一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法與流程
2023-09-22 21:00:25
本發明屬於微生物領域，特別地涉及一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法。
背景技術：
豆醬作為營養豐富、香氣馥鬱的傳統發酵食品，是很多家庭的必備之選。農家醬採用自然接種微生物進行發酵，手工式的生產無法保證醬的均一穩定，易被有害雜菌汙染，而工業化的生產，由於發酵菌種單一，周期短，鹽濃度高，同樣面臨來自安全性、營養性、方便性以及需求多樣性等方面的挑戰。因此對豆醬中微生物來源及其功能進行深入研究，從而全面把握營養物質、風味物質生成機理，解決豆醬生產過程中的種種問題，保障消費者的安全食用，具有重要意義。
2004年Rodriguez-Valera首次提出宏蛋白質組的概念，是指複雜環境微生物群落中所有生物的蛋白質組總和。豆醬中微生物宏蛋白質組還鮮有報導，它是指豆醬中所有微生物產生的全部蛋白質。豆醬微生物宏蛋白質組研究，可為發現功能蛋白質標記物、種系發生以及微生物群體的功能性分析提供依據，也為進一步揭示微生物與豆醬品質形成關係奠定基礎。
本專利闡述了一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法，為後續研究奠定了基礎。
技術實現要素：
本發明目的在於提供一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法。
一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法，包括以下步驟：
A、取新鮮採集的豆醬放於離心桶中，加入磷酸鹽緩衝液，放入直徑0.2-0.8cm的玻璃珠20-50顆，人工震蕩離心桶8-15min；
B、將玻璃珠取出，以5000-8000r/min的轉速，離心15-30min，收集上清液；
C、上清液以10000-12500r/min離心10-25min，棄去沉澱物，收集上清。在上清中加入等量裂解液，150-180w超聲10-15min，工作3s停5s；
D、在樣品液中加入等體積的丙酮溶液，放入-20℃冰箱靜置2h，10000-12500r/min離心10-25min，棄上清，收集沉澱物，重複兩次，沉澱物冰上風乾得到蛋白質粉末；
E、按照0.1g/ml的比例向蛋白質粉末中加入裂解液，20-30w超聲助溶8-12min，工作2s停3s，10000-12500r/min離心50-75min，取上清液。
優選的，所述的步驟B中，磷酸鹽緩衝液的配置方法為：
以0.1mol/L，pH＝7.0磷酸鹽緩衝液(1000ml)為例：(1)0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液(1000ml)：稱取22.8220g磷酸氫二鉀於1000ml容量瓶中，加入去離子水混勻定容。(2)0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液(1000ml)：稱取13.6090g磷酸二氫鉀於1000ml容量瓶中，加入去離子水混勻定容。取610ml溶液(1)和390ml溶液(2)混勻，加入8g氯化鈉，0.2g氯化鉀混勻後，調pH至7.0，現用現配。
優選的，所述的步驟C和E中的裂解液(20ml)的配置方法為：稱取尿素8.4081g，硫脲3.0448g，CHAPS(3-[3-(膽醯胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸鹽)0.8g，蛋白酶抑制劑PMSF(苯甲基黃醯氟)0.0035g，DTT(二硫蘇糖醇)0.2g於20ml容量瓶中，加入去離子水混勻後定容，現用現配。
優選的，所述的步驟D中，所述的丙酮溶液為10％TCA-丙酮溶液，10％TCA-丙酮(100ml)：取10g TCA於100ml容量瓶，加入冰丙酮混勻後定容。
本發明公開了一種自然發酵豆醬中微生物胞外宏蛋白質組的提取方法，取新鮮採集的自然發酵豆醬於離心桶中，5000-8000r/min離心收集上清液，上清液10000-12500r/min離心收集上清，超聲裂解，丙酮除雜，冰上風乾得到胞外蛋白質，向胞外蛋白質中加入裂解液，超聲助溶，離心後得到蛋白質清液。本方法可為發現功能蛋白質標記物、種系發生以及微生物群體的功能性分析提供依據，也為進一步揭示微生物與豆醬品質形成關係奠定基礎。
除了上面所描述的目的、特徵和優點之外，本發明還有其它的目的、特徵和優點。下面將對本發明作進一步詳細的說明。
附圖說明
圖1為豆醬中微生物胞外宏蛋白質組SDS-PAGE結果圖，其中，1為實驗室樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，2為瀋陽樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，3為葫蘆島樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，4為朝陽樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖。
具體實施方式
以下對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以根據權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
實施例1
以實驗室自製農家醬為原材料，採用本專利請求中敘述的方法，提取豆醬中微生物胞外宏蛋白質組。具體步驟如下：
A、取新鮮採集的豆醬70g放於500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩衝液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直徑0.5cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10min；
B、將玻璃珠取出，6000r/min，離心20min，收集上清液；
C、上清液12000r/min離心20min，棄去沉澱物，收集上清。在上清中加入等體積裂解液，160w超聲10min，工作3s停5s；
D、樣品液中加入等體積的丙酮溶液，放入-20℃冰箱靜置2h，10000-12500r/min離心10-25min，棄上清，收集沉澱物，重複兩次，沉澱物冰上風乾得到蛋白質粉末；
E、按照0.1g/ml向胞外蛋白質中加入裂解液，26w超聲助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，離心1h，取上清液。
採用SDS-PAGE對胞外蛋白質進行檢測：分離膠濃度為12％(體積∶體積)，濃縮膠濃度為5％(體積∶體積)。電泳時間設置為80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab軟體對所得的SDS-PAGE電泳膠圖進行掃描。
實施例2
以瀋陽農家醬為原材料，採用本專利請求中敘述的方法，提取豆醬中微生物胞外宏蛋白質組。具體步驟如下：
A、取新鮮採集的豆醬70g放於500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩衝液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直徑0.2cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10min；
B、將玻璃珠取出，6000r/min，離心20min，收集上清液；
C、上清液12000r/min離心20min，棄去沉澱物，收集上清。在上清中加入等體積裂解液，160w超聲10min，工作3s停5s；
D、在樣品液中加入等體積的丙酮溶液，放入-20℃冰箱靜置2h，10000-12500r/min離心10-25min，棄上清，收集沉澱物，重複兩次，沉澱物冰上風乾得到蛋白質粉末。
E、按照0.1g/ml向胞外蛋白質中加入裂解液，26w超聲助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，離心1h，取上清液。
採用SDS-PAGE對胞外蛋白質進行檢測：分離膠濃度為12％(體積∶體積)，濃縮膠濃度為5％(體積∶體積)。電泳時間設置為80v，15min；120v至跑完。
實施例3
以葫蘆島農家醬為原材料，採用本專利請求中敘述的方法，提取豆醬中微生物胞外宏蛋白質組。具體步驟如下：
A、取新鮮採集的豆醬70g放於500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩衝液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直徑0.8cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10min；
B、將玻璃珠取出，6000r/min，離心20min，收集上清液；
C、上清液12000r/min離心20min，棄去沉澱物，收集上清。在上清中加入等體積裂解液，160w超聲10min，工作3s停5s；
D、在樣品液中加入等體積的丙酮溶液，放入-20℃冰箱靜置2h，10000-12500r/min離心10-25min，棄上清，收集沉澱物，重複兩次，沉澱物冰上風乾得到蛋白質粉末。
E、按照0.1g/ml向胞外蛋白質中加入裂解液，26w超聲助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，離心1h，取上清液。
採用SDS-PAGE對胞外蛋白質進行檢測：分離膠濃度為12％(體積∶體積)，濃縮膠濃度為5％(體積∶體積)。電泳時間設置為80v，15min；120v至跑完。
實施例4
以朝陽農家醬為原材料，採用本專利請求中敘述的方法，提取豆醬中微生物胞外宏蛋白質組。具體步驟如下：
A、取新鮮採集的豆醬70g放於500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩衝液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直徑0.5cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10min；
B、將玻璃珠取出，6000r/min，離心20min，收集上清液；
C、上清液12000r/min離心20min，棄去沉澱物，收集上清。在上清中加入等體積裂解液，160w超聲10min，工作3s停5s；
D、在樣品液中加入等體積的丙酮溶液，放入-20℃冰箱靜置2h，10000-12500r/min離心10-25min，棄上清，收集沉澱物，重複兩次，沉澱物冰上風乾得到蛋白質粉末。
E、按照0.1g/ml向胞外蛋白質中加入裂解液，26w超聲助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，離心1h，取上清液。
採用SDS-PAGE對胞外蛋白質進行檢測：分離膠濃度為12％(體積∶體積)，濃縮膠濃度為5％(體積∶體積)。電泳時間設置為80v，15min；120v至跑完。
圖1為豆醬中微生物胞外宏蛋白質組SDS-PAGE結果圖，其中，1為實驗室樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，2為瀋陽樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，3為葫蘆島樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖，4為朝陽樣品胞外宏蛋白質組的SDS-PAGE膠圖。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。