基於編輯的可篩選質體標記基因的製作方法

2023-09-22 18:48:50

專利名稱：基於編輯的可篩選質體標記基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學領域。具體地講，提供了便於在多細胞植物(所編碼的RNA在轉錄後修飾)中篩選穩定轉化質體的DNA構建物。
背景技術：
為了更充分描述與本發明相關的技術狀況，本申請以在括號中註明作者姓名和發表年代的方式引用一些參考文獻。這些文獻的完整引述列於說明書之後。這些文獻的公開內容通過引用結合到本文中。
植物遺傳工程包括通過導入新DNA對植物基因組和植物基因表達進行直接操作的遺傳轉化技術的發展和應用。一種轉化方法是用來自細菌根癌農桿菌的腫瘤誘導(Ti)質粒的衍生物。其它方法採用生物發射(biolistics)、電穿孔、聚二乙醇處理將基因直接轉入原生質體。
雖然對那些本技術領域的專業人士來說，將轉化DNA加入植物細胞核中早已熟知，但是對於排除其它遺傳阻隔而有所選擇地鑑別轉化質體DNA的轉化方案尚未有所描述。採用以上所述的方法，如果希望只轉化質體，核轉化子可能表達編碼選擇標記的基因並導致假陽性的產生。
對於質體特異性標記基因的需要基於以下觀察。在早期工作中，對受轟擊的pTNH32菸草葉片進行卡那黴素抗性篩選時產生了大量核轉化子(Carrer等，1993)。事實上，其它質體kan基因(Comelissen和Vandewiele,1989)及無啟動子kan構建物(Koncz等，1989)的核基因轉化子得率證實，卡那黴素抗性克隆可通過用未設計用於核中表達的構建物進行轉化而輕易獲得。另外，菸草中的核基因轉化子也可通過篩選設計用於在質體中表達的壯觀黴素抗性基因而回收。
已知植物細胞中有大量質體基因組，則在培養物中篩選轉化基因組的能力是獲得成功轉化的關鍵因素。已經通過從所培養的植物細胞中篩選各種底物(如抗生素類和除草劑)的抗性突變體來鑑別選擇標記。這些抗生素和除草劑列於以下表Ⅰ中。但是，迄今為止，還沒有開發出一種方法能夠在促進質體轉化的同時排除對核轉化子的篩選。這種系統的開發減少發生核轉化而導致的假陽性。
RNA編輯是在轉錄後改變RNA序列的過程。直至最近，人們認為葉綠體(與線粒體相對)不利用RNA編輯，並且從相應的基因序列預期的胺基酸序列通常都正確。雖然大多數葉綠體基因始於標準的ATG起始密碼子，但已經鑑別出在相應於其它物種中同源基因的5』端ATG的位置處編碼ACG基因。最近的研究表明，該ACG密碼子在mRNA水平上並不保守。通過C變U的編輯，它轉化成功能性AUG密碼子(Hoch等，1991)。至今所發現的大多數被編輯密碼子，恢復了在其它物種葉綠體的相應多肽中保守的胺基酸。這種編輯過程是質體所特有的。在質體中所編輯的基因在植物的核中或其它細胞器中並不被編輯。
基於僅僅發生於質體的轉化構建物中的RNA編輯的要求，本發明提供有助於篩選穩定轉化質體的DNA構建物和方法。質體基因組定向操作現在可以更容易地進行。這些操作包括質體中基因置換、基因缺失、外源基因插入以及重組蛋白表達。
發明概述本發明提供篩選多細胞植物中穩定轉化質體的DNA構建物和方法。本發明的DNA構建物可用來僅僅篩選質體轉化子。核轉化子用本發明構建物將得不到篩選。
根據本發明的一個方面，將嵌合DNA構建物描述為含有與選擇標記基因在轉錄水平相融合的編輯基因片段。在質體中發生RNA水平編輯之後，表達選擇標記基因。細胞或組織維持於選擇培養基上直至它們達到同質狀態，這時基本上所有細胞或組織的質體都已被轉化。
在本發明的一個優選實施方案中，將以上所描述的嵌合構建物加入一個載體中，該載體含有定向整合進質體基因組所必需的同源序列。該導向區段具有足夠大小，以便促進與預定質體基因組序列同源重組，並由此在轉化質體的基因組中置換該序列。該載體還可以另外含有目的性外源基因來有益地增強植物的表型。在本發明的再一實施方案中，嵌合DNA構建物可以含有指導目的性外源基因的組織特異性調控序列。
本發明方法一般在雙子葉植物和單子葉植物中均可用於穩定轉化質體的篩選。經過篩選之後，將表達選擇性表型的細胞或組織再生成多細胞植物。
附圖簡述

圖1是菸草質體的psbE操縱子和psbF DNA及psbL DNA以及胺基酸序列的圖解。下邊劃線的是所編輯的psbL起始密碼子(從ACG變至AUG)。用虛線框起來的是ΔpsbF/ΔpsbL區。標明了寡核苷酸01、06、07、015及016的位置。按照Shinozaki等(1986)對所述DNA序列編號。
圖2是物理圖譜和部分DNA序列圖2A顯示質粒pJLM20中的EaadA基因，圖2B顯示質粒pJLM18中的Ekan基因。Prrn序列中的下劃線部分是保守的-10/-35啟動子元件和核糖件結合位點(RBS)。用虛線框注的是ΔpsbF/ΔpsbL區來源的DNA序列，實心框中的是在構建過程中導入的新序列。在所編輯的psbL起始密碼子(從ACG變為AUG)下劃線。Trps16是質體rps16核糖體蛋白基因的3』-端非翻譯區。標明了EaadA中寡核苷酸01、02和03以及Ekan中寡核苷酸01、04和05的位置。限制性酶切位點的縮寫為B,BspHⅠ；H,HindⅢ；N,NcoⅠ；S,SacⅠ；X,XbaⅠ。
圖3是凝膠圖和放射自顯影圖，表明在Nt-pHC94-1植物中EaadAmRNA的編輯以及在Nt-pJLM23-2植物中Ekan mRNA的編輯。圖3A表明用引物01和02對EaadA模板，以及用引物01和04對Ekan模板從DNA(泳道1、5)和cDNA(泳道2、6)進行PCR擴增的產物。引物的位置示於圖2A和圖2B。對照物是以相同引物用DNaseⅠ處理的RNA(泳道3、7)和只用緩衝液(泳道4、8)所進行的擴增反應。圖3B表示Nt-pHC94-1植物中EaadA的DNA序列和cDNA序列，圖3C表示Nt-pJLM23-2植物中的Ekan。擴增產物直接用引物03(EaadA)和05(Ekan)進行測序。由於引物的方向性，所示的序列與所述mRNA互補。所述序列中的編輯位點同箭頭標明。請注意在cDNA樣本中編輯位點處混合的核苷酸A和核苷酸G表示部分編輯。
圖4是表明轉基因植物中psbL mRNA編輯的凝膠圖和放射自顯影圖。圖4A表明用引物01和06從野生型植物Nt-pHC94-1(EaadA)及Nt-pJLM23-2(Ekan)的DNA(泳道1、5、9)和cDNA(泳道2、6、10)所得到的PCR擴增產物。對照物是用DNaseⅠ處理的RNA(泳道3、7、11)和只用緩衝液(泳道4、8、12)所進行的擴增反應。野生型中psbL的DNA序列和cDNA序列示於圖4B。圖4C表明Nt-pHC94-1(EaadA)中的序列。圖4D表示Nt-pJLM23-2(Ekan)植物中的序列。擴增產物用引物07直接測序。由於引物07的方向性，所示序列與mRNA序列互補。編輯位點用箭頭標明。注意在野生型植物中幾乎完全編輯(G*符號)，在轉基因植物中部分編輯。
圖5顯示質體基因組的部分DNA圖譜以及表明psbL mRNA和嵌合mRNA穩定狀態水平的放射自顯影圖。圖5A表明質體基因組的部分圖譜，其中EaadA基因和Ekan基因通過用pHC94質粒或pJLM23質粒進行轉化而獲得。標明了16SrRNA基因和trnⅤ基因以及rps12/7操縱子。水平箭頭表示用寡核苷酸針014探測到的mRNA。圖5B中上面一組放射自顯影結果表明，寡核苷酸014探測到相似大小(1.1kb)的psbE、EaadA和Ekan轉錄物以及2.2kb的Ekan-aadA轉錄物。另外，還可見到少量未特徵鑑定的RNA片段，它們不包括在定量範圍內。上樣的細胞總RNA(每泳道2μg)來自野生型植物(Wt)、質粒pHC94轉化植物(Nt-pHC94-1)、Nt-pHC94-11、Nt-pHC94-21)以及質粒pJLM23轉化植物(Nt-pJLM23-2、Nt-pJLM23-14、Nt-pJLM23-18)。圖5B中下面一組結果表明用探針psbJ探測到psbE mRNA的累積和作為對照16SrRNA的累積。洗去濾膜上的標記寡核苷酸014，並用psbJ探針和16SrDNA探針的混合物進行探測。探針psbE通過用圖1所示的引物015和016對psbJ區進行pCR擴增而獲得。16SrDNA探針是以質體基因組中核苷酸138448/141847處的限制性酶切位點限定的2.4kb的EcoRⅠ/EcoRⅤ ptDNA片段(Shinozaki等，1986)。
圖6是表明野生型植物和轉基因Nt-pHC94-1植物中rpoB轉錄物和ndhB轉錄物編輯的一系列放射自顯影圖。運用以下引物對於rpoB為08和09；對於ndhB為010和011,pCR擴增與每個基因相對應的DNA序列和cDNA序列。rpoB的測序引物為08,ndhB的是01。所述序列中的編輯位點用箭頭表示。DNA中箭頭所指向的C在rpoB轉錄物和ndhB轉錄物的位點Ⅰ和位點Ⅱ處被編輯成T。
圖7是描述用來定義psbL編輯所需區方法的部分圖譜和一系列放射自顯影圖。圖7A表示嵌合基因ΔpsbL/kan的圖譜，圖頂部是放大的98nt ΔpsbF/Δpsb片段。標出了引物04、05和017的位置。66,780和66,638是菸草質體基因組中98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段末端的核苷酸(Shinozaki等，1986)。圖7A的下面部分是一系列載有嵌合基因ΔpsbL/kan的pPRV111A質粒衍生物。給出相應於已編輯C的ΔpsbF/ΔpsbL缺失衍生物末端的核苷酸位置(位置O；如箭頭所指)。列出嵌合ΔpsbL/kan mRNA的編輯效率(％)、以及轉基因植物的卡那黴素抗性表型，圖7B是證明所述嵌合mRNA中psbL位點編輯的放射自顯影圖。用引物017和04PCR擴增cDNA，並用引物05直接測序。由於05的方向性，所述序列與mRNA互補。相應地，編輯位點的A表明C轉變為C事件，G表明未編輯的核苷酸C。
圖8是表明轉基因植物中psbL編輯的部分DNA圖譜和一系列放射自顯影圖，所述轉基因植物含有與編輯位點相鄰的突變。圖8的上面部分表明被編輯C的位置(箭頭所指)以及98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段中的側翼序列。下面部分是質粒pSC14和pSC15中的突變。通過對嵌合cDNA(底部)測序檢測編輯情況。列出所計算的嵌合mRNA編輯效率(％)。實驗的細節可參見圖7的說明。
圖9顯示部分DNA圖譜和一系列入射自顯影圖，說明轉基因植物中存在psbL特異性反式因子(psbL-SEF)的競爭。圖9A顯示含有psbL基因的psbE操縱子的圖譜，標明用於PCR擴增和測序的寡核苷酸01、06及07的位置。顯示編輯所需的22nt(-16/+5)序列。被編輯的C用箭頭標出。競爭psbL-SEF的16nt片段用方框標出。列出了用於獲得轉基因植物的質粒，如在圖7和圖8中鑑別的。與未轉化的野生型植物相比，psbL mRNA編輯效率降低表明了競爭(+)。圖9B是表明psbLmRNA編輯的放射自顯影圖。用引物01和16進行PCR擴增cDNA並用引物07直接測序。由於07的方向性，所示序列與mRNA互補。相應地，編輯位置處的A表示由C向U的轉變事件，G表示位置上未編輯的核苷酸C。A+G*表示在野生型植物中幾乎完全編輯(＞99％)。A+G表示具有大約10％未編輯psbL轉錄物的部分編輯。
圖10是部分DNA圖譜和一系列放射自顯影圖，說明含有ndhD編輯位點的嵌合mRNA不競爭psbL-SEF。圖10A顯示包含ndhD、PsaC和ndhE基因以及具有被編輯ndhD翻譯起始密碼子(下劃線)的DNA序列的菸草質體基因組的部分圖譜。根據Shinozaki等(1986)的方法標記基因並對DNA序列編號。虛線框內的ΔndhD區段與kan基因在翻譯水平上相融合，如圖10B所示。指出了引物018、019和020的位置。編輯位點(下劃線)上遊26bp處的核苷酸A在該嵌合基因構建過程中轉變成C。圖10B表明在質粒pSC23中的嵌合基因ΔndhD/kan在Prrn/Trps16盒中表達。標明了引物04、05和017的位置。圖10C描繪表明野生型植物(Nt-wt)、Nt-pSC23及Nt-pSC2植物中ndhD位點和psbC位點編輯狀況的放射自顯影圖。在內源ndhD及嵌合ΔndhD/kan的mRNA中研究ndhD位點的編輯。在內源psbL及嵌合ΔpsbL/kan的mRNA中研究psbL位點的編輯。用引物018和019擴增ndhD cDNA並用引物020進行測序。用引物01和06PCR擴增psbL cDNA並用引物07直接測序。用引物017和04擴增ΔndhD/kan和ΔpsbL/kan的cDNA，並用引物05進行測序。由於測序引物的方向性，所示序列與所述mRNA互補。相應地，編輯位置的A表示C向U的轉變事件，G表示未編輯的核苷酸C。
圖11是Δrpl2/kan基因的示意圖。圖11A顯示包含基因trnⅠ、rpl23、rpl2和trnH、以及具有被編輯rpl2翻譯起始密碼子(下劃線)的DNA序列的玉米質體基因組的部分圖譜。按照Maier等(1995)的方法標記基因並將該DNA序列編號。如圖11B所示，虛線框內的Δrpl2區段與基因kan在翻譯水平上相融合。圖11B證明質粒pSC22中的嵌合基因Δrpl2D/kan在Prrn/Trps16盒中表達。標明了引物04、05和017的位置。
圖12是用於檢測ndhE和rpoBRNA的區段中編輯狀況的小基因的示意圖。圖12的上面部分是nhdB質體基因及其小基因，也顯示了rpoB質體基因及其相應的小基因(圖12的下面部分)。圖中標明編輯位點。小基因的RNA在下述盒中表達，該盒包含rRNA操縱子啟動子(Prrn)及mRN穩定性所需的rps16核糖體蛋白基因(Trps16)的3』端非翻譯區(Zoubenko等，1994)。表Ⅳ中列有編輯位點和參考文獻。
發明詳述按照本發明，提供促進轉化基因送遞後篩選轉化質體的方法和DNA構建物。本發明的構建物只有當它們在質體中在RNA水平上被正確編輯時才表達。就目前所知，這裡所描述的方法和DNA構建物迄今還未應用於多細胞植物中。
以下的定義將有助於理解本發明要點異質的(heteroplasmic)指在單個質體中或在植物細胞或組織中含有的質體群體中存在不同質體基因組的混合群體。
同質的(homoplasmic)指或者在一個質體中或者在植物細胞或組織中含有的群體中質體基因組的純群體。同質的質體、細胞或組織在遺傳上是穩定的，因為它們只含有一種類型的質體基因組。因此，甚至在除去選擇壓力之後它們仍保持同質性，並且自交後代也是同質的。本著本發明目的，功能上同質的異質基因組群體(例如，僅含有少量野生型DNA或具有序列變異的轉化基因組的群體)在此可稱為「功能同質的」或「基本同質的」。通過在非致死選擇培養基上連續篩選，這些類型的細胞或組織可輕易純化成同型異源性(homoplasmy)。由於質體基因組的隨機分選，大多數這種植物的種子後代在無選擇壓力下是同質性。
質體基因組(plastome)質體的基因組。
轉質體基因組(transplastome)轉化的質體基因組。
質體轉化轉化DNA在質體基因組中的穩定整合，它可傳遞至含有所述轉化質體的植物的種子後代中。
選擇標記名詞「選擇標記」指一種表型，當用於轉化的外源DNA中包含編碼該選擇標記的基因或等位基因時，該表型鑑別成功轉化的細胞器、細胞或組織。
轉化DNA指同源DNA或以側翼為同源DNA的異源DNA，當導入質體中時，它通過同源重組成為質體基因組的部分。
編輯基因區段指編碼轉錄後改變的RNA的DNA區。
翻譯水平融合指兩個獨立基因的兩個編碼區剪接在一個結構中，使得這兩個基因在蛋白質水平上都表達。按照本發明，嵌合蛋白的翻譯依賴於mRNA水平上適合的上遊編碼區的編輯。
在以下詳述中提供產生和運用本發明DNA構建物的優選方法和實踐本發明方法的實施例。任何未作具體敘述的分子克隆和重組DNA技術均按照標準方法進行，這些方法一般在如Sambrook等的「DNA克隆，實驗室手冊」，冷泉巷實驗室，1989中提出。
在詳述中和以下所列舉的實施例中，優選實施方案包括編碼編輯RNA區段的DNA區段，該編輯RNA區段與編碼選擇標記的第二DNA片段操作性連接。在以下實施例中列舉了菸草葉綠體。含有這些組合的轉化載體在幫助質體特異性轉化中有用。菸草葉綠體基因組上的位置和序列參考文獻取自Shinozaki等，EMBOJ.,5:2043-49(1986)，該文獻公開了菸草葉綠體基因組的全部核苷酸序列。雖然將菸草作為範例，但那些本領域技術人員會認識到，可以將本發明的DNA構建物和方法運用到其它植物物種的質體中。
質體轉化需要(1)穿過質體雙層膜送遞DNA的方法；(2)異源DNA整合，而不幹擾質體基因組正常功能；以及(3)轉化質體基因組的有效篩選。進行多細胞植物質體有效轉化的方法學在1995年9月19日頒發的美國專利5,451,513號中提出，該專利的全部內容通過引用結合到本文中。
根據本發明，已經發現用於鑑別轉質體基因組的選擇標準對於高等植物中質體穩定轉化的成功至關重要。因此，本發明選擇技術在轉化DNA中運用了編碼選擇性表型(「選擇標記」)的DNA。在一定程度上由於每個植物細胞中存在大量相一致的質體基因組拷貝(與衣藻屬中單個質體上所載有的80個拷貝相比，3000-12000個拷貝位於菸草中大約100個質體上)，篩選過程十分有利於獲得轉質體基因組品系。選擇性表型可包括抗生素抗性、除草劑抗性、藥物抗性或針對代謝產物毒性類似物的抗性。
本發明提供需要RNA編輯過程的選擇標記基因，所述RNA編輯過程只在質體中發生，不在核中或線粒體中發生。這種質體特異性標記基因將大大增強在多細胞植物中獲得穩定轉化質體的能力。控制選擇標記表達的質體特異性編輯位點的新組合將在下文中有所描述。
某些mRNA序列可通過稱作RNA編碼的過程在轉錄後得到改變，因此它們最終的核苷酸序列與DNA序列所編碼的不同。在包括錐蟲、Physarum polycephalum、哺乳類、病毒以及涉及廣泛不同分子機制的高等植物在內的不同生物體中已經檢測到該過程(綜述Benne,1994；Chan,1993；Gray和Covello,1993；Innerarity等，1996；Simpson和Thiemann,1995)。
在高等植物中，質體和線粒體RNA的編輯包括C向U轉變，而在線粒體中甚少有U變為C的情況。據估計質體中的編輯位點數大約為25個(Maier等，1995)，而在植物線粒體中約有1000個或更多(Schuster和Brennicke,1994)。對編輯位點周圍序列的比較並未鑑定出能夠指導位點篩選過程的任何保守的一級序列和/或結構基元。最近開發的體外編輯系統應該導致加快植物線粒體中RNA編輯的分析進程(Araya等，1992；Yu和Schuster,1995)。雖然仍然缺乏體外進行質體編輯的系統，但質體轉化的可用性提供研究質體編輯的體內途徑(Bock等，1994；Bock和Maliga,1995；Sutton等，1995)。
已經報導RNA編輯發生在質體和線粒體中，而還未曾在核中觀察到RNA編輯(Kossel等，1993；Hanson等，1995)。另外，線粒體轉錄物不在質體中編輯(Sutton等，1995)。對於RNA編輯以及用質體指導的構建物轟擊植物細胞後回收大量核轉化子這一問題的發現，導致本發明質體轉基因的設計，該轉基因在質體中表達，而在其它細胞的遺傳區室中不表達。以下實施例描述本發明的轉基因。
簡略地說，基於編輯的選擇標記基因的第一個實施例採用與抗生素抗性基因編碼區在翻譯水平融合的編輯質體基因的N-端區段。該抗生素抗性基因的表達依賴於該構建物的RNA編輯。在一個具體實施例中，psbL的N-端區段與aadA基因的編碼區相融合。aadA基因的翻譯依賴於編輯，並通過直接篩選用於回收質體轉化子(Chaudhuri等，1995)。另外，基於psbL的編輯選擇標記可包含相似的ΔpsbL/kan嵌合基因(Chaudhuri和Maliga,1996)，其中卡那黴素抗性是翻譯起始密碼子編輯的可靠測量手段(Chaudhuri等，1995；Chaudhuri和Maliga,1996)。雖然當這些基因存在於細胞中每個質體基因組拷貝中時賦予植物細胞的卡那黴素抗性，但它們並不能用於直接篩選。這大概是因為只有當嵌合基因高水平表達時，質體轉化子才能夠通過卡那黴素抗性直接篩選。通過適當工程改造提高Ekan基因的表達水平，該基因的直接篩選應當是可行的。
基於編輯的選擇標記基因的第二個創新實施例採用編輯的ndhD區段。這種ΔndhD/kan構建物由ndhD的N-端區段與kan的編碼區相融合而獲得(Chaudhuri和Maliga,1996)。以上所描述的選擇標記基因將有助於某些雙子葉物種中篩選轉化子。
第三種基於編輯的標記基因Δrpl2/kan通過編輯的rpl2區段與卡那黴素編碼區相融合而產生。這種嵌合選擇標記基因將有益於在單子葉物種進行質體轉化子的篩選。
在菸草質體中，有功能的psbL mRNA和ndhD mRNA通過將ACG密碼子編輯成ACG翻譯起始密碼子而產生。為了確定編輯是否在嵌合mRNA中發生，如以下實施例中所述將含有該編輯位點的psbLN-端部分與aadA和kan的細菌基因在翻譯水平上相融合。通過定向基因插入將所述嵌合構建物導入菸草質體基因組。98nt片段的缺失衍生物作為嵌合轉錄物的部分表達，界定了psbL編輯所需的順式序列。根據本發明，已發現22nt片段足以指導psbL編輯。雖然編輯需要該22個核苷酸，但只有16個核苷酸競爭psbL-特異性編輯因子。
嵌合基因轉錄物的表達導致內源psbL mRNA的編輯效率明顯下降。但是，在轉質體基因組系中位於rpoB mRNA和ndhB mRNA中的四個位點的編輯效率未改變。這種在轉質體基因組系中psbL編輯效率下降，而其它四個位點未下降，表明psbL-特異性編輯因子耗盡。這個發現意味著在高等植物的質體mRNA編輯中涉及位點特異性因子。
除psbL外，還表明菸草中的編輯產生了ndhD的翻譯起始密碼子AUG(Neckermann等，1994)。為了檢測起始密碼子的編輯是否涉及普通的可耗盡反式因子，在菸草質體中表達了含ndhD編輯位點的嵌合基因。數據表明，對於psbL,ndhD位點的編輯需要可耗盡的反式因子。但是，該反式因子與psbL編輯所需要的有所不同。
在玉米質體中，rpl2的翻譯起始密碼子通過編輯產生(Hoch等，1991)。為了檢測玉米rpl2前後序列中的ACG密碼子是否在菸草質體中編輯，通過將rpl2的N-端片段與kan編碼區在翻譯水平上相融合構建了Δrpl2/kan基因。該嵌合mRNA在菸草中不編輯，但卻為如玉米和水稻這樣的禾穀類提供了有用的選擇標記。
提供以下實施例僅僅說明實施本發明的典型方法。其目的決不在於限制本發明範圍。
實施例1基於編輯的Ekan和EaadA選擇標記基因A．所述嵌合基因的構建psbL基因編碼光合系統Ⅱ的多肽，並且是psbE操縱子的部分(Carillo等，1986；見以上圖1)。將包括psbL編輯位點ΔpsbF/ΔpsbL在內的98個核苷酸的片段克隆在壯觀黴素抗性基因(aadA)編碼序列的上遊，這樣就使psbL的N-端與aadA在翻譯水平上相融合。該ΔpsbF/ΔpsbL片段含有psbF C-端的40個核苷酸、位於psbF和psbL之間的基因間隔區的22個核苷酸以及psbL N-端的36個核苷酸。將該構建物克隆在Prrn/Trps16質體表達盒中(圖2A)。Prrn含有質體rRNA操縱子的啟動子、一個核糖體結合位點以及一個翻譯起始密碼子(ATG)。在該嵌合構建物中，截短的psbF編碼區與Prrn起始密碼子(ATG)形成可讀框，而EaadA讀框的翻譯(psbL-aadA融合肽)依賴於通過編輯psbL位點而產生的翻譯起始密碼子(ACG變為AUG)。請注意，在EaadA mRNA中這兩個編碼區處於不同的讀框中。參見圖2A。
用示於圖2B的相同的ΔpsbF/ΔpsbL片段，通過psbL與kan在翻譯水平上融合，獲得Ekan基因，kan為編碼新黴素磷酸轉移酶的卡那黴素抗性基因。Ekan具有psbL N-端的39個核苷酸而非36個核苷酸，除此之外Ekan與EaadA基因類似。以下提出詳細的該基因構建技術說明。
質粒pJLM18中的Ekan基因(示於圖2B)在pBluescript KS+質粒(Stratagene)中構建。pJLM18中的Ekan編碼區在Prrn/Trps16盒中表達。Prrn的5』調控區由質體rRNA操縱子啟動子和核糖體結合位點組成，並位於EcoRⅠ/NcoⅠ片段上。Prrn來源於質粒pZS197(Svab和Maliga,1993)的祖先質粒pZS195，其中翻譯起始密碼子(ATG)包括在NcoⅠ位點中。將Prrn的NcoⅠ位點與BspHⅠ/XbaⅠ片段的BspHⅠ位點相連接；該NcoⅠ/BspHⅠ融合體消除了這兩個限制性位點。通過將重疊的5』CATTCATGACTTTGGGATCAATATCAGCATATGCAGTTCATCCAACGATAAACTTAATCCGAATTATAGAGC-3』和5』CGGTCTGAATTCAATTCAACATTTTGTTCGTTCGGGTTTGATTGTGTCGTAGCTCTATAATTCGGATTAAG-3』單鏈寡核苷酸一起退火，並用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段進行延伸，獲得BspHⅠ/XbaⅠ寡核苷酸。該BspHⅠ/XbaⅠ片段含有圖2B框中的序列，包括編碼psbF C-末端的ΔpsbF/ΔpsbL序列、所述基因間隔區以及psbL的N-端部分。NcoⅠ/BspHⅠ融合的結果是，psbF的C-末端從Prrn翻譯起始密碼子(ATG)處翻譯。為了從翻譯水平將psbL的14個N-端密碼子與kan編碼區融合，通過綠豆核酸酶處理除去了BspHⅠ/XbaⅠ片段的XbaⅠ單鏈突出部分和kan NcoⅠ位點的單鏈突出部分(包括翻譯起始密碼子)，隨後將它們連接在一起。該kan編碼區作為NcoⅠ/XbaⅠ片段來自質粒pTNH4(Carrer等，1993)。Trps16片段包含在一個XbaⅠ/HindⅢ片段中，並通過該XbaⅠ位點與Ekan編碼區相連。該Trps16片段含有ptDNA中位於核苷酸5,087至4,939之間的rps16基因3』調控區(Shinozaki等，1986)。該片段5』末端的XbaⅠ位點通過寡核苷酸定點誘變而產生；該片段的3』末端是從質體基因組中位於核苷酸4,938處的EcoRⅠ位點切下的(Staub和Maliga,1994)。然後將EcoRⅠ位點通過與接頭連接轉換為HindⅢ位點。為了導入質體基因組中，將該Ekan構建物作為EcoRⅠ/HindⅢ片段克隆在質體載體pPRV111B的多克隆位點中(Zoubenko等，1994；基因庫登記號U12813)，並與aadA選擇性基因相鄰。
圖2A所示的質粒pJLM20中的EaadA基因如對於Ekan基因所述一樣，構建在pBluescript KS+質粒中。含有aadA編碼區的NcoⅠ/XbaⅠ片段來自質粒PHC1(Carrer等，1991)，該aadA編碼區與菸草psbL基因的12個N-端密碼子在翻譯水平上相融合。為了導入質體基因組中，將EaadA基因克隆在質體插入載體pPRV100B中(Zoubenko等，1994，基因庫登記號U12811)。載體pPRV100B上有一個側翼為ptDNA序列的多克隆位點，但無選擇性質體標記基因。
雖然本文以卡那黴素、壯觀黴素和/或鏈黴素抗性為例，但設想了其它選擇性標記基因的應用。這些基因列於以下的表Ⅰ中(Potrykus等，(1995)引自Gene Transfer to Plants,Springer Verlag)。
表Ⅰ植物轉化的選擇性標記基因篩選劑標記基因基因產物卡那黴素，G418nptⅡ 新黴素磷酸轉移酶Ⅱ慶大黴素 aacC3 慶大黴素-N-乙醯轉移酶aacC4潮黴素hph,hpt 潮黴素磷酸轉移酶甲氨蝶呤 dhfr二氫葉酸還原酶壯觀黴素 16SrDNTA16SrRNAaadA氨基糖苷-3』-腺苷醯轉移酶鏈黴素SPT 鏈黴素磷酸轉移酶16SrDNA 16SrRNAaadA氨基糖苷-3』-腺苷醯轉移酶博菜黴素 ble腐草黴素殺稻瘟素 bsr 殺稻瘟素S脫氨酶磺胺 sul 二氫蝶酸合酶膦絲菌素 bar 膦絲菌素乙醯轉移酶氯磺隆als 乙醯乳酸合酶csr-1溴苯腈bxn 溴苯腈腈水解酶草甘膦EPSPS 5-烯醇丙酮醯-莽草酸鹽-3-磷酸合酶2,4-D tfdA2,4-二氯苯氧乙酸單加氧酶莠去津psbAQ蛋白2,2-DCPA 脫滷素酶4-甲基-色氨酸 tdc 色氨酸脫羧酶硝酸鹽NR 硝酸還原酶S-氨乙基-L-半胱氨酸 DHPS二氫吡啶甲酸合成酶賴氨酸/蘇氨酸 AK 精氨酸激酶氨乙基-半胱氨酸 OSC 章魚鹼合酶
B．抗生素抗性轉質體基因組系的轉化和篩選將EaadA基因克隆進質體轉化載體pPRV100B(Zoubenko等，1994)中產生了質粒pHC94，通過生物發射方法將pHC94導入菸草葉綠體。該嵌合基因在trnⅤ-tps7/12基因間隔區中經過兩次同源重組整合進質體基因組。在經過轟擊的50個葉片的一個樣本中，通過壯觀黴素抗性選擇導致分離到43個壯觀黴素抗性克隆。其中有34個克隆經DNA凝膠印跡分析證實載有EaadA基因(數據未示)。抗生素抗性的表達說明了嵌合EaadA的編輯。EaadA基因的選擇效率與其表達不依賴於編輯的aadA基因(Svab和Maliga,1993)的選擇效率相當，大約為每個轟擊葉片樣本中有一個質體轉化子。對三個獨立的轉化系Nt-pHC94-1、Nt-pHC94-10和Nt-pHC94-11做了進一步研究。由於卡那黴素抗性的直接篩選效率不高(Carrier等，1993)，將Ekan基因與轉化載體pPRV111B中的壯觀黴素抗性基因相連產生質粒pJLM23。用pJLM23質粒包裹的鎢粒轟擊之後，嘗試進行質體轉化子的直接篩選。在200個受轟擊葉片的一個樣本中(100個，每個在50μg/ml和100μg/ml硫酸卡那黴素上篩選)未獲得卡那黴素抗性克隆。但是，通過篩選與之相連的壯觀黴素抗性基因，獲得了含有Ekan基因的轉基因植株。對三個獨立的轉化系Nt-pJLM23-2、Nt-pJLM23-14和Nt-pJLM23-18做了進一步研究。每個克隆的葉段在卡那黴素培養基(50μg/ml)上均增殖，表明Ekan基因的表型表達。用於質體轉化的方法詳述於下文。
將菸草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana)植株無菌生長於含有MS鹽(Muvashige和Skoog,1962)和蔗糖(30g/L)的瓊脂固化培養基上。將葉片的背軸面朝上置於RMOP培養基上準備轟擊。RMOP培養基含有MS鹽、N6-苯甲基腺嘌呤(1mg/L)、1-萘乙酸(0.1mg/L)、硫胺(1mg/L)、肌醇(100mg/L)、瓊脂(6g/L)，pH為5.8，並加蔗糖(30g/L)。採用杜邦PDS1000He型基因槍，將1μm鎢粒表面的DNA導入葉綠體中(Maliga,1995)。在含有500μg/ml壯觀黴素二鹽酸鹽的RMOP培養基上篩選壯觀黴素抗性克隆。抗性苗在相同的選擇培養基上再生，並在MS瓊脂培養基上生根(Svab和Maliga,1993)。在含有50或100μg/ml硫酸卡那黴素的RMOP培養基上篩選卡那黴素抗性克隆(Carrier等，1993)。C．EaadA、Ekan和psbL轉錄物的編輯EaadA植物和Ekan植物抗生素抗性表型的表達表明嵌合基因被編輯，因為它們的翻譯依賴於將ACG密碼子編輯為AUG起始密碼子。為了直接檢測EaadA mRNA和Ekan mRNA的編輯，用位於psbF編碼區中的引物01以及分別位於EaadA中和Ekan編碼序列的引物02和04PCR擴增cDNA。這些引物的位置示於圖2。PCR擴增產物示於圖3A。對三個獨立轉化EaadA系的PCR產物進行的直接測序和phosphorimager分析，表明大約70％的EaadA轉錄物被編輯。參見圖3B和表Ⅱ。
表Ⅱ野生型葉片和轉基因葉片中未編輯mRNA(％)
圖3中相應於核苷酸的條帶放射性通過phosphorimager分析測定。將DNA上樣量和標記效率的數值對相同泳道中6條其它條帶的數值歸一化。未編輯mRNA的百分比=[正確的(corrected)未編輯信號/(正確編輯信號+正確未編輯信號)]×100如圖3C和表Ⅱ所示，發現Ekan mRNA的編輯程度相似。由於從非反轉錄DNaseⅠ處理的RNA樣本中未獲得PCR擴增產物，所以部分編輯不能歸因於RNA樣本中出現了汙染DNA。參見圖3A；泳道3和泳道7。所述嵌合轉錄物中的psbL位點僅僅是部分編輯(大約70％)，而在野生型植物葉片中99％以上的psbL mRNA被編輯(Kudla等，1992；Bock等，1993)。因此很有興趣確定psbL mRNA的編輯在轉基因植物中是否受影響。用圖1A所示的psbF和psbJ編碼區中的引物01和引物06，從野生型植物和轉基因植物中PCR擴增psbL的cDNA。對PCR產物的直接測序表明，轉基因植物含有約10％未編輯的psbLmRNA。這說明未編輯的psbL mRNA水平在轉基因植物中增加了10倍以上。參見圖4和表Ⅱ。由於在非反轉錄DNAaseⅠ處理的RNA樣本缺乏PCR產物，所以排除對RNA樣本造成DNA汙染的人為因素。參見圖4A泳道3、7和11。用表研究質體mRNA編輯的方法描述於下文。
按照Mettler(1987)法分離細胞總DNA。用TRIzol(Gibco BRL)提取細胞總RNA。按Kudla等(1992)的描述對用蛋白酶K和DNAseⅠ處理的RNA樣本進行反轉錄。用標準方法PCR擴增DNA和cDNA:92℃ 1min,55℃ 2min,72℃ 1.5min，共30個循環。
在1.5％瓊脂糖凝膠上分離PCR擴增產物，並用GenecleanⅡ試劑盒(BIO 101 Inc.)將其純化。用測序試劑盒(USB)和去垢劑Nonidet P-40，如(Bachmann等，1990)所述方法對DNA進行直接測序。
以下是用於PCR的引物一覽表015』-CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC-3』025』-CCAAGCGATCTTCTTCTTGTCCAA-3』035』-GCGCTCGATGACGCCAAC-3』045』-CACGACGAGATCCTCGCCG-3』05 5』-GAATAGCCTCTCCACCCA-3』06 5』-GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCC-3』07 5』-GGAAAATAAAACAGCAAGTAC-3』08 5』-CAAATATTGCAAAGTCCCGG-3』09 5』-CCGGATCGCCACCTACAC-3』0105』-TGGCTATAACAGAGTTTCTC-3』0115』-GGATTTCCAGAAGAAGATGCC-3』0145』-GTTCGTTCGGGTTTGATTGTG-3』0155』-GAACTCAACGGGCCCTTCCCC-3』0165』-GGAGGGAAGTGGAGTAAATGGCCG-3』D．psbL、EaadA以及Ekan mRNA的相對豐度轉基因系中部分編輯psbL mRNA的累積原因可歸結為它與嵌合EaadA mRNA或Ekan nRNA競爭編輯所需的限制性普通因子。因此，測定psbL轉錄物及嵌合物轉錄物的相對豐度。值得注意的是，多順反子的psbE(Carillo等，1986)mRNA及EaadA和Ekan mRNA大小均為約1.1-kb。為了對這些轉錄物的累積進行定量，運用了Northern印跡上的DNA示差探針(differential probe)。參見圖5。用psbJ編碼序列片段探測，表明含有psbJ和psbL讀框的1.1kb psbE操縱子mRNA在野生型植物和轉化植物中有相似程度的累積。參見圖5B下面一組。014寡核苷酸探針與psbE操縱子以及嵌合EaadA和Ekan轉錄物中存在的含有ΔpsbF/ΔpsbL區的mRNA均雜交。014探針在轉基因植物中探測到4倍以上的RNA，這表明多順反子psbE mRNA與嵌合mRNA的比率為1∶3。參見圖5B上面一組。用於RNA凝膠分析方法討論如下。
用TRIzol(Gigoco BRL)提取總RNA。在含有1％瓊脂糖的甲醯胺凝膠上進行RNA電泳，並將其轉到尼龍膜(Amersham)上。於45℃在6×SSPE、0.5％SDS、10×Dendardt氏試劑、100mg/ml tRNA、0.1％焦磷酸鈉中與32P末端標記的寡核苷酸探針014雜交。隨機引物法(Boehringer Mannheim)32P標記DNA片段探針的雜交於65℃在快速雜交緩衝液(Amersham)中進行。通過PhosphorImager分析(MolecularDynamics)法定量測定樣本中與所述探針雜交的RNA水平。E．其它mRNA的編輯在轉基因植物中不受影響轉基因植物對psbL編輯需求的增加導致其編輯效率下降。為了證實是否其它mRNA的編輯在轉基因植物中受影響，進行了實驗。在rpoB轉錄物中檢測了兩個位點，並在ndhB轉錄物中也檢測了兩個位點。參見表Ⅲ。
表Ⅲ在野生型和轉基因植物中所檢測的編輯位點一覽表
>a參考文獻Zeltz等，1993b參考文獻Maier等，1992c在菸草中，TCA密碼子被編輯成TTA密碼子。
rpoB編輯位點和ndhB編輯位點最早報導在玉米中發現，本項研究證實它們在菸草中也存在。在野生型菸草中，如圖6所示，rpoB的編輯位點Ⅰ和Ⅱ幾乎完全被編輯，這與在玉米和大麥(Zeltz等，1993)中所觀察到的一樣。類似地，與在玉米中所報導的(Maier等，1992)一樣，在野生型菸草中ndhB轉錄物的位點Ⅰ和位點Ⅱ也完全被編輯，如圖6所示。在表達EaadA和表達Ekan的各自的三個品系植物中檢測相同位點的編輯效率。在野生型和轉化植物之間未發現四個位點中任何一個的編輯效率有明顯的不同。圖6中的數據說明了表達EaadA的其中一個品系Nt-pHC94-1植物的情況。除psbL位點外的任何位點的編輯效率無變化，這表明嵌合基因的表特異性地損害psbL位點的編輯效率。討論以上所述的實施例是質體中有關嵌合mRNA編輯的首次證明。EaadA和Ekan兩者轉錄物的編輯表明，ΔpsbF/ΔpsbL片段的98個核苷酸和101個核苷酸分別足以指導psbL位點的編輯。EaadA mRNA或Ekan mRNA比含有psbL讀框的psbE多順反子信息的累積水平高出大約3倍，導致未編輯psbL轉錄物的水平明顯增高(＞10倍)。未編輯psbL mRNA水平從＜1％增高至大約10％並不具有能在表型水平上檢測出有害後果。所述嵌合nRNA在轉基因植物中也是部分被編輯。
psbL mRNA和嵌合mRNA均為部分編輯，這暗示著共享位點編輯所需的限制性反式作用因子的缺乏。但是，其它四個位點的編輯效率未受影響，這提示所缺乏的因子是psbL轉錄物的編輯所特異性需要的，而非普通編輯機構的組分。因此可以設想葉綠體基因組中的每個編輯位點需要一些它們特有的編輯因子。98個核苷酸ΔpsbF/ΔpsbL片段和其它四個所檢測編輯位點周圍序列所共有的任何明顯序列基元的缺乏支持這個結論。因此，似乎這些位點的編輯可能由它們各自特有的序列和因子來指導。
關於替代缺乏位點特異性因子的另一種可能，還考慮到存在「強」編輯位點和「弱」編輯位點。因此，psbL位點可能是弱位點，且其編輯效率會由於存在過量的嵌合RNA競爭限制性的但為共有的編輯因子而降低；而其它位點可能是未受影響的強位點。根據文獻中與質體中存在位點特異性編輯因子一致的數據，這種解釋被認為似乎是不可能的。在菠菜質體中psbF mRNA通過將C轉變為U進行編輯，將絲氨酸密碼子變成保守的苯丙氨酸密碼子。在菸草的該位置中，在DNA水平已存在苯丙氨酸密碼子。當菸草的psbF基因被修飾成匹配菠菜序列時，雖然相鄰的psbL位點在兩個物種中均被編輯，但異源編輯位點未被編輯(Bock等，1994)。因此似乎菸草缺乏編輯菠菜psbFmRNA的能力，而保留對於兩個物種共有的psbL位點的編輯能力。與位點特異性編輯相一致的另一種情況是rpoB mRNA的位點Ⅳ，雖然該位點附近的序列高度保守，但它在玉米中被編輯，而在大麥中不編輯。有趣的是，同一轉錄物中其它三個位點的編輯在這兩個物種之間是保守的(Zeltz等，1993)。這些觀察結果提示，可能缺乏一個單獨位點的編輯能力，卻不會影響其它位點的編輯能力，這支持質體中的位點特異性編輯。
實施例Ⅱ基於編輯的ΔpsbL/kan和ΔndhD/kan選擇標記基因在質體中，菸草中ACG密碼子編輯為AUG密碼子為psbL轉錄物及ndhD轉錄物創造了翻譯起始密碼子。為鑑別psbL編輯所需的RNA區段，構建含有psbL缺失衍生物的嵌合卡那黴素抗性基因，並在體內體檢測轉基因植物中的編輯。所得數據表明，22個核苷酸的區段足以指導psbL有效編輯，並包括該編輯位點上遊的16個核苷酸和下遊的5個核苷酸。該編輯位點上遊由核苷酸A向核苷酸C的突變完全取消了編輯，而下遊由G向C的突變僅僅是降低了編輯效率。在22nt編輯靶序列中，發現上遊的16個核苷酸與內源psbL轉錄物競爭可耗盡的反式因子。為了檢測起始密碼子的編輯是否涉及一個共同反式因子，在菸草質體中表達了含有ndhD編輯位點的嵌合基因。象psbL一樣，ndhD位點的編輯需要一個可耗盡的反式因子。但是，ndhD的反式因子與psbL編輯所需的反式因子不同。psbL編輯位點和ndhD編輯位點需要不同的順式序列和反式因子，這表明了質體起始密碼子編輯的單獨識別機制。A．詳細說明順式序列指導的psbL編輯如上文所提到的，psbL基因是psbE操縱子的一部分，psbE操縱子含有psbE、psbF、psbL及psbJ的讀框(Carillo等，1986)。在較早的實施例中(Chaudhuri等，1995)，描述了含有一個98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段的嵌合mRNA中psbL翻譯起始密碼子位點的編輯(圖7A，質粒pSC2中-63/+34)。在圖7A的嵌合構建物中，第一個可讀框是含有C端40nt的截短psbF(ΔpsbF)基因。第二個可讀框含有與細菌卡那黴素抗性(kan)基因在翻譯水平相融合的psbLN-端36nt(ΔpsbL)，產生ΔpsbL/kan融合蛋白。這兩個可讀框被22nt的基因間隔區所分開，參見圖7A。
為了鑑別psbL編輯所需的序列，檢測了98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段的缺失衍生物的體外編輯。象前面一樣，將psbL缺失衍生物的N-端與細菌卡那黴素抗性基因(kan)相融合，並克隆進質體Prrn/Trps16表達盒中產生嵌合基因。參見圖7A。這樣，對於所有的構建物，ΔpsbL/kan的翻譯就依賴於psbL的ACG密碼子編輯為AUG密碼子。因此可通過卡那黴素抗性表型檢測編輯情況。唯一例外是含有-2/+34片段(在質粒pSC10中)的嵌合基因，其中ΔpsbL/kan讀框的翻譯起始密碼子由Prrn提供。將psbL缺失衍生物通過與壯觀黴素抗性選擇基因相連接導入菸草質體基因組中(Chaudhuri等，1995)。
上遊缺失系列包括相對於編輯位點(位置0)其5』-末端在核苷酸位置-63、-51、-39、-27、-16、-10及-2處的構建物。下遊缺失系列包括相對於編輯位點，其3』-末端在核苷酸位置+34、+22、+10、+5及+1處的構建物。嵌合mRNA的編輯效率通過直接測序及對PCR擴增cDNA的phosphorimager分析測定。只要所述構建物含有7A和圖B所示的相對於編輯位點的16nt上遊序列和5nt下遊序列，則維持缺失衍生物的編輯。有趣的是，在所述缺失系列中，被編輯的嵌合mRNA的百分比(編輯效率)不是與98nt全長ΔpsbF/ApsbL片段的(約50％-70％)相似，就是幾乎檢測不到(～0％)。卡那黴素抗性的表達也是所有其嵌合mRNA的翻譯依賴於編輯的轉化子中編輯的可靠定性標誌。參見圖7A。例外是用質粒pSC10轉化所獲得的植物，在它們中卡那黴素抗性由包含於Prrn啟動子片段中的翻譯起始密碼子開始表達。缺失衍生物的構建描述於下。
通過用菸草(栽培品種Petif Havana)的細胞總DNA進行PCR擴增，產生psbL缺失衍生物和ndhD基因片段，5』端引物載有NcoⅠ限制性位點，3』端引物載有NheⅠ限制性位點。使用了以下引物對質粒pSC2,023和029；質粒pSC3,023和030；質粒pSC4,023和031；質粒pSC5,023和032；質粒pSC6,024和029；質粒pSC7,25和029；質粒pSC8,026和029；質粒pSC9,027和029；質粒pSC10,028和029；質粒pSC18,027和031；質粒pSC19,027和034；質粒pSC20,033和031；質粒pSC23,037和038。PCR產物用NcoⅠ和NheⅠ限制性酶消化。
為了在kan編碼區的5』端引入合適的限制性位點，從pTNH32(Carrer等，1993)PCR擴增kan，所用的5』端引物(021)載有串聯的NcoⅠ和NheⅠ限制性位點，而3』端引物(022)載有XbaⅠ限制性位點。將PCR產物克隆進用NcoⅠ/XbaⅠ消化的pUC120中產生了質粒pSC1。
嵌合基因的構建過程是將來自菸草psbL基因和ndhD基因(NcoⅠ/NheⅠ片段)的PCR擴增序列在N-端與缺乏起始密碼子的細菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)相融合。然後將嵌合基因克隆到用NcoⅠ/XbaⅠ消化的質粒pLAA24A中(Zoubenko等，1994)。質粒pLAA24A是質體轉化載體pPRV111A的衍生物(基因庫登記號U12812)，具有一個選擇性壯觀黴素抗性基因以及Prrn/Trps16表達盒中的一個uidA報告基因(Zoubenko等，1994)。Prrn的5』-調控區由質體rRNA操縱子啟動子和一個核糖體結合位點組成，並位於SacⅠ/NcoⅠ片段上。Trps16片段包括位於ptDNA中核苷酸5,087至4,939之間的rps16基因3』-調控區(Shinozaki等，1986)，並包含在XbaⅠ/HindⅢ片段中。用NcoⅠ/XbaⅠ限制性酶消化質粒pLAA24A可從表達盒中除去uidA編碼區，然後用嵌合構建物(也是一個NcoⅠ/XbaⅠ片段)取代之。
為了構建以下實施例中的嵌合基因，採用了以下方法。按實施例Ⅰ的描述進行質體轉化和植株再生。也按以上實施例Ⅰ的描述進行PCR擴增和DNA測序。對測序凝膠進行phosphorimager分析(MolecularDynasmics)以定量測定編輯效率。測定了與核苷酸相應的條帶的放射性。相對於相同泳道中其它條帶的樣本，將上樣樣品及標記效率的數值歸一化。mRNA編輯效率(％)=[正確的編輯信號/(正確編輯信號+正確的未編輯信號)]×100。所採用的引物列於如下01: 5』-CAATATCAGCAATGCAGTTCATCC-3』04: 5』-CACGACGAGATCCTCGCCG-3』05: 5』-GAATAGCCTCTCCACCCA-3』06: 5』-GGAATCCTTCCAGTAGTATCGGCC-3』07: 5』-GGAAAATAAAACAGCAAGTAC-3』017: 5』-AATTCGAAGCGCTTGGATACAGTTGTAGGGA-3』018: 5』-GTAAGAGATGTGAATCCGCCTGT-3』019: 5』-GCATAAGTCGTTAGAAGGAG-3』020: 5』-GAAGAAAGAAAATTAAGGAACC-3』021: 5』-CATGCCATGGCTAGCATTGAACAAGATGGATTGCACG-3』022: 5』-GTACTCTAGACCCGCTCAGAAGAACTCG-3』023: 5』-CTAGCCATGGCTTTGGGATCAATATCAGCAATG-3』024: 5』-CTAGCCATGGCATCAGCAATGCAGTTCATCC-3』025: 5』-CTAGCCATGGCGTTCATCCAACGATAAACTTAA-3』026: 5』-CTAGCCATGGCATAAACTTAATCCGAATTATAGAG-3』027: 5』-CTAGCCATGGCCGAATTATAGAGCTACGACAC-3』028: 5』-CTAGCCATGGCTACGACACAATCAAACCCGA-3』029: 5』-CTAGCTAGCTTCAACATTTTGTTCGTTCGG-3』030: 5』-CTAGCTAGCTTCGTTCGGGTTTGATTGTG-3』031: 5』-CTAGCTAGCTGATTGTGTCGTAGCTCTATA-3』032: 5』-CTAGCTAGCCGTAGCTCTATAATTCGGATT-3』033: 5』-CTAGCCATGGTATAGAGCTACGACAC-3』034: 5』-CTAGCTAGCAAGTGTCGTAGCTCTATA-3』035: 5』-AATTATAGAGCTCCGACACAATC-3』036: 5』-AATTATAGAGCTACCACACAATC-3』037: 5』-CTAGCCATGGTATTTTGAGCACGGGTTTTTCTGGTCC-3』038: 5』-CTAGCTAGCTGGAAAAACTACAATTATTGTTAACC-3』B．psbl編輯位點側翼核苷酸的突變將充分編輯的98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段中的被編輯密碼子ACG變為CCG和ACC，以便論述以下問題(1)側翼核苷酸對於編輯是否很重要；(2)當其中一個側翼核苷酸變為C時，是否還保持編輯正確C的保真度；(3)在此位點起始翻譯是否是編輯所需要的，因為將密碼子ACG變為CCG和ACC會消除在被編輯密碼子處起始翻譯的可能性。
上遊核苷酸的突變(ACG變為CCG；NtpSC14系)導致編輯的喪失(～0％)。參見圖8。下遊核苷酸的突變(ACG變為ACC；Nt-pSC15系)允許在正確C處的編輯，但編輯效率明顯下降，為～20％，參見圖8。因此突變分析表明，直接位於被編輯C上遊的殘基A看起來對於編輯是必需的，而下遊殘基G向C的突變與編輯相容，但卻為最佳編輯效率所需的。另外，在突變密碼子ACC中正確C的編輯指出在編輯位點的選擇中的編輯器的高度保真機制。還有，ACC密碼子的編輯提示在此密碼子處的翻譯起始不是編輯所需要的。按照A部分中對ΔpsbL/kan衍生物的描述進行嵌合基因的構建並導入植物。
有一個點突變的psbL衍生物通過大引物PCR方法獲得(Sarker和Sommer,1990)，所用模板為質粒pSC2。也將它們設計為NcoⅠ和NheⅠ片段。所用引物如下對於質粒pSC14，第一步驟為035和029，第二步驟為023；對於質粒pSC15，步驟Ⅰ為036和029，步驟Ⅱ為023。C．與psbL特異性編輯因子(psbL-SEF)相互作用的psbL mRND序列的鑑定在前面的實施例中已闡明，內源psbL轉錄物的編輯效率在表達嵌合psbL mRNA的質體中有所下降。編輯效率的下降可歸咎於98ntΔpsbF/ΔpsbL片段與內源psbL mRNA對存在量有限的位點特異性編輯因子(psbL-SEF)的競爭(Chaudhuri等，1995)。
測定表達嵌合ΔpsbF/ΔpsbL缺失衍生物的質體中psbL的編輯效率(示於圖7)，用來進一步限定與psbL-SEF相互作用的psbL序列。在編輯最低限度所需的22個核苷酸中，只有編輯位點的上遊區段能夠與內源psbL競爭psbL-SEF。22nt psbL編輯識別序列中的16nt psbL-SEF結合位點(框注)在圖9A顯示。位於核苷酸-16/-10之間的序列對於競爭很重要，因為含缺乏這段序列的pSC20構建物的質體中，競爭被消除了，參見圖9B。有趣的是，表達於位置-1A突變為C的pSC14構建物的植物仍保留競爭，雖然這種突變完全消除了編輯。重要構建物的psbL編輯效率數據示於圖9A和9B。雖然在野生型植物中99％以上的psbL mRNA被編輯，但轉基因系中的競爭導致未編輯的psbL轉錄物明顯累積。
D．嵌合mRNA中ndhD起始密碼子的編輯Neckermann等(1994)已經確定了對ndhD和相應cDNA的序列分析，在菸草、菠菜和金魚草中，ndhD的翻譯起始密碼子通過將密碼子ACG編輯為AUG而形成。設計以下實驗的目的在於檢測ndhD的編輯是否象psbL一樣，需要一個可耗盡的反式因子，並檢測這個反式因子是否被用於兩個起始密碼子位點的編輯。為達到目的，將包括ndhD編輯位點在內的89個核苷酸的片段(-48/+40)與kan編輯區在翻譯水平相融合，並將其克隆進Prrn/Trps16表達盒中，參見圖10A和10B。通過把從菸草ndhD基因(NcoⅠ/NheⅠ片段)PCR擴增的序列在N-端與缺少起始密碼子的細菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)相融合，構建嵌合基因。關於該嵌合基因構建過程的詳細描述參見實施例Ⅱ的A部分。將該嵌合基因通過與壯觀黴素抗性基因相連接導入菸草質體基因組。在該嵌合基因中，ΔndhD/kan融合蛋白的表達依賴於ndhD位點的編輯。為防止從上遊的AUG處翻譯，在該編輯位點上遊26nt處引入由A變為C的點突變，如圖10A中下劃線部分所示。
表達ΔndhD/kan蛋白的Nt-pSC23植物對卡那黴素有抗性，這表明ndhD位點被編輯。對ndhD/kan的PCR擴增產物進行的直接測序結果發現編輯效率很低(～7％)，如圖10C所示。野生型植物中的ndhD轉錄物以明顯較高的效率(～45％)被編輯，而在Nt-pSC23植物中編輯效率降至～20％，參見圖10C。轉基因植物中內源ndhD轉錄物編輯效率的下降表明，提高對ndhD編輯的需求導致存在數量有限的編輯因子的耗盡。但是，轉基因Nt-pSC23植物中psbL轉錄物的編輯效率可與野生型的水平相當，為＞99％，如圖10C所示。由於Nt-pSC23植物中psbL的編輯未受影響，所耗盡的編輯因子是ndhD特異性的，並且不是psbL編輯所需要的。
還檢查了表達與98nt ΔpsbF/ΔpsbL片段Nt-pSC2融合的嵌合kan基因的植物中ndhD的編輯，參見圖7。已表明在這種植物中，內源psbL mRNA編輯的下降歸因於psbL-SEF的競爭(Chaudhuri等，1995；圖10C)。但是，在相同植物中內源ndhD的編輯未受影響，參見圖10C，這表明ndhD位點的編輯不涉及psbL-SEF。討論以上實施例描述對質體中mRNA編輯的順式元件需求的分析。數據表明psbL mRNA中C向U的轉變由一個22個核苷酸的序列指導，該序列包括在位置0處被編輯C上遊的16nt和下遊5nt)。這22nt序列在菸草、菠菜(Kudla等，1992)和鐘形辣椒(bell pepper)(Kuntz等，1992)中是保守的，已有關於這些物種中psbL翻譯起始密碼子編輯的報導。
直接在該編輯位點兩側的核苷酸的作用通過在有效編輯的98ntΔpsbF/ΔpsbL片段中使它們發生突變來進行檢測。使在-1位置處上遊的A變為C完全消除了正確C的編輯。但是，在位置+Ⅰ使G變為C卻允許正確C的編輯，儘管效率降低。突變ACC密碼子中正確C的編輯說明編輯的核苷酸選擇的高度保真性。這與所觀察到的特異性核苷酸C在C側翼序列中被編輯的情況相一致(Kossel等，1993；Maier等，1995)。另外，ACC密碼子的編輯提示，編輯的發生並不需要翻譯起始，從而為在翻譯和編輯之間缺乏聯繫提供了直接證據。這個發現與缺少核糖體的質體中的mRNA編輯(Zeltz等，1993)以及不能翻譯的未剪接質體mRNA的編輯(Freyer等，1993)的情況相一致。
psbL翻譯起始密碼子僅僅是在高等植物質體中所發現的大約25個編輯位點之一(Maier等，1995)。需要進行進一步研究以確定順式序列的密切接近對於在質體中所發現的psbL編輯位點有多麼典型。在這方面，ndhD起始密碼子似乎是類似的，因為編輯所需要的全部信息都包括在一個相對小(98nt)的RNA區段中。但是，菸草ndhB基因中位點Ⅱ和位點Ⅲ的編輯(Maier等，1992)需要的序列比150核苷酸更遠(S.C.和P.M.，尚未發表)。因此，順式序列編輯的定位並非一致，與提議的大約25個質體編輯位點中每個均有單獨的識別機制一致。
編輯位點的單獨識別與這種發現相一致即psbL和ndhD靶RNA的過度表達耗盡位點特異性反式因子。儘管兩種轉錄物中ACG編輯為AUG均產生翻譯起始密碼子，但其中一個靶RNA的過度表達隻影向到源mRNA的編輯效率。
如植物線粒體所顯示的(Yu和Schuster,1995)，似乎質體中C向U的編輯涉及到胞苷脫氨作用。因此編輯最低限度地涉及或者是含有位點特異性識別域和脫氨酶域的單個多肽，或者是含有至少兩種組分的複合物，一種組分提供位點特異性識別，而另一種具有胞苷脫氨酶活性。這種由胞苷脫氨酶(APOBEC-1)和輔助蛋白組成的多組分複合物已被闡明參與哺乳類核中載脂蛋白BmRNA的C向U的編輯。除普遍發生的C向U編輯外，編輯位點附近順式序列的緊密群集是質粒psbL和哺乳類核中載脂蛋白B編輯系統所共享的又一特徵。載脂蛋白B的編輯由位於編輯位點下遊4個核苷酸處的11個核苷酸識別序列指導。另外，上遊序列是有效編輯所需的(Innerarity等的綜述，1996)。但是，與psbL的編輯相反，載脂蛋白B編輯過程的識別特異性較松，因為導入到被編輯核苷酸鄰側的胞嘧啶也可以被修飾(Chen等，1990)。
實施例Ⅲ基於編輯的ΔrpL2/kan選擇標記基因通過把從玉米rpl2基因的PCR擴增序列(NcoⅠ/NheⅠ片段；5』引物為CTAGCCATGGAAACGAACTAAAGGAGAATAC-3』；3』引物為5』-CTAGCTAGCCGGGATAGGTGTTTTGTATAAA-3』)在N-端與缺乏起始密碼子的細菌kan基因(NheⅠ/XbaⅠ片段)融合，構建嵌合Δrpl2/kan基因。參見圖11A和11B。然後按ΔpsbL/kan基因的構建所述，將嵌合基因克隆進用NcoⅠ/XbaⅠ消化的質粒pLAA24A(Zoukenko等，1994)中，並將其導入菸草質體基因組中(Chaudhuri和Maliga,1996)。嵌合mRNA在菸草質體中轉錄。在菸草中，未發現玉米rpl2翻譯起始密碼子的編輯。同時轉化植物對卡那黴素也敏感。但是，這種嵌合基因的編輯將會在水稻、玉米以及其它禾穀類中發生，在這些禾穀類中rpl2翻譯起始密碼子通過編輯而產生。
實施例Ⅳ內部編輯位點向編輯的翻譯起始密碼子的轉變在psbL、ndhD和rpl2質體mRNA中，翻譯起始密碼子通過由密碼子ACG轉變為AUG而產生。psbL(Kudla等，1992)及ndhD(Neckermann等，1994)編輯位點存在於少數雙子葉植物種中，而非存在於所有雙子葉植物種中，而rpl2位點卻在大多數但不是所有禾穀類中被編輯(Hoch等，1991)。玉米的rpl2位點在菸草中不被編輯(Chauduri和Maliga，參見實施例Ⅲ)。因此，psbL和ndhD編輯位點對於在一些雙子葉植物中產生基於編輯的標記基因有用，而基於rpl2的嵌合基因在大多數單子葉植物中有用。
對於內部密碼子的編輯有著比翻譯起始密碼子的編輯更多的例子。但是，在psbL序列的鄰近序列中密碼子的編輯不需要翻譯起始(Chaudhuri和Maliga,1996)。基於這些結果，只要編輯產生可翻譯的mRNA，內部密碼子也可以用作翻譯起始密碼子。Ser變為Phe、Ser變為Leu和Pro變為Leu的頻率高，而Thr變為(F)Met的程度較低。假定在第一個核苷酸位置處U和A相對頻繁，那麼既使第一個核苷酸變為A，在大多數編輯鄰近序列中還會保持UCG密碼子的編輯，產生的密碼子可通過C向U轉變而被編輯成翻譯起始密碼子。這種誘變的好的候選者是rpoB mRNA的編輯位點Ⅰ和Ⅱ，在雙子葉和單子葉植物中這兩個位點被廣泛編輯(Zeltz等，1993)。
指導編輯所需的RNA序列可以象psbL基因的情況一樣，包含在與編輯位點相鄰的短區段之中，或象ndhB基因的位點Ⅱ和位點Ⅲ的情況一樣位於較遠的位置(Chaudhuri和Maliga,1996)。在ndhB以及rpoB小基因中已經檢測了編輯情況，以便鑑別對嵌合基因的構建有用的編輯位點。
已鑑別了ndhB和rpoB的編輯位點，與它們相關的順式序列位於一個短區段中。這些短基因區段已被包括在嵌合基因中，在菸草質體中表達，並通過對PCR擴增的轉基因cDNA直接測序來測定編輯。源基因中的編輯位點列於表Ⅳ。ndhB和rpoB小基因衍生物的圖譜示於圖12。
表ⅣndhB和rpoB小基因中的RNA編輯編輯位點密碼編號 密碼子(胺基酸)參考文獻未編輯/已編輯rpoB位點Ⅰ 158aTCG(Ser)變為TTG(Leu) Zeltz等，1993rpoB位點Ⅱ 184 TCA(Ser)變為TTA(Leu) Zeltz等，1993ndhB位點Ⅰ 156 CCA(Pro)變為CTA(Leu) Maier等，1992ndhB位點Ⅱ 196 CAT(His)變為TAT(Tyr) Maier等，1992ndhB位點Ⅲ 204 TCA(Ser)變為TTA(Leu) Maier等，1992ndhB位點Ⅳ 246 CCA(Pro)變為CTA(Leu) Maier等，1992ndhB位點Ⅹ 249 TCT(Ser)變為TTT(Phe) Kossel.H(私人通訊)a在菸草中，TCA密碼子被編輯成TTA密碼子(Chaudhuri等，1995)。
ndhB小基因含有大小為369個核苷酸的ndhB片段(位於質體基因組的核苷酸143,174和144,042之間，Shinozaki等，1986)。它含有一些包括五個編輯位點在內的第一外顯子序列，所述編輯位點命名為位點Ⅰ、位點Ⅱ、位點Ⅲ、位點Ⅳ和位點Ⅹ。位點Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ在玉米、水稻和菸草中被編輯(Maier等，1992)。因此，基於這些位點編輯的標記基因在包括單子葉和雙子葉植物在內的廣範圍作物中將會有用。位點Ⅹ只在菸草中被編輯(Kossel.H.，私人通訊)，因此這個位點對於嵌合標記基因構建的用處較小。
在ndhB小基因中，截短的編碼區在位於Prrn-Trps16盒中的原始讀框中表達。方法是在截短讀框的5』末端引入一個NcoⅠ位點，它包括翻譯起始密碼子(CCATGG)，由此小基因的RNA能夠從包含在表達盒中的翻譯信號開始翻譯。該小基因含有翻譯起始密碼子下遊的DNA序列ATGGCAGCTACT；位於位置5的核苷酸C對應於質體基因組中的核苷酸143,674。另外，在PCR擴增過程中，在截短編碼區的3』末端引入了一個框內終止密碼子。(5』端PCR引物為5』-CTAGCCATGGCAGCTACTCTAGGGGGAATG-3』；3』端PCR引物為5』-CTAGTCTAGACGTATACGTCAGGAGTCCA-3』)。用物理方法將小基因與適合的質體導向載體中的選擇性壯觀黴素抗性基因(aadA)連接，並通過生物發射過程將載體DNA導入菸草葉片葉綠體中。通過在壯觀黴素培養基上培養受轟擊的葉片片段，有所選擇地擴增具有整合連接轉基因的轉質體基因組，轉基因苗可在壯觀黴素培養基上直接再生。質體轉化方案在Svab和Maliga,1993以及Zoubenko等，1994的文章中已有所描述。
在五個位點之中，位點Ⅰ、Ⅳ和Ⅹ在小基因中高度編輯。這個發現表明，編輯所需的順式序列位於與編輯位點相對較近的位置，這就象所描述的psbL翻譯起始密碼子的情況一樣(Chaudhuri和Maliga,1996)。另外，位點Ⅰ和位點Ⅳ的順式序列適合於包含在標記基因中用於雙子葉和單子葉植物，因為這些廣泛分化的分類群體中存在著編輯能力。有趣的是，ndhB的位點Ⅰ和位點Ⅲ未在小基因中編輯，這表明編輯所需的順式序列距該編輯位點+/-150核苷酸以上。因此，編輯所需的順式序列相對於編輯位點的定位並不是一致的。
rpoB小基因含有rpoB基因的一個281核苷酸片段，編碼RNA聚合酶的β-亞基。該片段含有兩個編輯位點(位點Ⅰ和位點Ⅱ，參見表Ⅳ和圖12；基於Zeltz等，1993)。兩個位點均存在於玉米、水稻、大麥、菠菜和菸草中(Maier等，1992)。按所描述用於ndhB小基因的方法構建rpoB小基因並將其導入質體中。該小基因含有位於翻譯起始密碼子下遊的DNA序列ATGGTCCCGGT；位置4的核苷酸G對應於質體基因組中核苷酸27120的互補物(Zhinozaki等，1986)。構建小基因的rpoB片段通過PCR擴增獲得(5』端PCR引物為5』-CTAGCCATGGGTCCCGGTATTTATTACCG-3』；3』端PCR引物為5』-CTAGGTCGACTTAGGCATTTTCTTTTGACCCAAT-3』)。獲得了代表幾個獨立轉化系的轉基因植物並分析其編輯情況。通過對PCR擴增的CDNA測序，發現在小基因中兩個位點被完全編輯。已知這些位點在單子葉和雙子葉植物中都存在，以這些位點中任何一個的編輯為基礎的標記基因應該能夠應用於種類繁多的作物中。
實施例Ⅴ用於外源基因表達的組織特異性調節的RNA編輯討論了質體中RNA編輯，假定編輯是組成型的，並且在所有組織類型中均促進標記基因的表達。但是，人們已知環境和發育條件明顯影響編輯效率(Bock等，1993；Hirose等，1996)。編輯效率的組織特異性差異有利於嵌合基因的設計，嵌合基因的翻譯依賴於組織類型，因為ACG密碼子轉變為翻譯起始密碼子是組織特異性的。當希望一個有經濟價值的蛋白(例如殺昆蟲內毒素)僅僅在特定的組織類型(如葉片、根毛、根皮或表皮細胞)中累積時，這樣的嵌合基因有用途。
或者，所期望的有經濟價值基因的組織特異性表達可以在組織特異性編輯產生一個翻譯終止密碼子時獲得。通過編輯形成終止密碼子的簡易方法是質體中的工程化操作。例如，在改變psbL編輯位點的讀框時在質體中產生終止密碼子。通常，psbL翻譯起始密碼子可通過將ACGA序列中的C轉變為U而產生。將讀框移動一個核苷酸，通過編輯就可以產生TGA終止密碼子。密碼子中第一個核苷酸C的編輯也有所知，如ndhB轉錄物的位點Ⅱ(Maier等，1992)。因此，CAA密碼子中C向U的編輯將產生TAA翻譯終止密碼子。
大多數質體基因以多順反子轉錄單位構成。因此，可建立多順反子轉錄單位用於多個蛋白的同時表達。一個雙順反子轉錄單位(由此同時表達兩種蛋白質)的例子是通過工程化操作質體基因組而獲得(Staub和Maliga,1995)。可通過使翻譯依賴於RNA編輯、或者產生翻譯起始密碼子，或者終止翻譯的途徑，獲得這種多順反子mRNA的組織特異性表達。參考文獻1．Araya,A.,Domec,C,Begu,D和Litvak,J.(1992)用小麥線粒體提取物進行ATP合酶亞基mRNA編輯的體外系統。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,1040-1044。
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雖然以上描述並具體列舉了一些本發明的優選實施方案，但目的並不在於將本發明局限在這些實施方案上。可進行各種修改，而不偏離如以下權利要求中所提出本發明範圍和精神。
權利要求
1．適用於篩選質體轉化子的重組嵌合DNA構建物，它含有與選擇標記基因的編輯區在翻譯水平相融合的被編輯的質體基因區段，所述選擇標記基因在所述質體基因區段的RNA編輯之後可表達。
2．包含權利要求1的構建物的載體，它含有質體定向轉化所必需的同源DNA序列。
3．權利要求1的DNA構建物，其中所述的被編輯質體基因區段選自psbL、ndhD、rpoB、ndhB或rpl2。
4．權利要求1中的DNA構建物，其中所述的選擇標記基因選自kan基因、aaaD基因或任何其它如表Ⅰ所列的選擇標記基因。
5．權利要求1的嵌合DNA構建物，包括ΔpsbL/kan。
6．權利要求1的嵌合DNA構建物，包括ΔpsbL/aadA。
7．權利要求1的嵌合DNA構建物，包括ΔndhD/kan。
8．權利要求1的嵌合DNA構建物，包括Δrpl2/kan。
9．嵌合DNA構建物，包含在選擇標記基因上遊克隆的、選自ndhB位點Ⅰ、Ⅳ或Ⅴ的編輯區段。
10．嵌合DNA構建物，包含在選擇標記基因上遊克隆的、選自rpoB位點Ⅰ或Ⅱ的編輯區段。
11．篩選轉質體基因組系的方法，包括a)用含有與選擇標記基因編碼區在翻譯水平融合的被編輯基因區段的DNA構建物在樣品中轉化質體，所述選擇標記基因在所述基因區段的RNA編輯之後可表達；b)在含有可促進轉化質體鑑別的篩選劑的培養基中培養所述樣品；c)篩選並繁殖表達所述選擇標記的細胞；並d)從表達所述選擇標記的所述細胞再生植株。
12．權利要求11的方法，其中將所述嵌合DNA構建物加入含有質體定向轉化所必需的同源DNA序列的載體中。
13．權利要求12的方法，其中所述載體還包括有益增強所述再生植物表型的外源目的基因。
14．權利要求13的方法，其中所述編輯區段以組織特異性方式被編輯，使得所述外源目的基因以組織特異性方式表達。
15．權利要求13的方法，應用於雙子葉或單子葉植物。
全文摘要
公開了在高等植物中篩選質體轉化子的DNA構建物。也公開了基於編輯的選擇標記基因,它們需要在轉錄水平上進行編輯以表達選擇標記基因。包含這種與選擇標記基因操作性相連的被編輯上遊序列,促進高等植物中質體轉化子的分離而非核轉化子的分離。
文檔編號C07K14/415GK1231702SQ97197144
公開日1999年10月13日 申請日期1997年6月13日 優先權日1996年6月14日
發明者P·馬利加, H·卡雷爾, S·肖杜裡 申請人:新澤西州州立大學(拉特格斯)