一種北纈草組織培養繁殖方法

2023-09-22 02:58:15

一種北纈草組織培養繁殖方法
【專利摘要】本發明旨在提供一種北纈草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養繁殖方法。具體如下：一、用北纈草幼嫩的莖段作外植體，進行無菌處理；二、取無菌的北纈草的莖段置於固體培養基上誘導出不定芽；三、誘導出的不定芽接種到固體培養基上進行生根和壯苗；四、組培苗移栽至培養基質中煉苗培育。本發明不受自然條件的限制和影響，具有快速和易規模化的特點。本發明可以緩解野生北纈草資源緊缺和過度採挖破壞生態平衡的問題。
【專利說明】一種北織草組織培養繁殖方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於植物組織培養繁殖【技術領域】，具體地，涉及敗醬科纈草屬藥用植物北繳草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養繁殖方法。

【背景技術】
[0002]北糹顏草(Valerianafauriei Briq.)為敗醬科 Valerianaceae 糹顏草屬(Valeriana)野生多年生草本植物。纈草性平味辛，具有鎮靜安神、解痙止痛的功效，根莖被作為鎮靜藥應用已有上千年。北纈草為纈草屬植物中的代表，分布於東北地區(黑龍江、吉林、遼寧)和華東地區(江蘇、安徽、浙江、江西、臺灣)，並西向河南、陝西等地延伸。北纈草生於海拔2000m以下的山坡草甸、林間溼地、林緣路旁。目前，北纈草的藥理作用、化學成分已得到不同程度的研究。有關北纈草專利產品的報導日益增多，該植物的藥用價值已受到高度重視。我國大興安嶺地區野生北纈草資源較豐富，但過度開發利用對資源及環境造成破壞。而目前我國對於北纈草資源保護的研究尚處於起步階段，僅少量研究報導。
[0003]在我國，對於北纈草的獲取主要還是依賴於野生北纈草資源。然而，野生北纈草種子多數不育，自然發芽率較低，人工變溫處理催芽，發芽率最高僅為50%。此外北纈草種子細小，人工收集費時費力，且大田栽培生產周期較長，佔用耕地，易受氣候、病蟲害的影響。利用根莖移栽雖成活率高，但繁殖係數低，在大規模栽培種不適用。利用生物技術進行中藥資源快速繁殖並實現大規模生產已成為一個新的發展方向。目前，對於纈草屬植物的組培研究還很少，有利用子葉無菌條件下誘導芽簇的報導，同時，僅從V.0fficinalis葉片中誘導獲得不定根，還未有對北纈草進行快速繁殖的研究報導。


【發明內容】

[0004]本發明旨在緩解野生北纈草資源緊缺和過度採挖破壞生態平衡的問題，提供一種北纈草組織培養繁殖方法。該方法能加快北纈草的繁殖速度，有利於擴大生產規模。
[0005]本發明的目的是通過以下技術措施來實現的:一種北繳草(Valeriana faurieiBriq.)組織培養繁殖方法，包括以下步驟:
[0006](I)外植體誘導:取北纈草幼嫩的莖段作為外植體，進行無菌處理，接種於啟動培養基培養至獲得不定芽；
[0007](2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種至增殖培養基上進行增殖；
[0008](3)生根培養:將步驟(2)所得不定芽在無菌條件下分離並接種至生根培養基中進行根誘導和壯苗，得到完整的組培苗；
[0009](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養5?10天，再全開蓋培養5?10天；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1:1?1:3的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；
[0010]其中，步驟(I)中啟動培養基為0.2?1.0mg/L 6_ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基；
[0011]其中，步驟(2)中增殖培養基為0.2?1.0mg/L 6_BA、0.0l?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基；
[0012]其中，步驟(3)中培養基為0.1?0.5mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS
培養基。
[0013]優選地，上述方法還包括步驟(I)中外植體除菌處理的方法為:用自來水衝洗15?25min，用60?80%乙醇消毒30?90s，用0.5?1.5%次氯酸鈉溶液消毒10?20min後取出，用無菌水衝洗3?5次，用滅菌後的濾紙吸乾表面水分，得到無菌北纈草外植體。
[0014]優選地，上述方法還包括步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養條件:2?5%蔗糖、0.5?2%瓊脂，pH5?6，培養溫度為20?30°C，光照時間12?20h.(Γ，光照2500?40001ux。
[0015]更優選地，上述方法還包括步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養條件:3?4%蔗糖、0.5?1%瓊脂，ρΗ5.5?6，培養溫度為24?26 °C，光照時間15?18h.d—1，光照30001ux。
[0016]更優選地，一種北纈草的組織培養繁殖方法，包括以下步驟:
[0017](I)外植體誘導:將幼嫩的莖段用自來水衝洗20min,用70%乙醇消毒Imin,用I %次氯酸鈉溶液消毒15min後取出，用無菌水衝洗3?5次，接種於培養基上培養，置於光照30001ux，光照時間16h.cf1，溫度為25±1°C下培養；
[0018](2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種在增殖培養基上進行增殖，得到繼代增殖的叢生芽；
[0019](3)生根培養:將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離並接種至生根培養基中進行根誘導和壯苗，得到完整的組培苗；
[0020](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養I周，再全開蓋培養I周；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1:1的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養期間注意保持生長環境溼度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0021]其中，步驟(I)中啟動培養基為1.0mg/L 6_BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基或0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基或 0.2mg/L 6-ΒΑ、0.0lmg/L IBA 和 8g/L 瓊脂的 pH 為 5.8 的 MS 培養基；
[0022]其中，步驟(2)中增殖培養基為1.0mg/L 6_BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基；
[0023]其中，步驟(3)中培養基為0.lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養基;
[0024]其中，步驟(I)、步驟⑵與步驟(3)中培養基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH5.8，培養溫度為(25±1)°C，光照時間16h.cf1，光照30001ux。
[0025]本發明的優點:本發明利用組織培養方法得到完整的北纈草組培苗，其具有成本低、繁殖速度快的特點。發明中所用培養器皿均為塑料或玻璃製品，可重複回收利用，衛生環保；發明成本低，僅用MS培養基及植物激素即可；北纈草不定芽誘導僅用2周，繼代增殖速度快，4周即可獲得叢生芽，增殖3倍，生根培養容易，僅用2周即可得到粗壯的根系；發明體系穩定，不定芽誘導率高，苗成活率高。同時本發明的方法不佔用耕地，不受自然條件的限制和約束，易規模化。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1所示為北纈草外植體照片。
[0027]圖2所示為北纈草不定芽誘導培養2周後照片。
[0028]圖3所示為北纈草不定芽誘導培養3周後照片。
[0029]圖4所示為北纈草不定芽誘導培養4周後照片。
[0030]圖5所示為北纈草不定芽繼代增殖培養4周後照片。
[0031]圖6所示為北纈草芽生根培養2周後照片。
[0032]圖7所示為北纈草組培苗半開蓋培養照片。
[0033]圖8所示為北纈草組培苗全開蓋培養照片。
[0034]圖9所示為北纈草組培苗移栽培養4周後照片。
[0035]圖10所示為北纈草組織培養情況。

【具體實施方式】
[0036]下面結合具體的實施例對本發明作進一步說明，而並非對發明的限定，依照本領域公知的現有技術，本發明的實施方式並不限於此，因此凡依照本公開內容所做出的本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。
[0037]實施例1
[0038]1.材料:
[0039]試驗材料即組織培養外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0040]2.實驗步驟:
[0041](I)外植體誘導:將幼嫩的莖段用自來水衝洗20min,用70%乙醇消毒Imin,用
I%次氯酸鈉溶液消毒15min後取出，用無菌水衝洗4次，接種於1.0mg/L 6_BA、0.02mg/LIBA的MS培養基上培養，培養基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養溫度為25°C，光照時間 16h.(Γ1,光照 30001ux ；
[0042](2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種於1.0mg/L6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養基上進行增殖實驗，得到繼代增殖的叢生芽，培養基加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養溫度為25°C，光照時間16h.d \ 光照 30001ux ；
[0043](3)生根培養:將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離並接種至0.0lmg/L IBA的生根培養基中進行根誘導和壯苗，培養基加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養溫度為25°C，光照時間16h.cf1，光照30001ux，得到完整的組培苗；
[0044](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養I周，再全開蓋培養I周；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1:1的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養期間注意保持生長環境溼度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0045]3.實驗結果:
[0046](I)外植體誘導實驗結果
[0047]以莖段為外植體(圖1)，在1.0mg/L 6_ΒΑ、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基中培養I周后，組織開始膨脹，狀態良好，出現芽分化跡象；培養2周後(圖2)，就有小芽從生長點長出，生長狀態良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個不定芽；培養3周後，芽可生長至lcm(圖3);培養4周後,芽已生長至3-4cm(圖4)。
[0048]上述結果表明利用北纈草外植體進行不定芽誘導，誘導率高，培養時間短，不定芽生長狀態良好，具有很好的可行性。
[0049](2)繼代增殖培養實驗結果
[0050]在1.0mg/L 6-ΒΑ,Ο.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基中，不定芽生長狀況良好，培養I周后，小芽明顯增大；培養2周後，就有小芽從生長點長出；培養4周後即可得到生長旺盛的叢生芽(圖5)，增殖倍數為3倍。
[0051 ] 上述結果表明，利用北纈草不定芽進行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態保持良好，體系穩定，具有良好的可行性。
[0052](3)生根培養實驗結果
[0053]在0.0lmg/L IBA的生根培養基中培養I周后就有根長出，培養2周後(圖7)根長度可達3cm，且生長旺盛。
[0054]上述結果表明，利用北纈草不定芽進行生根誘導，生根速度快，僅2周即可獲得粗壯的根系，體系穩定，具有良好的可行性。
[0055]實施例2
[0056]1.材料:
[0057]試驗材料即組織培養外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0058]2.實驗步驟:
[0059](I)外植體誘導:將幼嫩的莖段用自來水衝洗15min，用60%乙醇消毒30s，用
0.5%次氯酸鈉溶液消毒1min後取出，用無菌水衝洗3次，接種於0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA的MS培養基上培養，培養基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養溫度為20°C，光照時間12h.cf1，光照25001ux ；
[0060](2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種於0.5mg/L6-BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養基上進行增殖實驗，得到繼代增殖的叢生芽，培養基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養溫度為20°C，光照時間12h.cf1，光照 2500Iux ；
[0061](3)生根培養:將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離並接種至0.0lmg/L IBA的生根培養基中進行根誘導和壯苗，培養基均加入2%蔗糖、0.5%瓊脂，pH 5.0，培養溫度為20°C，光照時間12h.cf1，光照25001ux，得到完整的組培苗；
[0062](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養5天，再全開蓋培養5天；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1:1的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養期間注意保持生長環境溼度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0063]3.實驗結果:
[0064](I)外植體誘導實驗結果
[0065]以莖段為外植體，在0.5mg/L6-BA、0.0lmg/LIBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基中培養I周后，組織開始膨脹，狀態良好，出現芽分化跡象；培養2周後，就有小芽從生長點長出，生長狀態良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個不定芽；培養3周後，芽可生長至Icm ;培養4周後,芽已生長至3_4cm。
[0066]上述結果表明利用北纈草外植體進行不定芽誘導，誘導率高，培養時間短，不定芽生長狀態良好，具有很好的可行性。
[0067](2)繼代增殖培養實驗結果
[0068]在0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基中，不定芽生長狀況良好，培養I周后，小芽明顯增大；培養2周後，就有小芽從生長點長出；培養4周後即可得到生長旺盛的叢生芽，增殖倍數為3倍。
[0069]上述結果表明，利用北纈草不定芽進行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態保持良好，體系穩定，具有良好的可行性。
[0070](3)生根培養實驗結果
[0071]在0.0lmg/L IBA的生根培養基中培養I周后就有根長出，培養2周後根長度可達3cm,且生長旺盛。
[0072]上述結果表明，利用北纈草不定芽進行生根誘導，生根速度快，僅2周即可獲得粗壯的根系，體系穩定，具有良好的可行性。
[0073]實施例3
[0074]1.材料:
[0075]試驗材料即組織培養外植體為北纈草植株幼嫩的莖段。
[0076]2.實驗步驟:
[0077](I)外植體誘導:將幼嫩的莖段用自來水衝洗25min，用80%乙醇消毒90s，用
1.5%次氯酸鈉溶液消毒20min後取出，用無菌水衝洗5次，接種於0.2mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA的MS培養基上培養，培養基均加入5%蔗糖、2%瓊脂，pH 6，培養溫度為30°C，光照時間 20h.cf1，光照 4000Iux ；
[0078](2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種於0.2mg/L6-BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS增殖培養基上進行增殖實驗，得到繼代增殖的叢生芽，培養基均加入5 %蔗糖、2 %瓊脂，pH 6，培養溫度為300C，光照時間20h.cf1，光照 4000Iux ；
[0079](3)生根培養:將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離並接種至0.5mg/L IBA的生根培養基中進行根誘導和壯苗，培養基均加入5%蔗糖、2%瓊脂，pH 6，培養溫度為30°C，光照時間20h.cf1，光照40001ux，得到完整的組培苗；
[0080](4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養10天，再全開蓋培養10天；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1: 3的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養期間注意保持生長環境溼度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ;
[0081]3.實驗結果:
[0082](I)外植體誘導實驗結果
[0083]以莖段為外植體，在0.2mg/L 6-ΒΑ,Ο.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為8的MS培養基中培養I周后，組織開始膨脹，狀態良好，出現芽分化跡象；培養2周後，就有小芽從生長點長出，生長狀態良好，生長旺盛，每段外植體可以長2個不定芽；培養3周後，芽可生長至Icm ;培養4周後,芽已生長至3_4cm。
[0084]上述結果表明利用北纈草外植體進行不定芽誘導，誘導率高，培養時間短，不定芽生長狀態良好，具有很好的可行性。
[0085](2)繼代增殖培養實驗結果
[0086]在0.2mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基中，不定芽生長狀況良好，培養I周后，小芽明顯增大；培養2周後，就有小芽從生長點長出；培養4周後即可得到生長旺盛的叢生芽，增殖倍數為3倍。
[0087]上述結果表明，利用北纈草不定芽進行繼代增殖，增殖速度快，僅4周可增殖3倍，不定芽狀態保持良好，體系穩定，具有良好的可行性。
[0088](3)生根培養實驗結果
[0089]在0.5mg/L IBA的生根培養基中培養2周後就有根長出，培養4周後根長度可達4cm,且生長旺盛。
[0090]上述結果表明，利用北纈草不定芽進行生根誘導，生根速度快，僅4周即可獲得粗壯的根系，體系穩定，具有良好的可行性。
【權利要求】
1.一種北繳草(Valeriana fauriei Briq.)組織培養繁殖方法,其特徵在於,包括以下步驟: (1)外植體誘導:取北纈草幼嫩的莖段作為外植體，進行無菌處理，接種於啟動培養基培養至獲得不定芽； (2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種至增殖培養基上進行增殖； (3)生根培養:將步驟(2)所得不定芽在無菌條件下分離並接種至生根培養基中進行根誘導和壯苗，得到完整的組培苗； (4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養5?10天，再全開蓋培養5?10天；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按1:1?1:3的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗； 其中，步驟(I)中啟動培養基為0.2?1.0mg/L 6-ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基； 其中，步驟(2)中增殖培養基為0.2?1.0mg/L 6_ΒΑ、0.01?0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基； 其中，步驟⑶中培養基為0.1?0.5mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養基。
2.如權利要求1所述北纈草組織培養繁殖的方法，其特徵在於步驟(I)所述對外植體進行除菌處理的方法為:用自來水衝洗15?25min,用60?80%乙醇消毒30?90s,用.0.5?1.5%次氯酸鈉溶液消毒10?20min後取出，用無菌水衝洗3?5次,用滅菌後的濾紙吸乾表面水分，得到無菌北纈草外植體。
3.如權利要求1所述北纈草的組織培養繁殖的方法，其特徵在於步驟(I)、步驟(2)與步驟⑶中培養條件'2?5%蔗糖、0.5?2%瓊脂，pH5?6，培養溫度為20?30°C，光照時間 12 ?20h.cf1，光照 2500 ?40001ux。
4.如權利要求1所述培養條件，其特徵在於:3?4%蔗糖、0.5?1%瓊脂，pH5.5?.6，培養溫度為24?26°C，光照時間15?18h.cf1，光照30001ux。
5.如權利要求1所述北纈草組織培養繁殖的方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)外植體誘導:將幼嫩的莖段用自來水衝洗20min，用70%乙醇消毒lmin，用1%次氯酸鈉溶液消毒15min後取出，用無菌水衝洗4次，接種於培養基上培養，置於光照.30001ux，光照時間16h.d-1，溫度為25±1°C下培養； (2)繼代增殖培養:將步驟(I)中形成的不定芽在無菌條件下切下，接種在增殖培養基上進行增殖實驗，得到繼代增殖的叢生芽； (3)生根培養:將步驟(2)所得叢生芽在無菌條件下分離並接種至生根培養基中進行根誘導和壯苗，得到完整的組培苗； (4)組培苗移栽:將步驟(3)中的健壯的組培苗加入少量無菌水，半開蓋培養I周，再全開蓋培養I周；將組培苗從培養瓶中取出，洗淨根部培養基，栽入由蛭石和營養土按I: I的比例混合成的培養基質中煉苗培育成健壯的幼苗；移栽培養期間注意保持生長環境溼度、適度遮陰、保溫；生長適溫22?28°C，夜溫20?22°C ; 其中，步驟(I)中啟動培養基為1.0mg/L 6-ΒΑ,Ο.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為.5.8的MS培養基或0.5mg/L 6_BA、0.0lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基或.0.2mg/L 6-ΒΑ、0.0lmg/L IBA 和 8g/L 瓊脂的 pH 為 5.8 的 MS 培養基； 其中，步驟(2)中增殖培養基為1.0mg/L 6-BA、0.02mg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的MS培養基； 其中，步驟⑶中培養基為0.lmg/L IBA和8g/L瓊脂的pH為5.8的1/2MS培養基；其中，步驟(I)、步驟(2)與步驟(3)中培養基均加入3%蔗糖、0.8%瓊脂，pH 5.8，培養溫度為(25±1)°C，光照時間16h.cf1，光照30001uX。
【文檔編號】A01H4/00GK104304004SQ201410482874
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月22日 優先權日:2014年9月22日
【發明者】張鑫, 宋經元, 辛天怡, 陳士林 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所