一種大葉藻幼苗原生質體的製備方法
2023-09-22 19:33:40 4
專利名稱：一種大葉藻幼苗原生質體的製備方法
技術領域：
本發明涉及原生質體的製備方法，尤其涉及無菌大葉藻原生質體的製備方法。
背景技術：
原生質體是植物細胞除去細胞壁後裸露的球形細胞，它具有全能性，可在人工控制條件下進行大量快速繁殖，也可誘導其融合，形成雜種細胞，為體細胞雜交提供實驗材料。從海藻體分離出原生質體有機械法、微生物法、酶法等方法。一般酶法是較為理想而常用的方法。機械法獲得的原生質體受到的損傷較大，不利於後續實驗的進行。微生物法容易引起雜菌汙染，對於後續愈傷組織形成及成苗帶來汙染。大葉藻(Zostera marina L.)俗稱海帶草，屬於被子植物門(Angiospermae)，單子葉植物綱(Monocotyledoneae，或稱百合綱Liliopsida)，澤瀉目(Alismales)，眼子菜科(Potamogetonaceae)，大葉藻屬(Zostera L.)，大葉藻為多年生草本植物，根狀莖匍匐，節上生鬚根。莖疏生分枝，扁平，淡綠色。葉互生，綠色，長條形，長達50釐米以上，寬約3～5毫米，頂端圓形，全緣，有5～7脈，託葉膜質。肉穗花序初時包於佛焰苞內，長4～6釐米，花序軸扁平，邊緣無苞片狀附屬物；花小，單性，雌、雄花沿花序軸一側交互排成2列，無花被；子房卵狀長橢圓形；柱頭2，剛毛狀。種子矩圓形，長約4毫米，有縱紋。大葉藻分布於我國的山東、河北、遼寧等沿海省份；以及分布於朝鮮、日本、歐洲、北美等國家和地區。無菌的大葉藻幼苗原生質體能為原生質體融合，遺傳轉化，植株再生，新品種培育打下基礎。目前雖然有通過常規消毒方法及酶解條件獲得無菌海藻原生質體的報導，如論文「帶愈傷組織的高效率誘導」(刊登在《海洋與湖沼》1999年第06期第652～657頁)介紹了無菌海藻原生質體多種常規消毒方法，其中一種常規消毒方法是將切好的組織塊在1.5％濃度的碘化鉀溶液中浸泡10分鐘，用75％濃度的酒精棉球檫3次，再用高壓蒸汽滅菌海水衝洗4遍，放入MS固體增富培養基中培養。論文「大型海藻的組織培養及其應用」(刊登在《植物生理學通訊》2007年第03期第605～611頁)、論文「角叉菜(Chondrus ocellatusHolm)原生質體分離、培養與再生的研究」(刊登在《中國海洋大學學報(自然科學版)》1991年第01期第52～61頁)、論文「條斑紫菜單細胞固體培養的初步研究」(刊登在《海洋通報》2004年第05期第52～61頁)介紹了無菌海藻原生質體常規酶解條件採用纖維素酶和海螺酶相結合，酶解時間2～3小時。這裡的酶解時間不宜過長，否則原生質體會大量破碎，或者失去活性，所以研究者一般在酶解12小時後就會放棄後續的實驗。但運用上述常規消毒方法及酶解條件在處理大葉藻時均不能得到大葉藻的原生質體。分析認為，大葉藻這種植物不屬於海藻，屬於一種生活在海水中的被子植物，正是由於大葉藻這個生理特點，目前還未見有關於大葉藻原生質體製備方法的相關報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法。
本發明解決上述技術問題的技術方案是 一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其步驟是 (1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養2天； (2)選取剛萌發的大葉藻幼苗； (3)將暫養後的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒； (4)將大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘； (5)將大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀溶液10分鐘； (6)將大葉藻幼苗用無菌海水衝洗3次，再用無菌海水浸泡10分鐘，然後用無菌海水恢復浸泡20分鐘； (7)將大葉藻幼苗從無菌海水撈出後用無菌棉布吸乾，然後將大葉藻幼苗放入離心管中並加入酶液，酶液配方為海水1000重量份，纖維素酶470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，剪碎的大葉藻幼苗在酶液中進行酶解； (8)酶解結束後，向酶液中加入等體積葡萄糖液體，靜置，取上清液，然後過濾； (9)配置高滲海水，在過濾後的上清液中加入等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物； (10)第3次離心獲得的沉澱物中加入培養液，搖勻後用離心機在2000r/min的轉速下離心，即可收集到大葉藻幼苗原生質體。
上述步驟(7)的酶解優選條件為酶液PH值為4，溫度保持15℃，0.6克纖維素酶濃度，酶解時間48小時。
上述步驟(8)的葡萄糖液體濃度為2摩爾/立方釐米，所述過濾的網孔徑為300目。
本發明的有益技術效果由於大葉藻這種植物不屬於海藻，是一種在海水中完成開花、結種和萌發的被子植物，正因為大葉藻這個生理特點，故大葉藻在成分及生理特性上介於海藻與被子植物之間，更接近於被子植物。本發明大葉藻幼苗經過酒精、次氯酸鈉溶液、碘化鉀溶液消毒處理後獲得無菌幼苗；經過剪碎、酶解後處理得到大葉藻幼苗原生質體。由於大葉藻細胞壁的纖維含量高於其他藻類植物，因此本發明選擇了纖維素酶和果膠酶相結合的酶解方法，並提高纖維素酶在酶液中的含量。在不影響大葉藻幼苗原生質體活性的前提下，延長酶解時間，酶解48小時是個突破，這麼長的酶解時間，一般的海藻體會死亡，而大葉藻確不一樣，酶解48小時，大葉藻幼苗原生質體達到數量高峰並具有活性。本發明方法能夠克服汙染，獲得無菌大葉藻幼苗原生質體，為原生質體融合，遺傳轉化，植株再生，新品種培育等工作打下基礎。另外，本發明方法也能為建立大葉藻細胞工程繁殖技術，快速繁育優良大葉藻品系，改良大葉藻遺傳工程提供技術儲備。
1、圖1為本發明方法步驟流程圖。
2、圖2為本發明酶解處理48小時後獲得的大葉藻幼苗原生質體照片。
3、圖3為本發明酶解處理48小時後測定大葉藻幼苗原生質體直徑的照片。
4、圖4為本發明酶解處理48小時後中性紅和甲基藍染色光學顯微鏡下的大葉藻幼苗原生質體照片。
5、圖5為本發明酶解處理48小時後中性紅和甲基藍染色光學相差顯微鏡下的大葉藻幼苗原生質體照片。
6、圖6為纖維素酶濃度與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的折線統計圖。
7、圖7為酶解時間與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的折線統計圖。
8、圖8為PH值與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的折線統計圖。
9、圖9為溫度與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係折線統計圖。
具體實施例方式 下面結合附圖和實施例詳細說明 如圖1所示，一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其具體步驟是 (1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養，在溫度保持4攝氏度的雙抗海水中暫養2天。大葉藻幼苗既可是天然生長的，也可是人工養殖或培育的，大葉藻幼苗培育方法之一見本請求人發明專利申請「一種大葉藻種子快速萌發方法」，申請號為200910223107.1。
本實施例雙抗海水配方為青黴素濃度為每毫升100單位(100units/ml)，鏈黴素濃度為每毫升100單位(100units/ml)，即1升海水需0.48g(80萬單位)的青黴素0.06克，以及需100萬單位的鏈黴素0.1克，通過攪拌或搖勻等方法混合均勻即可。
(2)選取種子萌發一個月的大葉藻幼苗，本實施例取鮮重為0.025克大葉藻幼苗，這時大葉藻幼苗長出兩片子葉，取完整的大葉藻幼苗，並去掉大葉藻幼苗胚乳部分。選取的大葉藻幼苗不宜生長時間過長，生長時間過長，大葉藻幼苗細胞纖維化成分過長，需要酶解的時間越長，這樣對大葉藻原生質體的傷害會加大，不利於後期大葉藻原生質體成苗後續工作的進行。生長時間過短，大葉藻幼苗較小，未長出子葉，獲得的原生質體種類不全，並且缺少葉子部分的大葉藻幼苗重量太輕，得不到理想數量的大葉藻幼苗原生質體。
(3)在無菌室超淨工作檯中放入75％濃度的酒精，然後將暫養後的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒。
超淨工作檯在使用前要進行紫外線燈照射，並開通無菌風，照射時間為30分鐘，無菌操作室同時也要用紫外線燈照射30分鐘，關閉紫外線燈15分鐘後，人員進入無菌室進行具體操作。
(4)在無菌室超淨工作檯中放入1％濃度的次氯酸鈉(NaCIO)溶液，然後將浸泡酒精後的大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘。
(5)在無菌室超淨工作檯中放入1.5％濃度的碘化鉀(KI)溶液，然後將浸泡次氯酸鈉溶液後的大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀(KI)溶液10分鐘。
(6)將浸泡碘化鉀溶液後的大葉藻幼苗用無菌海水衝洗3次，即將大葉藻幼苗放入裝有無菌海水的培養皿中，用鑷子夾住幼苗，在水中涮洗，依次涮洗3次。再用無菌海水浸泡10分鐘，目的是去除殘留的碘化鉀、酒精、次氯酸鈉和生海水的殘留；然後用無菌海水恢復浸泡20分鐘，目的是讓大葉藻幼苗的細胞能從刺激的環境中恢復過來，使細胞處於一種良好的狀態，為下一步酶解作準備。無菌海水浸泡和恢復大葉藻幼苗要在不同的培養皿中進行。
無菌海水的製備方法是取生海水(該生海水系冷卻到室溫的煮沸過的海水)，在超淨工作檯中，經過121℃、1030帕斯卡(N/m2)高壓滅菌後的不鏽鋼濾器進行抽濾，該不鏽鋼濾器與無油膈膜真空泵配套使用進行抽濾，抽濾濾膜孔徑為0.22微米，通過抽濾獲得無菌海水。
(7)將大葉藻幼苗從無菌海水撈出後用無菌棉布吸乾，然後將大葉藻幼苗放入離心管(EP管)中並加入酶液1.25毫升，再用剪刀(本實施例採用長10釐米的醫用手術剪刀)，離心管傾斜45度角，離酒精燈5～10釐米，在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，一般剪碎時間在15～20分鐘之間，剪到大葉藻幼苗組織塊1立方毫米為宜。然後將裝有剪碎的大葉藻幼苗和酶液的離心管置於15℃溫度下酶解48小時。
無菌棉布剪成5×5釐米大小的正方形。在本實施例中，無菌棉布及需要無菌的器具都要用高壓滅菌鍋在121℃、1030帕斯卡(N/m2)高壓下滅菌25分鐘。
酶液配方為海水1000重量份，纖維素470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，本實施例以配置1.25毫升酶液為例，需1.25毫升海水(即1.275克海水，海水的密度按1.02克/釐米3計算)，纖維素酶0.6克，果膠酶0.0062克，山梨醇0.115克，用移液槍取1.25毫升海水加入到試管中，然後分別加入纖維素酶0.6克，果膠酶0.0062克，山梨醇0.115克。搖勻後，用離心機在500r/min轉速下離心10分鐘，去沉澱，將已去沉澱的上清液倒到新的離心管中，該上清液即為酶液。然後用濃度為1摩爾/升(即1N HCL)的鹽酸將酶液調成pH值為4，配製好的酶液通過針頭濾器，在操作淨工作檯抽濾，製成無菌酶液，針頭濾器濾膜孔徑為0.22微米。酶液保存溫度不要超過20℃，避免酶液失活。本實施例採用將製備好的酶液暫放到4℃冰箱冷藏保存，使用時從冰箱拿出，在無菌室內恢復到常溫使用，酶液最好是當天配當天用。
(8)酶解結束後，向酶液中加入與含有剪碎的大葉藻幼苗組織的酶液相同體積，濃度為2摩爾/立方釐米(2mol/dm3)的葡萄糖液體，使大葉藻幼苗原生質體漂浮在液體表面，加入葡萄糖液體後蓋好離心管的蓋子，然後緩慢搖勻，搖勻時間為1分鐘，搖勻後樹立靜置20分鐘，等單個的游離大葉藻幼苗原生質體細胞漂浮在液體上層，大的組織塊沉在底部。通過移液槍取1.5毫升上清液，這時上清液有些渾濁，用300目的尼龍材質過濾網過濾上清液以去除沉澱雜物，該沉澱雜物主要成分為未酶解的組織塊、細胞碎片。過濾後的上清液主要成分為大葉藻幼苗原生質體。
(9)配置高滲海水，在過濾後的上清液中加入與上清液等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速(即每分鐘2000轉)下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入同樣體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入同樣體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物。這時沉澱物的主要成分就是大葉藻幼苗原生質體。加高滲海水的目的是洗去多餘的酶液、葡萄糖等雜質，同時高滲海水對原生質體是一種保護，使原生質體處於一種脫水狀態，這樣可以減少離心對原生質體的機械損傷。最後一次獲得的沉澱物中加入1毫升的MS液體培養液懸浮原生質體，利用血球計數板進行血球計數，計數結果為19.5×105個/毫升，400×鏡下每個視野大葉藻原生質體數在40個左右，單個大葉藻幼苗原生質體直徑為12～15微米，如圖3所示。通過甲基藍和中性紅檢測活性，大葉藻幼苗原生質體存活率為80～90％，如圖4和圖5所示。
本實施例高滲海水配製比例為消毒海水100毫升，氯化鈉(Nacl)1.5克，氯化鈣(CaCl2)0.11克，氯化鈉、氯化鈣全部溶解在消毒海水後，通過不鏽鋼濾器在超淨工作檯進行抽濾，不鏽鋼濾器濾膜孔徑為0.22微米。這裡的消毒海水為煮沸過的海水，消毒海水煮沸時間為10分鐘。
MS液體培養液配製比例為100毫升海水需0.48g(80萬單位)青黴素0.006克，100萬單位的鏈黴素0.01克，MS培養基3.474克，濃度為2毫克/升的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.25毫升。用量筒量取100毫升海水，依次添加MS培養基、青黴素、鏈黴素、2，4-二氯苯氧乙酸，搖均或攪拌均勻即可得到MS液體培養液。
(10)將溶解大葉藻幼苗原生質體物的MS液體培養液用離心機在2000r/min的轉速下，離心5分鐘即可收集到大葉藻幼苗原生質體，此時的大葉藻幼苗原生質體為略微發白的沉澱物。
本實施例重量通過電子天平稱得。
圖2為本發明在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下處理48小時後400×鏡下視野的照片，圖2中的橢圓球為大葉藻幼苗原生質體，近似透明的不規則體是死掉的原生質體進水後膨脹留下的殘骸，即細胞碎片。每個視野下大葉藻幼苗原生質體個體數目為40個左右，本發明大葉藻幼苗原生質體個體數量是通過血球計數板計數，在纖維素酶濃度、酶解時間、PH值、溫度上分別作了梯度實驗，纖維素酶濃度、酶解時間、PH值、溫度與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的實驗結果折線統計圖分別見圖6、圖7、圖8、圖9。
圖3是本發明酶解處理48小時後測定大葉藻幼苗原生質體直徑的照片。本發明大葉藻幼苗原生質體直徑是通過倒置攝像顯微鏡上配置測量細胞大小的計算機利用軟體進行測量。圖3中的藍線是電腦測定原生質體直徑的線段，藍線上面有顯示原生質體直徑的數字，圖3右下角有紅色標尺，紅色標尺長度為100微米。通過計算機測量，單個大葉藻幼苗原生質體直徑為12～15微米。
圖4是大葉藻幼苗原生質體在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下，酶解48小時後通過中性紅和甲基藍混合染色後，普通顯微鏡視野下拍照的照片，圖4照片中粉紅色的物質為有活性的大葉藻幼苗原生質體，深藍色的物質為沒有活性的大葉藻幼苗原生質體，其它的東西為雜質。
圖5是大葉藻幼苗原生質體在PH4、15℃、0.6克纖維素酶濃度條件下，酶解48小時後通過中性紅和甲基藍混合染色後，在相差顯微鏡下拍照的照片。圖4照片中黑色物質為沒有活性的大葉藻幼苗原生質體，粉紅色物質為有活性的大葉藻幼苗原生質體，白色外殼的長條物和小灰黑點物質為雜質和死掉的原生質體分解後的殘骸，即細胞碎片。
本發明通過中性紅和甲基藍染色後，隨機照取100張照片，按照公式存活率＝活細胞數/總細胞數算出大葉藻幼苗原生質體存活率平均值。通過中性紅和甲基藍混合染色後，有活性的原生質體淺染，在顯微鏡下為粉紅色；失活的原聲質體深染，在顯微鏡下為深藍色。通過活性檢測，大葉藻幼苗原生質體存活率為80～90％。
本發明所述PH4表示酶液的酸鹼值，即PH值為4；所述15℃表示酶液保持的溫度；0.6克纖維素酶濃度表示0.6克纖維素酶溶於1.25毫升海水中纖維素酶的濃度，1.0克纖維素酶濃度表示1.0克纖維素酶溶於1.25毫升海水中纖維素酶的濃度，其它纖維素酶濃度的含義依次類推。
圖6為纖維素酶濃度與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的實驗結果折線統計圖。通過圖6可以看到，在0.075克～1.0克纖維素酶濃度範圍內，隨著纖維素酶濃度的升高獲得大葉藻幼苗原生質體的數量逐漸提高。大葉藻幼苗原生質體數量與纖維素酶濃度呈正相關。在0.6克至1.0克纖維素酶濃度下，得到較高數量的大葉藻幼苗原生質體。由於海水量是固定的，隨著纖維素酶濃度的增加，酶液逐漸趨於粘稠狀，在1.0克纖維素酶濃度下大部分纖維素酶都沒有溶解，並且得到的大葉藻幼苗原生質體數量與0.6克纖維素酶濃度相差不多。所以本發明選0.6克的纖維素酶濃度為最佳酶解濃度。此外，隨著纖維素酶濃度的升高，酶液中所含對原生質體具有毒性的物質增多，導致原生質體破裂，也是影響大葉藻幼苗原生質體數量的一個因素。
圖7為酶解時間與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的實驗結果折線統計圖。通過圖7可知，在0～80小時的時間範圍內，大葉藻幼苗原生質體產量開始隨酶解時間的延長而增加，當達到48小時，產量達到最大值，為3.9×106個/毫升，隨後，大葉藻幼苗原生質體產量隨酶解時間的延長而開始下降，當酶解超過60小時後，原生質體數量趨於平穩。因此，酶解48小時是最佳酶解時間。
圖8為PH值與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的實驗結果折線統計圖。從圖8可知，隨pH值增加，大葉藻幼苗原生質體釋放量也逐步增加，在pH值為3～4時，適合大葉藻幼苗原生質體的產生。當pH值為4.0時，大葉藻幼苗原生質體產量最高，為1.3×106個/毫升，當pH值大於4，大葉藻幼苗原生質體釋放量大幅度降低。
圖9為溫度與大葉藻幼苗原生質體釋放量關係的實驗結果折線統計圖。從圖9可知，酶解溫度15～20℃時，適合大葉藻幼苗原生質體的產生。在15℃時，大葉藻幼苗原生質體產量最高，達4.4×106個/毫升，酶解溫度低於或者高於15℃時，大葉藻幼苗原生質體產量均下降。可見，15℃是酶解的最適溫度。低於或高於此溫度，大葉藻幼苗原生質體產量均受影響。本發明選用15℃，該溫度低於大葉藻的生活溫度，從而不影響後續大葉藻幼苗原生質體的再生。
本實施例所用儀器均可在市場上購買，其來源及規格型號見下表 本實施例所用試劑均可在市場上購買，所用原料來源及規格見下表
權利要求
1.一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其特徵在於，其步驟是
(1)將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養2天；
(2)選取剛萌發的大葉藻幼苗；
(3)將暫養後的大葉藻幼苗浸泡在75％濃度的酒精10秒；
(4)將大葉藻幼苗浸泡在1％濃度的次氯酸鈉溶液5分鐘；
(5)將大葉藻幼苗浸泡在1.5％濃度的碘化鉀溶液10分鐘；
(6)將大葉藻幼苗用無菌海水衝洗3次，再用無菌海水浸泡10分鐘，然後用無菌海水恢復浸泡20分鐘；
(7)將大葉藻幼苗從無菌海水撈出後用無菌棉布吸乾，然後將大葉藻幼苗放入離心管中並加入酶液，酶液配方為海水1000重量份，纖維素酶470重量份，果膠酶5重量份，山梨醇90重量份，再用剪刀在離心管中將大葉藻幼苗剪碎，剪碎的大葉藻幼苗在酶液中進行酶解；
(8)酶解結束後，向酶液中加入等體積葡萄糖液體，靜置，取上清液，然後過濾；
(9)配置高滲海水，在過濾後的上清液中加入等體積高滲海水，用高滲海水洗3次在上清液中加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；在沉澱物中再次加入等體積的高滲海水搖勻後，在離心機2000r/min轉速下旋轉5分鐘，離心後棄上清液，獲得沉澱物；
(10)第3次離心獲得的沉澱物中加入培養液，搖勻後用離心機在2000r/min的轉速下離心，即可收集到大葉藻幼苗原生質體。
2.根據權利要求1所述一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其特徵在於步驟(7)的酶解條件為酶液PH值為4，溫度保持15℃，0.6克纖維素酶濃度，酶解時間48小時。
3.根據權利要求1或2所述一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其特徵在於步驟(8)所述葡萄糖液體濃度為2摩爾/立方釐米，所述過濾的網孔徑為300目。
全文摘要
本發明公開了一種無菌大葉藻幼苗原生質體的製備方法，其具體步驟是將大葉藻幼苗放入雙抗海水中暫養2天；選取剛萌發的大葉藻幼苗；依次通過75％濃度的酒精、1％濃度的次氯酸鈉溶液、1.5％濃度的碘化鉀溶液消毒；用無菌海水衝洗、浸泡和恢復；大葉藻幼苗在離心管中加入酶液並剪碎，然後進行酶解；酶解結束後加入葡萄糖液體並過濾；用高滲海水洗3次並離心獲得沉澱物；沉澱物中加入培養液離心獲得原生質體。本發明能夠克服汙染，獲得無菌大葉藻幼苗原生質體，為原生質體融合，遺傳轉化，植株再生，新品種培育等工作打下基礎，另外，本發明也能為建立大葉藻細胞工程繁殖技術，快速繁育優良大葉藻品系，改良大葉藻遺傳工程提供技術儲備。
文檔編號C12N5/04GK101768568SQ20101013259
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月28日 優先權日2010年2月28日
發明者錢冠蘭, 李曉捷, 羅世菊, 張壯志, 劉延嶺, 王宏梅, 李志凌, 趙楠, 賽珊, 宋少峰 申請人:山東東方海洋科技股份有限公司