基於cho細胞表達系統的重組人神經生長因子純化方法
2023-09-22 12:12:05 2
專利名稱：基於cho細胞表達系統的重組人神經生長因子純化方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥提取技術領域，特別是一種從CHO細胞表達上清提取重組人神經生長因子的方法。
背景技術：
人神經生長因子(human Nerve Growth Factor, hNGF)是最早發現的神經系統中重要的營養因子，對中樞和周圍神經細胞的生長、發育、分化及再生有重要作用，可影響外周和中樞神經系統某些神經元的存活和分化，對保護神經系統的正常功能有重要作用；並且hNGF對治療腦損傷、老年性痴呆、腦帕金森氏綜合症等與神經損傷和神經退行有關的疾病有重要臨床價值(呂憲峰，劉志強，王東，等，一種適於規模化生產的眼鏡蛇蛇毒神經生長因子的純化方法，申請公布號CN101845093A)。然而hNGF在人體內含量極低，天然來源幾乎不可能。因此，人們將目光轉向動物替代品，而由於蛇毒提取神經生長因子可能存在有毒物質殘留的風險，迄今臨床使用的NGF仍為小鼠頜下腺提取的鼠源NGF。·雖然鼠源NGF與人源NGF在胺基酸序列上具有90%的同源性，但是鼠源性蛋白製品不論在化學結構上還是空間結構上都有別於人源性蛋白製品，動物源性的蛋白存在較高的免疫原性，容易引起人體內的抗原反應，長期使用存在一定風險(李佳楠，湯華東，基於昆蟲杆狀病毒表達系統的重組人神經生長因子的製備方法，申請公布號CN101906423A)。所以，使用基因工程技術表達人源的NGF代替小鼠頜下腺提取的NGF必將是未來NGF藥物發展的趨勢。然而諸多的已經報導的NGF表達系統如大腸桿菌、酵母以及昆蟲細胞均存在蛋白活性低、系統無法進行連續性表達、對純化工藝要求嚴格等缺點。相反，CHO細胞表達系統具有諸多優點，比如1)準確的轉錄後修飾功能，使得蛋白在分子結構、理化特性以及生物學功能上接近天然分子；2)表達產物分泌至胞外，便於純化；3)通過篩選可獲得高效表達細胞株；4)可進行懸浮高密度培養，產量高(王妍，王革，何凌冰，等，重組人神經生長因子的酵母表達系統以及製備重組人神經生長因子的方法，申請公布號CN1793375A)。因此，使用CHO細胞表達重組人神經生長因子必將成為NGF的行業趨勢。然而，傳統的純化工藝大多步驟繁瑣，層析填料相對落後，存在著收率低、耗時長、蛋白汙染機率大等缺點。由於CHO細胞表達系統費用相對昂貴，如果使用傳統的純化工藝勢必對蛋白的得率、活性以及時間損耗上存在巨大劣勢，進而提高產品成本，這也是一直影響CHO細胞表達重組人神經生長因子的工業化生產的主要原因。因此，一種適用於CHO細胞表達系統的新的、周期短、成本低、高回收率的純化工藝的開發勢在必行。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足，提供一種生產周期短、生產效率高、減少樣品上柱前超濾處理以及使用一種耐高鹽、高流速、高載量的觸角型離子交換凝膠F「actogerEMD S03_ (M)和高解析度的分子篩凝膠Superdex 75prepgrade從CHO細胞表達上清提取重組人神經生長因子的純化方法。
基於CHO細胞表達系統的重組人神經生長因子純化方法，操作方法如下I)將收穫的高表達重組人神經生長因子的CHO細胞上清先後離心去除活細胞、細胞碎片，過濾去除雜質和細菌；2)將過膜後的細胞上清上樣於pH6. 0—8.0, 20mmol/LPB緩衝液平衡好的Fractogels EMDSOf (M)層析柱，上樣完畢後，用含 0. 2—0. 5mmol/L NaCl, pH6. 0—8. 0 的20mmol/L PB緩衝液衝洗未結合蛋白以及雜質蛋白，之後用含0. 5 — 0. 85mol/L NaCl,PH6. 0—8. 0的20mmol/LPB緩衝液洗脫，收集目的蛋白峰；3)將收集的目的蛋白峰，使用截留分子量為3K的超濾設備濃縮蛋白，4)濃縮後的蛋白上樣於含0. 15mol/L NaCl,pH7. 0的20mmol/L PB緩衝液平衡好的Superdex 75層析柱，收集目的蛋白峰，即為重組人神經生長因子原液。所述步驟(I)中離心去除活細胞、細胞碎片的方法為先2000rpm離心去除細胞， 然後8000rpm離心去除細胞碎片。所述步驟(I)過濾去除雜質和細菌的方法為離心後上清過0. 22iim濾膜，除去雜質和細菌。所述步驟(2)中過膜後的細胞上清用磷酸氫二鈉將pH調至7. O。所述步驟(2)中上樣時流速2ml/min。
所述超濾設備包括切向流超濾系統、中空纖維柱和超濾離心管。所述步驟(4)中上樣時流速lml/min。本發明選用的Fractogef EMD是合成的聚合物樹脂，它的官能團通過共價鍵合結合到聚合物骨架的羥基上，形成一種「觸手」樣結構，相比起其他離子交換填料它具有如下特
佔-
^ \\\ I)純化收率高載量大，高流速，在高鹽濃度條件下，有比傳統介質更好的生物分子結合能力；2)產品安全與糖基質的介質相比,Fractogef EMD不會受微生物分解,使受內毒素
汙染的風險大大降低；3)非常經濟；4)化學穩定性好，介質壽命長。對比實驗表明，Fractogel_ EMD SO3^ (M)填料在相同條件下具有比其他對比填料更高的NGF載量；Fractoger EMD S03_ (M)的選擇，使得樣品前處理只需要離心與過濾，省去了其他方法中超濾處理的步驟；且載量進一步提升。採用超濾濃縮樣品，提高樣品的濃度可以收取更多的最終產品，提高了得率，減小體積後用更少的層析介質即可完成分離，節約了成本。本發明選用了市面上解析度最好的Superdex系列填料，使得產品最大程度上與雜質蛋白分開，從而大幅度提高純度；另一方面，凝膠過濾層析方法的選擇，使得層析過程的同時完成緩衝液的置換，更加方便之後產品的凍幹處理。本發明方法與其他方法相比減少了操作步驟，大大縮短了生產周期，提高了處理量和得率，適合規模化生產。步驟I)中細胞上清的獲得分兩步進行，第一步2000rpm離心去除活細胞，再用SOOOrpm離心去除掉細胞增殖過程中產生的細胞碎片，這樣分布處理避免了低速離心無法去除細胞碎片，而高速離心對活細胞造成傷害以致細胞內蛋白釋放至上清中，為純化減少了幹擾。步驟3)中超濾系統的選擇，是因為超濾過程在常溫下進行，能耗低，不需加熱，無熱效應及相態變化，不需加入其它物質即可達到分離、濃縮、純化即分級等目的，故特別適用於I)熱敏性物質(生物製品、菌體、蛋白質)的濃縮分離；2)極稀溶液的濃縮回收；3)恆體積恆濃度下的脫鹽純化。 本發明提供了一種專門適用於CHO表達系統的神經生長因子純化方法，與之前已公開的CHO細胞神經生長因子的純化方法(L.E.伯頓，C.H.施梅爾策，J.T.貝克，神經營養蛋白的純化，申請公布號CN1237184A)相比，本方法操作步驟更少，同時能縮短生產周期、提高產品回收率、減少蛋白汙染機率；而與已報導的(姜靜，於淑萍，薑桂香，等，兩步柱色譜法純化CHO表達的重組人P神經生長因子(rhNGF)，中國生物工程雜誌2008，28(10):84—89)方法比，本方法避免使用了反相層析技術，減少了添加劑以及有機物質的引入，從而減少了有機物質去除步驟，更加適合大規模生產。綜上所述，本發明提供了一種快速、高效的從CHO表達系統中純化高活性的重組人神經生長因子方法，具有明顯的技術創新性和工藝先進性，能工業化生產重組人神經生長因子。按照本發明的表達系統和方法可以製備得到大於98%，生物比活性高於5X IO5Au/mg的重組人神經生長因子。
圖I為填料篩選時靜態載量結果，其中M :Protein marker ；1 SP Sepharose Fast-flow ；2 CM Sepharose Fastflow ；3 =Fractogef EMD SE (M);4 Fractogel* EMD SO3- (M);5 :Nuvia S ；6 UNOsphere RapidS；7 MacroprepHigh S,圖2為Fractogef EMD S03_ (M)層析圖，I為UV280nm吸收曲線，2為洗脫梯度曲線，3為電導曲線，陰影部分為目的蛋白峰。其中，橫坐標為洗脫體積(單位ml);左側縱坐標為峰下面積(單位mAU);右側縱坐標為電導率(單位mS/cm)。圖3為Superdex 75prepgrade層析圖，I為UV280nm吸收曲線，2為電導曲線，陰影部分為目的蛋白峰。其中，橫坐標為洗脫體積(單位ml);左側縱坐標為峰下面積(單位mAU);右側縱坐標為電導率(單位mS/cm)。圖4為本發明獲得的重組人神經生長因子Tricine-SDS-PAGE電泳圖，其中M Protein marker ；1 CH0 細胞表達上清；2 :純化後的 rh P -NGF,圖5為本發明獲得的重組人神經生長因子的雞胚法活性檢測圖，其中A為鼠源神經生長因子誘導前雞胚背跟神經節，B為25ng/ml鼠源神經生長因子誘導生長3天的雞胚背跟神經節，C為重組人神經生長因子誘導前雞胚背跟神經節，D為25ng/ml重組人神經生長因子誘導生長3天的雞胚背跟神經節。具體實施方法
技術領域：
本發明更詳細的實施方法參見實施例，本實施例是用於解釋、說明而不是以任何方式限制本發明。本發明所用的試驗材料如無特別說明均為市售購買產品，各種試劑和培養基的成分和配製方法可參見常規實驗手冊中的操作。實施例一種基於CHO細胞表達系統的重組人神經生長因子的純化方法，包括以下步驟I、細胞上清處理取搖床培養7—8天收穫的高表達重組人神經生長因子的CHO細胞培養液，首先2000rpm離心IOmin,去除活細胞,然後將上清8000rpm離心20min,去除細胞碎片，離心後上清過0. 22 ii m濾膜，除去雜質和細菌，再用磷酸氫二鈉將pH調至7. 0，備用。
2>Fractogel EMD SO3 (M)層析將過膜後的細胞上清上樣於pH7. 0，20mmol/L PB緩衝液平衡好的Fractogef EMDSOf(M)層析柱，流速 2ml/min，上樣完畢後，使用含 0. 45mol/L NaCl, pH7. 0 的 20mmol/L PB緩衝液衝洗未結合蛋白以及雜質蛋白，之後用含0. 7mol/L NaCl，pH7. 0的20mmol/LPB緩衝液洗脫，收集目的蛋白峰，見圖2。3、超濾濃縮蛋白溶液將目的蛋白溶液倒入截留分子量為IOK的超濾離心管中，4000rpm離心至溶液體積縮小為4ml左右，備用。4> Superdex 75prepgrade 層析濃縮後的蛋白上樣於含0. 15mol/L NaCl，pH7. 0的20mmol/LPB緩衝液平衡好的Superdex75層析柱(I. 6 X 60cm),流速lml/min, 80min附近蛋白峰即為目的蛋白峰，收集目的蛋白峰，即為重組人神經生長因子原液，見圖3。5、Tricine-SDS-PAGE 電泳鑑定純化 rh ^ -NGF 蛋白純度取重組人神經生長因子原液，按體積比I : 4加入5X上樣緩衝液，沸水浴煮lOmin，上樣於10%濃度的Tricine-SDS-PAGE膠，每孔上樣20 ill。電泳完畢，使用考馬斯亮藍對膠進行染色30min，之後使用脫色液將膠背景脫至無色。利用Imaging G6凝膠成像系統掃描Tricine-SDS-PAGE膠，結果見圖4，再使用Gel-Pro軟體對重組人神經生長因子條帶進行純度分析，結果表明條帶純度為99%。6、雞胚背根神經節法鑑定rh P -NGF生物活性使用BCA法對純化好的重組人神經生長因子原液進行蛋白定量，然後稀釋至與生物活性參比品鼠源神經生長因子「蘇肽生」(舒泰神藥業，30ug/支，15000AU/支)相同的濃度，之後將樣品與對照標準品均按照一定比例稀釋5-8個梯度，加入到事先準備好的雞胚背根神經節培養皿中，觀察其刺激神經纖維生長發育狀況。根據以下標準，對結果進行判定神經節不長為陰性，以表示；神經節突起生長但較稀疏，以「 + 」表示，明顯生長以「++」表示；生長較好以「+++」表示；生長最好以「++++」表示，出現過量抑制以「+++*」表示。通常情況下，從出現陰性結果的稀釋度開始往回數第3和第4兩個稀釋度中取生長較好的作為判定終點，以稀釋度的倒數為樣品的效價(效價=AU/ml)。根據此法計算，本方法純化後重組人神經生長因子比活性為lX106AU/mg。雞胚神經纖維生長情況如圖5所示。
權利要求
1.基於CHO細胞表達系統的重組人神經生長因子純化方法，操作方法如下 1)將收穫的高表達重組人神經生長因子的CHO細胞上清先後離心去除活細胞、細胞碎片,過濾去除雜質和細菌； 2)將過膜後的細胞上清上樣於pH6.0—8. 0,20mmol/LPB緩衝液平衡好的FractogefEMDSOf (M)層析柱，上樣完畢後，用含 0. 2—0. 5mmol/L NaCl, pH6. 0—8. 0 的 20mmol/LPB緩衝液衝洗未結合蛋白以及雜質蛋白，之後用含0. 5—0. 85mol/L NaCl，pH6. 0 — 8. 0的20mmol/LPB緩衝液洗脫，收集目的蛋白峰； 3)將收集的目的蛋白峰，使用截留分子量為3K的超濾設備濃縮蛋白； 4)濃縮後的蛋白上樣於含0.15mol/L NaCl, pH7. 0的20mmol/L PB緩衝液平衡好的Superdex 75層析柱，收集目的蛋白峰，即為重組人神經生長因子原液。
2.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(I)中離心去除活細胞、細胞碎片的方法為先2000rpm離心去除細胞，然後8000rpm離心去除細胞碎片。
3.根據權利要求2所述的方法，所述步驟(I)過濾去除雜質和細菌的方法為離心後上清過0. 22 ii m濾膜，除去雜質和細菌。
4.根據權利要求3所述的方法，所述步驟(2)中過膜後的細胞上清用磷酸氫二鈉將pH調至7. O。
5.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(2)中上樣時流速2ml/min。
6.根據權利要求I所述的方法，所述超濾設備包括切向流超濾系統、中空纖維柱和超濾離心管。
7.根據權利要求I所述的方法，所述步驟(4)中上樣時流速lml/min。
全文摘要
本發明涉及「基於CHO細胞表達系統的重組人神經生長因子純化方法」，包括如下步驟1)將上清先後離心去除活細胞、細胞碎片，過濾去除雜質和細菌；2)上清上樣於EMD SO3-(M)層析柱，衝洗未結合蛋白以及雜質蛋白，洗脫，收集目的蛋白峰；用截留分子量為3K的超濾設備濃縮蛋白，4)上樣於含Superdex 75層析柱，收集目的蛋白峰，即為重組人神經生長因子原液。本發明的表達系統和方法可以製備純度大於98％，比活性高於5×105AU/mg的重組人神經生長因子。本發明與其他方法相比減少了操作步驟，大大縮短了生產周期，提高了處理量和得率，適合規模化生產。
文檔編號C07K14/48GK102702341SQ20121020617
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者樂偉, 劉荷中, 史權威, 李曼, 霍立紅 申請人:北京華安科創生物技術有限公司