慢性B型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α幹擾素的血漿半衰期可以提高對這些疾病的治療作用。
以往公開的PEG-幹擾素複合物存在幾個問題，其一是PEG的結合使幹擾素的生物活性降低，在使用中必須提高干擾素的劑量。另外，在形成PEG-幹擾素複合物時所用的某些連接鍵可能在體內水解斷裂，使複合物失去了由PEG帶來的優點。據文獻報導，PEG修飾的幹擾素在小鼠體內的清除半衰期為2-3小時。

發明內容
本發明的PEG-幹擾素是以醯胺鍵與PEG分子連接的幹擾素。幹擾素α家族包括天然的幹擾素α1b、幹擾素α2a和幹擾素α2b以及集成幹擾素。集成幹擾素是通過測定天然幹擾素分子的共有序列而確定的重組幹擾素分子，又稱複合幹擾素(consensus IFN或IFN-con)。集成幹擾素的突變體包括第6位胺基酸突變為穀氨酸；第11為胺基酸突變為天冬氨酸；第162位胺基酸突變為絲氨酸；第165位胺基酸突變為絲氨酸以及上述4個突變位點的組合突變情況。
由於PEG是以帶有鏈長分布的混合物的形式製備的，因此，通常不能得到有精確和單一分子量的聚合物，對其分子量的描述一般是指其平均分子量。這種聚合物的製備方法在本研究領域內是眾所周知的。
本發明的技術方案如下一種以醯胺鍵連接的聚乙二醇-幹擾素，它是分子量為5000-30000的聚乙二醇以醯胺鍵修飾的幹擾素，具有如下結構式 式中，mPEG為聚乙二醇鏈，interferon為幹擾素。
上述的聚乙二醇—幹擾素中，幹擾素可以是幹擾素α1b、幹擾素α2a、幹擾素α2b或集成幹擾素。
上述的聚乙二醇—幹擾素的製法由下列步驟組成步驟1.將幹擾素以5mM pH3.0～5.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為1～10mg/ml的溶液，步驟2.按幹擾素PEG為1∶0.5～10的物質的量之比加入mPEG-SBA，以氫氧化鈉溶液調節pH到7.0～9.0，在0～25℃條件下反應0.5～4小時，mPEG-SBA有如下結構
式中mPEG為聚乙二醇鏈，步驟3.加入1M甘氨酸終止反應，步驟4.待3～5分鐘後，加入10倍體積的50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液，將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積的pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-幹擾素和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫，用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，步驟5.以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-幹擾素進一步純化，洗脫液為pH＝7.0的磷酸緩衝液(含0.15M NaCl)；用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液。
本發明的聚乙二醇-幹擾素的抗病毒活性高，達到7.2×107～7.6×108IU/mg，在體內的保留時間長，達到2.0～8.6小時，可以應用於製備抗病毒的藥物。
由於反應混合物中不同的產物具有不同的分子量及等電點，這些產物可用傳統的分離方法如色譜法進行分離。同一個自由氨基結合形成的單PEG化的複合物是本發明的優選方案。儘管幹擾素有多個自由氨基，但可以通過控制試劑比例和反應條件主要得到單PEG化的產物。
當將單一幹擾素分子與單一PEG結合時，所得的產物可以是位點異構物的混合物。「位點異構物的混合物」是指可以在不同幹擾素分子的不同胺基酸位點連接的各個PEG-幹擾素的混合物。例如在本發明的一個實施方案中，PEG-幹擾素混合物含有至少一種在幹擾素分子的組氨酸殘基上連接有PEG鏈的PEG-幹擾素，同時含有PEG鏈被連接在幹擾素分子的另一個位點(如賴氨酸殘基)的PEG-幹擾素。
本發明的聚乙二醇-幹擾素抗病毒活性高，由於聚乙二醇以醯胺鍵與幹擾素連接，血漿半衰期長，作為抗病毒藥物效果更好。本發明的製備方法簡單易行。


圖1為實施例5的SDS-PAGE電泳檢測的圖譜，其中A條帶PEG(30000)-IFNα2a；B條帶PEG(20000)-IFNcon；C條帶PEG(10000)-IFNα1b；D條帶PEG(5000)-IFNα2b；E條帶IFNα2b； F條帶標準分子量蛋白。
圖2為修飾後幹擾素藥代動力學研究(125I標記法)的步驟示意圖。
具體實施例方式
實施例1.聚乙二醇-幹擾素α2b的製備將幹擾素α2b以5mM pH3.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為1mg/ml的溶液10ml。按幹擾素PEG為1∶0.5的物質的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝5000，由美國Shearwater公司提供，下同)，以氫氧化鈉溶液調節pH到7.0，在0℃條件下反應4小時，加入1M甘氨酸0.5ml終止反應。3～5分鐘後，加入10倍體積的50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液。將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-幹擾素α2b和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫。用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素α2b的洗脫液，得PEG-IFNα2b混合物。
以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-幹擾素α2b進一步純化，以pH7.0的磷酸緩衝液(含0.15M NaCl)洗脫，以波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素α2b的洗脫液，以SDS-PAGE檢測(見圖1)。以波長280nm紫外光吸收法測定蛋白質含量，產物PEG-IFNα2b為0.11mg。
實施例2.聚乙二醇-幹擾素α1b的製備將幹擾素α1b以5mM pH4.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為4mg/ml的溶液10ml。按幹擾素PEG為1∶3的物質的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝10000)，以氫氧化鈉溶液調節pH到8.0，在10℃條件下反應2小時，加入1M甘氨酸0.5ml終止反應。3～5分鐘後，加入10倍體積50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液。將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-幹擾素和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫。用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-集成幹擾素進一步純化，以pH7.0的磷酸緩衝液(含0.15MNaCl)洗脫，以波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，以SDS-PAGE檢測(見圖1)。以280nm紫外吸收法測定蛋白質含量，產物PEG-IFNα1b為0.25mg。
實施例3.聚乙二醇-集成幹擾素的製備將集成幹擾素以5mM pH5.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為7mg/ml的溶液10ml。按幹擾素PEG為1∶6的物質的量之比加入mPEG-SBA(Mw＝20000)，以氫氧化鈉溶液調節pH到8.5，在15℃條件下反應1小時，加入1M甘氨酸0.5ml終止反應。3～5分鐘後，加入10倍體積50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液。將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-集成幹擾素和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫。用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-集成幹擾素的洗脫液，以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-集成幹擾素進一步純化，以pH7.0的磷酸緩衝液(含0.15M NaCl)洗脫，以波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-集成幹擾素的洗脫液，以SDS-PAGE檢測(見圖1)。以波長280nm紫外光吸收法測定蛋白質含量，產物PEG-IFNcon為0.48mg。
實施例4.聚乙二醇-幹擾素α2a的製備將幹擾素α2a以5mM pH5.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為6mg/ml的溶液10ml。按幹擾素∶PEG為1∶10的物質的量之比加入mPEG-SB(Mw＝30000)，以氫氧化鈉溶液調節pH到9.0，在25℃條件下反應0.5小時，加入1M甘氨酸0.5ml終止反應。3～5分鐘後，加入10倍體積50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液。將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-幹擾素和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫。用波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-幹擾素進一步純化，以pH7.0的磷酸緩衝液(含0.15M NaCl)洗脫，以波長280nm紫外光吸收檢測，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，以SDS-PAGE檢測(見圖1)。以波長280nm紫外光吸收法測定蛋白質含量，產物PEG-IFNα2a為1.2mg。
實施例5 SDS-PAGE電泳法對產物的檢測將各洗脫峰適當濃縮，採用SDS-PAGE電泳檢測，分離膠12％，濃縮膠5％。電泳完畢後，將膠體浸入固定液中(30％的乙醇、5％的乙酸)室溫振搖浸泡4分鐘；取出膠體，浸入染色劑中室溫振搖浸泡40分鐘(染色劑0.05％考馬斯亮藍G-250、0.2M碘、30％乙醇、5％乙酸)；再將膠體轉移入脫色劑(1％戊二醛、30％乙醇、5％乙酸)中室溫振搖浸泡至標本條帶清晰即可(見圖1)。
實施例6修飾後各組分的抗病毒活性測定用Wish細胞(人羊膜傳代細胞)-VSV病毒(濾泡性口腔炎病毒)系統測定各幹擾素的抗病毒活性。採用CPE(細胞致病效應)抑制為基礎的抑制微量測定法，以每ml幹擾素檢品的最高稀釋度仍能保護半數細胞(50％)免受病毒攻擊的稀釋度的倒數為幹擾素單位。以國際單位(IU)表示，並用國家IFNα標準品進行校正。
結果見表1。
表1.幹擾素及PEG幹擾素複合物的抗病毒活性樣品抗病毒活性(IU/mg)IFNα2b 4.3×108PEG-IFNα2b 2.2×108PEG-IFNα2b混合物 1.8×108IFNα1b 3.5×108PEG-IFNα1b 1.2×108IFNcon 1.8×109PEG-IFNcon 7.6×108IFNα2a 4.4×108PEG-IFNα2a 7.2×107實施例6.修飾後幹擾素藥代動力學研究(125I標記法)修飾後幹擾素藥代動力學研究(125I標記法)的步驟見圖2，其結果見表2。
表2.125I-IFN和125I-PEG-IFN給小鼠靜脈注射後的血漿半衰期樣品 半衰期(h)IFNα2b 0.8～1.5PEG-IFNα2b 2.0～3.9IFNα1b 0.7～1.2PEG-IFNα1b 3.2～5.7IFNcon0.5～1.9PEG-IFNcon4.6～7.5IFNα2a 0.6～1.4PEG-IFNα2a 6.5～8.權利要求
1.一種以醯胺鍵連接的聚乙二醇-幹擾素，其特徵是它是分子量為5000-30000的聚乙二醇以醯胺鍵修飾的幹擾素，具有如下結構式 式中，mPEG為聚乙二醇鏈，interferon為幹擾素。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇-幹擾素，其特徵是幹擾素是幹擾素α1b、幹擾素α2a、幹擾素α2b或集成幹擾素。
3.一種權利要求1所述的聚乙二醇-幹擾素的製法，其特徵是它由下列步驟組成步驟1.將幹擾素以5mM pH3.0～5.0的醋酸鈉緩衝液溶解，配製成濃度為1～10mg/ml的溶液，步驟2.按幹擾素∶PEG為1∶0.5～10的物質的量之比加入mPEG-SBA，以氫氧化鈉溶液調節pH到7.0～9.0，在0～25℃條件下反應0.5～4小時，mPEG-SBA有如下結構 式中mPEG為聚乙二醇鏈，步驟3.加入1M甘氨酸終止反應，步驟4.待3～5分鐘後，加入10倍體積的50mM pH4.5的醋酸鈉緩衝液，將反應混合物上羧甲基纖維素柱(Waterman CM-52，)，以5倍體積的pH4.5的醋酸鈉緩衝液洗滌柱子後，PEG-幹擾素和未結合PEG的幹擾素分別用含0.2M氯化鈉和0.4M氯化鈉的醋酸鈉緩衝液洗脫，收集含PEG-幹擾素的洗脫液，步驟5.以Sephacryl S-200分子排阻色譜對PEG-幹擾素進一步純化，洗脫液為pH＝7.0的磷酸緩衝液(含0.15M NaCl)，收集含PEG-幹擾素的洗脫液。
4.權利要求1所述的以醯胺鍵連接的聚乙二醇-幹擾素在製備抗病毒藥物中的應用。
全文摘要
一種以醯胺鍵連接的聚乙二醇－幹擾素，其特徵是它是分子量為5000－30000的聚乙二醇以醯胺鍵修飾的幹擾素，具有如上結構式，式中，mPEG為聚乙二醇鏈，interferon為幹擾素。本發明的聚乙二醇－幹擾素的抗病毒活性高，達到7.2×10
文檔編號C07K14/435GK1544468SQ20031010640
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月24日 優先權日2003年11月24日
發明者姚文兵, 張陸勇, 高向東, 楊曉兵 申請人:中國藥科大學