一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法
2023-09-22 20:31:35
一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法
【專利摘要】本發明涉及β-內醯胺酶的活性檢測，尤其涉及一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，該方法包括以下的步驟：1）根據不同檢測限，配製不同濃度的青黴素緩衝溶液；2）平板中加入1～5mL青黴素，均勻覆蓋平板，30～40℃反應；3）取反應液於試管中，加入1～5mL中性羥胺，中性羥胺溶液，中性羥胺溶液的濃度為0.1～0.5mol/L，反應一段時間；4）將3）中的混合液加入與中性羥胺等反應量的硫酸鐵胺，觀察溶液顏色變化，若混合液顏色為紅棕色，樣品活性低於檢測限；若為黃色，樣品活性高於檢測限；本發明由於採用了上述的技術方案，該方法能快速、高效、準確地檢測出添加於固體培養基中的β-內醯胺酶的酶活性。
【專利說明】一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及β -內醯胺酶的活性檢測，尤其涉及一種β -內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法。
【背景技術】
[0002]近十年來，因β_內醯胺類抗生素的大量及廣泛使用，尤其是青黴素與頭孢類抗菌藥的使用，對β_內醯胺類抗生素的各種抗菌藥的耐藥性不斷增強，該耐藥菌的出現加劇了各種難治性感染，使得治療十分棘手。許多細菌產生內醯胺酶，在臨床上由於某些致病菌產生β-內醯胺酶，使β -內醯胺類抗生素治療這些病菌所引起的疾病發生了困難。在β_內醯胺類抗生素的生產過程中，由於滅菌不徹底或其它原因，也有可能造成產β_內醯胺酶的雜菌汙染，內醯胺類抗生素的產量就會受到影響。
[0003]產生β_內醯胺酶是出現耐藥性的最主要原因，使內醯胺類抗生素失效的機理，是由於它將內醯胺類抗生素分子中的內醯胺環水解，形成青黴噻唑酸。由於普通的無菌培養基平皿難以應付內醯胺類抗生素生產車間的無菌環境監測，會造成微生物檢驗中出現假陰性結果。因此， 申請人:申請了中國發明專利申請(申請號:201410192279.8申請日:2014-05-08)公開了一種抗生素生產車間環境監測用無菌培養基平皿及其製備方法，所述的抗生素為β_內醯胺類抗生素，在培養基平皿內設置培養基，培養基中添加了與所述的內醯胺類抗生素相對應的內醯胺酶，內醯胺酶的添加量為10萬?800萬單位/皿。
[0004]然而，目前中國藥典中只有對液體內醯胺酶活性檢測方法的規定，而對添加於固體培養基中的β -內醯胺酶如何檢測其酶活並無有關規定與標準，國內外文獻也沒有相關報導。這樣導致市場上很多廠家生產的添加內醯胺酶平皿產品酶活性不合格，但是無法檢測與判斷其酶活性。
【發明內容】
[0005]為了解決上述的技術問題，本發明的目的是提供一種內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，該方法能快速、高效、準確地檢測出添加於固體培養基中的β -內醯胺酶的酶活性。
[0006]為了實現上述的目的，本發明採用了以下的技術方案:
一種β -內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，該方法包括以下的步驟:
1)根據不同檢測限，配製不同濃度的青黴素緩衝溶液；
2)平板中加入I飛mL青黴素，均勻覆蓋平板，3(T40°C反應；
3)取反應液於試管中，加入Γδπι?中性羥胺，中性羥胺溶液，中性羥胺溶液的濃度為0.Γ0.5mol/L，反應一段時間；
4)將3)中的混合液加入與中性羥胺等反應量的硫酸鐵胺，觀察溶液顏色變化，若混合液顏色為紅棕色，樣品活性低於檢測限；若為黃色，樣品活性高於檢測限；所述的檢測限設置如下所示:
①檢測限25萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為60min ；
②檢測限50萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為30min；
③檢測限100萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為20min；
④檢測限200萬單位，步驟I)中青黴素濃度為8mg/mL，步驟2)中反應時間為30min；
⑤檢測限300萬單位，步驟I)中青黴素濃度為8mg/mL，步驟2)中反應時間為20min；
⑥檢測限400萬單位，步驟I)中青黴素濃度為15mg/mL，步驟2)中反應時間為22min；
⑦檢測限550萬單位，步驟I)中青黴素濃度為20mg/mL，步驟2)中反應時間為20min；
⑧檢測限650萬單位，步驟I)中青黴素濃度為25mg/mL，步驟2)中反應時間為20min；
⑨檢測限800萬單位，步驟I)中青黴素濃度為30mg/mL，步驟2)中反應時間為15min。
[0007]作為優選，所述的步驟I)中緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液，濃度為50 mmol/L,pH 7.0。
[0008]作為優選，所述的步驟2)中，反應溫度為35°C。
[0009]作為優選，所述的步驟3)中，中性羥胺溶液的濃度為0.125 mol/L, pH 6.75。
[0010]作為優選，所述的中性羥胺溶液為鹽酸羥胺與鹼性緩衝液混合製得，鹼性緩衝液pH 12.5，由氫氧化鈉4.32 g，三水合乙酸鈉0.862 g水溶後，定容至500 mL製得。
[0011]作為優選，所述的步驟4)中，硫酸鐵胺採用0.25 mol/L硫酸鐵胺。
[0012]本發明由於採用了上述的技術方案，該方法能快速、高效、準確地檢測出添加於固體培養基中的β-內醯胺酶的酶活性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1為實施例1加入25 mg/mL的青黴素鈉溶液的平皿中，35°C反應20 min的顯色照片。
[0014]圖2為實施例1加入20 mg/mL的青黴素鈉溶液的平皿中，35°C反應20 min的顯色照片。
[0015]圖3為實施例2加入15 mg/mL的青黴素鈉溶液的平皿中，35°C反應22 min的顯色照片。
[0016]圖4為實施例2加入8 mg/mL的青黴素鈉溶液的平皿中，35°C反應20min的顯色照片。
【具體實施方式】
[0017]試劑配製
(I)中性羥胺溶液
0.25 mol/L鹽酸羥胺:取鹽酸羥胺8.685 g，以水溶解，定容至500 mL。
[0018]鹼性緩衝液(pH 12.5):取氫氧化鈉4.32 g，三水合乙酸鈉0.862 g水溶後，定容至 500 mL。
[0019]0.125 mol/L中性羥胺(pH 6.75):0.25 mol/L鹽酸羥胺與鹼性緩衝液等體積混八口 ο
[0020](2)硫酸鐵胺溶液
0.15 mol/L硫酸溶液-M 4.1 mL98%的濃硫酸，定容至500 mL。
[0021]0.25 mol/L硫酸鐵胺:取硫酸鐵胺60.25 g，以0.15 mol/L硫酸溶液懸浮，加熱使之溶解，冷卻後以0.15 mol/L硫酸定容至500 mL。
[0022](3)硫酸鐵胺試紙條
將裁剪好的吸水紙浸泡於硫酸鐵胺溶液中4 h，烘箱中60°C過夜烘乾。
[0023]⑷緩衝液
50 mmol/L磷酸鹽緩衝液(pH 7.0):取十二水合磷酸氫二鈉6.80 g與二水合磷酸二氫鈉4.84 g，溶於水後定容至1000 mL。
[0024](4)檢測用底物
根據不同檢測限，用緩衝液配製對應濃度的青黴素鈉。
[0025]實施例1
1.取青黴素酶凍乾粉(杭州北望生物技術有限公司，批號:20140613)—瓶，採用中國藥典中的澱粉碘法測得青黴素酶活性1264萬單位/瓶。
[0026]2.將青黴素酶凍乾粉溶解於2 mL磷酸緩衝液(pH7.0)中，製成632萬單位/mL的青黴素酶液。
[0027]3.取I mL青黴素酶液加入平皿中，加入19 mL冷卻至55°C的胰蛋白腖大豆瓊脂培養基(TSA)，輕微搖晃均勻，平置於桌面。待培養基凝固，製得添加青黴素酶培養基平皿，編號為樣品皿1，活性為632萬單位/皿。
[0028]4.配製濃度為25 mg/mL的青黴素鈉溶液，取2 mL加入步驟3製備好的平皿中，35°C反應20 min。取0.5 mL反應液於試管中，加入0.5 mL中性羥胺，反應3 min，然後加Λ 0.5 mL硫酸鐵胺，觀察溶液顏色如圖1。根據檢測限表，檢測出樣品皿I中青黴素酶活性〈650萬單位/皿。
[0029]5.配製濃度為20 mg/mL的青黴素鈉溶液，取2 mL加入步驟3製備好的平皿中，35°C反應20 min。取0.5 mL反應液於試管中，加入0.5 mL中性羥胺，反應3 min，然後加Λ 0.5 mL硫酸鐵胺，觀察溶液顏色如圖2。根據檢測限表，檢測出樣品皿I中青黴素酶活性>550萬單位/皿。
[0030]6.通過步驟4和步驟5得到結論:550萬單位/皿〈樣品皿1〈650萬單位/皿。樣品皿I的實際酶活632萬單位/皿，因此結果符合。
[0031]實施例2
1.取頭孢菌素酶凍乾粉(杭州北望生物技術有限公司，批號:20140524) —瓶，採用中國藥典中的澱粉碘法測得頭孢菌素酶活性368萬單位/瓶。
[0032]2.將頭孢菌素酶凍乾粉溶解於I mL磷酸緩衝液(pH7.0)中，製成368萬單位/mL的頭孢菌素酶液。
[0033]3.取I mL頭孢菌素酶液加入平皿中，加入19 mL冷卻至55°C的營養瓊脂培養基(NA)，輕微搖晃均勻，平置於桌面。待培養基凝固，製得添加頭孢菌素酶培養基平皿，編號為樣品皿2，活性為368萬單位/皿。
[0034]4.配製濃度為15 mg/mL的青黴素鈉溶液，取2 mL加入步驟3製備好的平皿中，35°C反應22 min。取0.5 mL反應液於試管中，加入0.5 mL中性羥胺，反應3 min，然後加Λ 0.5 mL硫酸鐵胺，觀察溶液顏色如圖3。根據檢測限表，檢測出樣品皿2中青黴素酶活性〈400萬單位/皿。
[0035]5.配製濃度為8 mg/mL的青黴素鈉溶液，取2 mL加入步驟3製備好的平皿中，35°C反應20 min。取0.5 mL反應液於試管中，加入0.5 mL中性羥胺，反應3 min，然後加Λ 0.5 mL硫酸鐵胺，觀察溶液顏色如圖4。根據檢測限表，檢測出樣品皿2中青黴素酶活性>300萬單位/皿。
[0036]6.通過步驟4和步驟5得到結論:300萬單位/皿〈樣品皿1〈400萬單位/皿。樣品皿2的實際酶活368萬單位/皿，因此結果符合。
【權利要求】
1.一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於該方法包括以下的步驟: 1)根據不同檢測限，配製不同濃度的青黴素緩衝溶液； 2)平板中加入f5mL青黴素緩衝溶液，均勻覆蓋平板，3(T40°C反應； 3)取反應液於試管中，加入r5mL中性羥胺溶液，中性羥胺溶液的濃度為0.Γ0.5mol/L,反應一段時間； 4)將3)中的混合液加入與中性羥胺等反應量的硫酸鐵胺，觀察溶液顏色變化，若混合液顏色為紅棕色，樣品活性低於檢測限；若為黃色，樣品活性高於檢測限；所述的檢測限設置如下所示: ①檢測限25萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為60min ； ②檢測限50萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為30min； ③檢測限100萬單位,步驟I)中青黴素濃度為4mg/mL,步驟2)中反應時間為20min； ④檢測限200萬單位，步驟I)中青黴素濃度為8mg/mL，步驟2)中反應時間為30min； ⑤檢測限300萬單位，步驟I)中青黴素濃度為8mg/mL，步驟2)中反應時間為20min； ⑥檢測限400萬單位，步驟I)中青黴素濃度為15mg/mL，步驟2)中反應時間為22min； ⑦檢測限550萬單位，步驟I)中青黴素濃度為20mg/mL，步驟2)中反應時間為20min； ⑧檢測限650萬單位，步驟I)中青黴素濃度為25mg/mL，步驟2)中反應時間為20min； ⑨檢測限800萬單位，步驟I)中青黴素濃度為30mg/mL，步驟2)中反應時間為15min。
2.根據權利要求1所述的一種內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於，步驟I)中，緩衝溶液為磷酸鹽緩衝液，濃度為50 mmol/L, pH 7.0o
3.根據權利要求1所述的一種內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於，步驟2)中，反應溫度為35°C。
4.根據權利要求1所述的一種內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於，步驟3)中，中性羥胺溶液的濃度為0.125 mol/L, pH 6.75。
5.根據權利要求1或4所述的一種β-內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於，中性羥胺溶液為鹽酸羥胺與鹼性緩衝液混合製得，鹼性緩衝液PH 12.5，由氫氧化鈉4.32 g，三水合乙酸鈉0.862 g水溶後，定容至500 mL製得。
6.根據權利要求1所述的一種內醯胺酶培養基平板的活性檢測方法，其特徵在於，步驟4)中，硫酸鐵胺採用0.25 mol/L硫酸鐵胺。
【文檔編號】C12Q1/34GK104263808SQ201410437817
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年8月29日 優先權日:2014年8月29日
【發明者】沈祝飛, 張加慧, 周冰 申請人:杭州北望生物技術有限公司