一種利用中國紅豆杉細胞生產紫杉烷類的方法

2023-09-22 15:35:25 1

專利名稱：一種利用中國紅豆杉細胞生產紫杉烷類的方法
技術領域：
本發明涉及紫杉烷的生產方法，具體地說涉及用植物細胞培養技術生產紫杉烷的方法。
雲南紫杉烷(Taxuyunnanine C,Tc)與紫杉醇同屬於三環二萜類化合物，文獻(1994)Taxanes from Taxus chinensis.Phytochemistry.38:667-670.報導了該化合物，其結構式如下 紫杉烷Tc(簡稱Tc)被推測是紫杉醇生物合成途徑中的中間代謝物，它們可以作為合成紫杉醇或其它有用物質的前體，其本身的藥用價值也正在研究和開發之中(王紅強博士論文，華東理工大學，1998)。利用紅豆杉細胞培養高產紫杉烷作為化學半合成紫杉醇的前體具有潛在的商業生產價值。
自從紫杉醇的臨床抗癌活性被發現以來，紫杉醇以及相關的紫杉烷類化合物受到人們越來越多的關注。到目前為止，已分離得到一百多種紫杉烷，並發現一些紫杉烷類具有和紫杉醇相似的活性。美國食品及藥物管理局(FDA)於1992年底正式批准紫杉醇可用於治療晚期卵巢癌患者。到目前為止，已有十多個國家批准紫杉醇可用於癌症的治療。但是，全世界紫杉屬植物資源很有限，而對其的需求量極大。據估計，全世界每年需要500kg的紫杉醇才能滿足廣大癌症患者的需求。若光從樹皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200萬棵左右的大樹。即使按全世界每年需要50kg紫杉醇計算，全世界紅豆杉屬植物也僅夠砍伐10-15年。如此大量砍伐將對紅豆杉屬植物的長期存留和地區分布帶來嚴重的威脅，造成生物多樣性和生態環境的極大破壞和無法彌補的損失。所以，研究紫杉醇的其它來源已成為當務之急。同人工栽培紅豆杉屬植株或化學全合成紫杉醇等方法相比，專利Japan Patent WO 95/14103、US Patent 5407816等報導的細胞培養法生產紫杉烷類物質由於生產周期短、勞動力省、成本低以及受外部環境影響小等優點通常被認為是一種比較有效的方法。但是用植物細胞培養技術生產紫杉醇目前仍然存在生產效率低的問題，達不到工業化生產的要求。誘導劑由於其具有的能夠刺激植物細胞次級代謝的能力而被用來進一步提高植物細胞的生產能力，文獻(1996)Methyl jasmonate-induced overproduction of paclitaxel and baccatin Ⅲ inTaxus cell suspension cultures.Nat.Biotechnol.14:1129-1132.和(1999)The kineticsoftaxoid accumulationin cell suspension cultures of Taxus following elicitation withmethyl jasmonate.Biotechnol.Bioeng.62:97-105.報導了茉莉酮酸類物質能夠促進紫杉烷類物質的產生。但是利用誘導法來提高雲南紫杉烷(Tc)生產能力的研究還未見報導。
本發明的目的在於提供一種利用中國紅豆杉細胞(Taxus chinensis)的懸浮培養，通過誘導劑的誘導和補糖添加組合起來的生產雲南紫杉烷(Tc)的新方法，十分顯著地提高了Tc的生產效率，克服了現有技術的缺陷。
實現本發明的技術方案包括如下步驟(1)中國紅豆杉細胞的培養將從植株幼莖外植體誘導愈傷組織中分離獲得的中國紅豆杉(T.chinensis)細胞，移入液體培養基中採用常規的方法進行繼代培養，該製備過程為一現有技術，在文獻(1997)Enhanced production oftaxol in suspension cultures of Taxuschinensis by controlling inoculum size.19:353-355.文獻中對該過程已有詳細的描述；培養基採用該文獻公開的Murashige-Skoog(MS)培養基，另添加0.1-1.0mg/L6-苄基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗壞血酸及10-50g/L蔗糖。每隔14天傳代一次，培養使用旋轉式搖床，轉速為60-200rpm，培養溫度20-30℃，暗培養，接種量為20-200g/L溼重。
(2)Tc的生產將步驟(1)所獲得的中國紅豆杉溼細胞置於含上述培養基的搖瓶中暗培養(接種量為20-200g/L溼重)，旋轉式搖床轉速為60-200rpm，溫度20-30℃，培養周期為12-25天，從所獲得的培養物中採用常規的方法收集Tc,Tc生產率最高可達30.2mg/(L·d)，最高產量可達538.9mg/L。
在搖瓶培養過程中可利用誘導劑進行誘導，在培養前期細胞快速生長階段，添加誘導劑二氫甲基茉莉酮酸酯(HMJA)或甲基茉莉酮酸酯(MJA)至培養基中誘導劑的最終濃度為1-1000μM；在添加誘導劑的同時進行補糖，補加量為10-30g/L；所說的糖為蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖等。
(3)Tc的測定方法稱取100mg幹細胞，磨成細粉，加入2mL甲醇浸泡3天，離心後取上清液揮幹，加入二氯甲烷和蒸餾水各2mL，充分震蕩混合後靜置數分鐘，離心取下層二氯甲烷相，揮幹，加入1mL HPLC級甲醇溶解，用於Tc高效液相色譜分析。採用配有Waters 486紫外檢測儀的Waters 510(英國)型高效液相色譜儀，檢測波長為227nm。採用美國Whatman公司生產的五氟苯矽烷柱(PFP)。流動相為己腈∶水=42∶58，流速為1mL/min。每次進樣量為20μL，進樣前樣品用10000rpm離心取除固體雜質。
由上述公開的技術方案可見，本發明同時利用誘導和補料來促進細胞的生產能力，獲得的Tc產量大大超過目前文獻報導的最高值，Tc生產率最高可達30.2mg/(L·d)，最高產量可達538.9mg/L，是一種很有工業應用前景的Tc的生產方法。
以下將通過實施例對本發明的有關內容作進一步的說明。
實施例1採用從植株幼莖外植體誘導愈傷組織得到的中國紅豆杉細胞。250mL搖瓶培養，採用MS培養基，另添加0.5mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.2mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸，0.2mg/L萘乙酸，100mg/L抗壞血酸及30g/L蔗糖。
將真空過濾得到的5g溼細胞接種到含有50mL上述培養基的搖瓶中，旋轉式搖床轉速110rpm,25℃培養。第9天添加MJA至最終濃度為100μM，繼續培養至21天結束髮酵，收穫細胞並在40℃乾燥。細胞密度在第12天達到最高(乾重19.2g/L)，產率為1.0g/(L·d)。另外，幹細胞還要進行Tc的分析測定，計算得到結果見下表(*代表最大值)。
實施例2培養條件同實例1，在第7天添加MJA至100μM，繼續培養至21天結束髮酵。細胞密度在第12天達到最高(乾重19.2g/L)，產率為1.0g/(L·d)。Tc的生產能力見下表。
實施例3培養條件同實例1，在第7天添加MJA至500μM，繼續培養至21天結束髮酵。細胞密度在第12天達到最高(乾重11.1g/L)，產率為0.4g/(L·d)。Tc的生產能力見下表。
實施例4培養條件同實例1。第一組作為對照；第二組在第7天添加MJA至100μM；第三組在第7天同時添加MJA至100μM，並且同時添加蔗糖20g/L，繼續培養至21天結束髮酵，細胞密度在第18天達到最高(乾重23.6g/L)，產率為0.89g/(L·d)。各組的Tc生產能力見下表。
第一組(對照)
第二組(誘導)
第三組(同時誘導和補糖)
權利要求
1．一種利用中國紅豆杉細胞生產紫杉烷類的方法，包括從植株幼莖外植體誘導的愈傷組織中分離獲得中國紅豆杉細胞，其特徵在於還包括如下步驟(1)將中國紅豆杉細胞移入液體培養基中採用常規的方法進行繼代培養；(2)然後將所獲得的中國紅豆杉溼細胞置於含培養基的搖瓶中暗培養，培養周期為12-25天，從所獲得的培養物中採用常規的方法收集雲南紫杉烷；在搖瓶培養前期細胞快速生長階段，添加誘導劑二氫甲基茉莉酮酸酯或甲基茉莉酮酸酯至培養基中誘導劑的最終濃度為1-1000μM。
2．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，在添加誘導劑的同時進行補糖，補加量為10-30g/L；所說的糖為蔗糖、葡萄糖、果糖或乳糖中的一種。
3．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，中國紅豆杉細胞的培養和溼細胞的搖瓶暗培養均採用Murashige-Skoog培養基，並添加0.1-1.0mg/L 6-苄基腺嘌呤，0.05-0.5mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，0.05-0.5mg/L萘乙酸，20-500mg/L抗壞血酸和10-50g/L蔗糖。
4．如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的糖為蔗糖。
5．如權利要求1所述的方法，其特徵在於，中國紅豆杉溼細胞搖瓶中暗培養時，接種量為20-200g/L溼重，溫度為20-30℃。
全文摘要
本發明提供了一種利用中國紅豆杉細胞生產紫杉烷類的方法。本發明利用中國紅豆杉細胞(Taxus chinensis)的懸浮培養,通過誘導劑的誘導與補糖添加的組合,十分顯著地提高了雲南紫杉烷(Tc)的生產效率,獲得的Tc產量大大超過目前文獻報導的最高值,Tc生產率最高可達30.2mg/(L·d),最高產量可達538.9mg/L,是一種很有工業應用前景的Tc的生產方法。
文檔編號C12P7/12GK1288953SQ0012530
公開日2001年3月28日 申請日期2000年9月21日 優先權日2000年9月21日
發明者鍾建江, 董浩迪 申請人:華東理工大學