馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA－ITS序列、特異性檢測引物及一步雙重PCR檢測方法

2023-09-27 06:06:45

專利名稱：馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA－ITS序列、特異性檢測引物及一步雙重PCR檢測方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，涉及馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS序列、針對該序列設計的一特異性引物序列及用該引物快速PCR檢測馬鈴薯腐爛莖線蟲的方法。
背景技術：
危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲(D.destructor)和危害大蒜及球莖和鱗莖類的起戎草莖線蟲(D.dipsaci)是我國農作物的重要莖線蟲病害。甘薯莖線蟲病在我國河北盧龍縣、昌黎、灤縣、遷安、廊坊、霸州、曲陽縣、定州等21個縣市，北京密雲、大興、房山、河南許昌、鄭州、平頂山、郟縣、吉林省吉林市九站、遼寧、山東沂水縣、江蘇徐州等省市發生普遍，並且病害非常嚴重，主要侵染甘薯的地下部根、塊根和塊莖，被害部分表現為組織壞死、幹縮、糠心和表皮變褐龜裂，俗稱甘薯糠腐莖線蟲病，該病一般減產20％～30％，嚴重者40～50％，甚至絕產，是我國華北和華東甘薯的毀滅性線蟲病害，嚴重製約了甘薯產業的發展(陳品三，1979，甘薯莖線蟲病。中國農作物病蟲害(上冊)。P460-465.農業出版社；葉松枝李躍傑劉海元甘薯莖線蟲病的發生與防治技術植保技術與推廣199717(3)，20～21；陳發煒韓祥紅李祥升.1996.甘薯莖線蟲病的綜合防治技術植保技術與推廣，16(6)，12.劉信義河北省應用涕滅威防治花生、甘薯線蟲病的現狀植保技術與推廣199717(3)，46～47.林茂松文玲方中達馬鈴薯腐爛線蟲與甘薯莖線蟲病江蘇農業學報199915(3)，186～190.)。
我國甘薯莖線蟲病的病原，20世紀80年代以前，曾鑑定為起戎草莖線蟲(Ditylenchusdipsaci)(陳品三，1979，甘薯莖線蟲病。中國農作物病蟲害(上冊)。P460-465.農業出版社)，尹光德 張雲美(1983)對河北和山東兩個甘薯莖線蟲病標樣進行了研究，將甘薯莖線蟲病病原重新訂正為馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)(尹光德 張雲美1983甘薯莖線蟲病病原線蟲的訂正。山東大學學報(自然科學版)，1983，9(3)117-127。)，而對我國其它地區甘薯莖線蟲病病原並未深入詳細研究，至此我國甘薯莖線蟲病的病原一致籠統沿用馬鈴薯腐爛莖線蟲。
隨著我國農業產業結構的調整，複種指數增加，甘薯莖線蟲病的發生危害逐年加重，新改制後種植的其它經濟作物莖線蟲病害日益突出，如我國甘肅、寧夏、河北、河南、北京、內蒙古等地的其它經濟作物如當歸、人參、黃芪、麻黃草、薄荷、亞麻等莖線蟲病的發生日趨嚴重，迫切要求快速診斷和制定正確的治理對策。因此如何準確、及時和快速將田間莖線蟲混合群體鑑定和識別到線蟲種和亞種水平，成為制定植物莖線蟲病害綜合治理決策所迫切需要解決的首要問題。
莖線蟲種的鑑定過去主要是以形態鑑定為主，生理小種鑑定主要是依據在對不同寄主的致病力來確立。莖線蟲的形態學鑑定非常困難，有效鑑別特徵不多，且許多表型特徵不穩定。以PCR為基礎的分子生物學技術為解決莖線蟲鑑定診斷存在的問題提供了最有力的工具，直接測定線蟲的遺傳物質(DNA)成為了線蟲分子診斷最有力的工具。在植物線蟲的分子診斷和鑑定中，最有價值的基因組區域之一是核糖體DNA(ribosomal DNA，rDNA)重複單元，rDNA在基因組中有多個拷貝(100～500)，其內轉錄間隔區(Internal Transcribed Spacer Region，ITS)序列對線蟲種和亞種水平分子診斷非常有用，受到線蟲學家的高度重視和普遍採用。目前rDNA-ITS分析技術在美洲劍線蟲群體(Xiphinema)、馬鈴薯金線蟲(G rostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(G.pallida)、孢囊線蟲(Heterodera)、滑刃線蟲(Aphelenchoides)和莖線蟲屬(Ditylenchus)、根結線蟲(Meloidogyne)、根腐線蟲(Pratylenchus)、刺線蟲(Belonolaimus)和昆蟲病原線蟲以及蚜蟲等種和種間分子特徵及分子診斷研究中得到廣泛的應用。
Ibrahim，S.K.等(1994)用18S和26S兩個引物，應用PCR技術研究了12種滑刃線蟲和水稻莖線蟲的rDNA-ITS，擴增出12種滑刃線蟲的ITS片段大小為860-1100bp，揭示了滑刃線蟲的種內和種間變異，從水稻莖線蟲中擴增出ITS片段為1100bp(Ibrahim，S.K.，Perry，R.N.，Burrows，P.R. Hooper，D.J.1994.Differentiation of species and populations of Aphelenchoidesand of Ditylenchus angustus using a fragment of ribosomal DNA.Journal of Nematology 26，412-421.)。Wendt，K.R.等(1993)用通用引物rDNA1和rDNA2從水稻莖線蟲、噬菌莖線蟲和起絨草莖線蟲中擴增出900bp的DNA片段，從馬鈴薯腐爛莖線蟲(D.destrctor)中擴增出ITS片段為1200bp(Wendt，K.R，Vrain，T.C. Webster，J.M.1993.Separation of three species ofDitylenchus and some host races of D.dipsaci by restriction fragment length polymorphism.Journal of Nematology 25555-563)。
特異性引物PCR或多重PCR技術是近年來線蟲分子診斷取得的重要進展。通過一次PCR測驗就可以在混合樣品中特異性地檢測出一個或多個線蟲種。基於核糖體DNA(rDNA)而構建的線蟲特異性引物進展較快，在診斷根腐線蟲、根結線蟲、馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲、大豆孢囊線蟲和甜菜孢囊線蟲中取得了突破性進展，形成了特異性診斷4種重要根腐線蟲如穿刺根腐線蟲P.penetrans、斯克裡布根腐線蟲P.scribneri、咖啡根腐線蟲P.Coffeae和盧賽根腐線蟲P.loosi的特異性引物，以及3種根結線蟲如戚烏得根結線蟲M.Chitwoodi、法拉克斯根結線蟲M.fallax和北方根結線蟲M.Hapla(Zijlssstra C.2000，Identification of Meloidogyne chitwoodi，M.fallax and M.hapla based on SCAR-PCRa powerful way ofenabling reliable identification of populations or individuals that share common traits〔J〕European Journal ofPlant Pathology 2000，106283-290；Petersen，D.J.，Zijlstra，C.，Wishart，J.1997.Specific probes efficientlydistinguish root-knot nematode species using signature sequence in the ribosomal intergenetic spacer〔J〕Fundamental and Applied Nematology，20，619-626；Williamson V.M.，et.al.，1997.A PCR Assay to identifyand distinguish single juveniles of Meloidogyne hapla and M.chitwoodi〔J〕Journal of Nematology，1997，29(1)9-15)的特異性引物；構建了馬鈴薯金線蟲(ITS1-Gr，PITSr3)和馬鈴薯白線蟲的特異性引物(ITS1-Gp，PITSp4)，成功應用多重PCR技術從複合種群中快速診斷馬鈴薯金線蟲(Mulholland V.，Carde L.， O.Donnell.1996.Use of the polymerase chain reation to discriminatepotato cyst nematode at the species level.InMarshall G.(Ed).Proceedings of diagnostics in Crop ProductionSymposium.British Crop Production Council，Farnham，UK，pp.247-252；Bulman，S.R. Marshall，J.W.1997.Differentiation of Australasian potato cyst nematode(PCN)populations using the polymerase chainreaction(PCR)(J)New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science 1997，25，123-129.)。構建了大豆孢囊線蟲特異性引物GlyF1，特異性引物GlyF1和通用引物rDNA2成功地檢測大豆孢囊線蟲特異性DNA片段(181bp)(彭德良S.A.Subbotin，Maurice Moens 2001應用雙倍PCR技術快速檢測大豆孢囊線蟲。瀋陽農業大學學報32(3)216-217；Subboton S A，Peng，D L and Moens，M.2001A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR(J)Nematology，3(4)365～371)，構建了基於rDNA-ITS的甜菜孢囊線蟲(H.schachtii)特異性引物SHF6。將特異性引物SHF6與通用引物AB28引物結合，特異性片段為200bp(Amiri，Subbotin等，2002，Identification of the beet cyst nematode Heterodera schachtii by PCR(J)EuropeanJournal of Plant Pathology 2002，108，497-506.)，診斷的水平達到單條幼蟲的水平。
我國已經開展小麥禾穀孢囊線蟲的rDNA-ITS分析(彭德良，Subbotin.S.A.；Moens，M.2003小麥禾穀胞囊線蟲(Heterodera avenae)的核糖體基因(rDNA)限制性片段長度多態性研究。植物病理學報，33(4)323-329)、大豆孢囊線蟲群體的rDNA-ITS-RFLP分析[Zheng，J.W.(鄭經武等)；Peng，D.L.；Moens，M.2000 Stability and variation of its region of rDNA among theinter-populations of soybean cyst nematode，Heterodera glycines，from China.Proceedings of Thefirst Asian conference on Plant Pathology，p198，Beijing，China，August25-28，2000；彭德良2001小麥和大豆孢囊線蟲毒性、分子診斷及線蟲病害生防因子研究。pp103(士論文)]、根結線蟲rDNA-ITS研究[Peng，D.L(彭德良).Subbotin.S.A. Moens，M.2002.Molecular characteristicof some species of the genus Meloidogyne from China.Nematology，4(2)175-176；Liao，J.L(廖金鈴).Feng，Z.X. Yang，W.2002.Phylogeny of Meloidogyne spp.Based on rDNA-ITSsequence and fluorescent AFLP.Nematology，4(2)173]、松材線蟲的核糖體DNA的ITS區的大小和變異分析[Liao J.L(廖金鈴).；Zhang，L.H.；Feng Zh.X.2000 Identification ofBursaphelenchus xylophilus by PCR Amplification of Ribosomal DNA.Proceedings of The firstAsian Conference on Plant Pathology，p202，Beijing，China，August25-28；張立海 廖金鈴 馮志新 松材線蟲rDNA的測序和PCR-SSCP分析。植物病理學報，2001，13(1)84-89；許建平；鄭經武；王建偉 松材線蟲的PCR快速診斷研究 浙江農業大學學報199824(2)，133～134]。
目前中國農業科學院植物保護研究所已經開展莖線蟲的rDNA-ITS遺傳多態性研究，發明人2001-2004年間對危害甘薯的莖線蟲標樣的rDNA-ITS進行了初步研究，擴增出了rDNA-ITS片段，進行了克隆和測序，無論從ITS片段大小、RFLP分布型，還是從序列分析結果都表明在我國危害甘薯的莖線蟲有兩個類型，I型既不是起戎草莖線蟲，也不是馬鈴薯腐爛莖線蟲；II型甘薯莖線蟲為馬鈴薯腐爛莖線蟲。我國至今還未見馬鈴薯腐爛莖線蟲的分子檢測方法，本發明為II型甘薯莖線蟲即馬鈴薯腐爛莖線蟲快速特異性分子檢測方法。

發明內容
本發明通過對危害我國甘薯的莖線蟲的研究，提供馬鈴薯腐爛線蟲特異性rDNA-ITS的全序列，並且提供其特異性檢測引物及PCR檢測方法。
馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性rDNA-ITS，其特徵在於具有如SEQ NO1所示的核苷酸序列。
馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性rDNA-ITS，其特徵在於具有如SEQ NO2所示的核苷酸序列。
上述rDNA-ITS序列的特異性引物SSsj，其核苷酸序列如SEQ NO3所示。
SSsj5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTT-3′。
馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有上述特異性引物SSsj和引物AB28，所述引物AB28的核苷酸序列為5』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3』。
上述PCR反應體系中還含有內標引物。
所述內標引物為D3A和D3B，其核苷酸序列為D3A5′-GACCCGTCTTGAAACACGGA-3′。
D3B5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′。
所述快速PCR檢測為一步雙重PCR檢測。
本發明以危害甘薯的莖線蟲病害為材料，採用現代分子生物學PCR擴增技術，研究危害我國不同地區的甘薯莖線蟲核糖體基因(rDNA)，通過擴增莖線蟲的rDNA-ITS，得到730bp和900bp片段，因此將危害我國甘薯的莖線蟲分別稱之為I型和II型甘薯莖線蟲。II型甘薯莖線蟲的樣品分別來自山東沂水和江蘇銅山。將900bp片段通過克隆，進行序列測定得到rDNA-ITS的全序列SEQ NO1和SEQ NO2，通過親緣性比較，發現與馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)的同源性很高(96.8％和92.1％)，因此確認II型甘薯莖線蟲為馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)。根據SEQ NO1和SEQ NO 2，構建了危害甘薯的馬鈴薯莖線蟲種的特異性引物(SSsj)作為上遊引物，同時結合下遊引物AB28建立了快速準確鑑定和檢測危害甘薯的馬鈴薯莖線蟲種的分子生物學方法和規範的PCR技術流程，II型甘薯莖線蟲的PCR擴增結果能得到特異性623bp片段；為防止假陰性反應，在PCR反應液中還可加入內標引物，本發明所用內標引物為核糖體DNA28S基因D3擴展區通用引物D3A和D3B，利用一步雙重PCR方法檢測，II型甘薯莖線蟲PCR擴增結果能得到特異性623bp片段和345bp片段，而I型甘薯莖線蟲PCR擴增結果只能得到345bp片段，而沒有擴增出623bp片段，也沒有其它的額外的片段，說明623bp的DNA片段是危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲種特異性片段。
該發明對為莖線蟲的檢疫檢驗和生產實踐中莖線蟲的識別提供快速準確的分子檢測方法，為制定莖線蟲病害綜合治理決策提供理論參考，對進出境其它重要檢疫性線蟲的分子檢測具有實際借鑑意義。


圖1危害甘薯的莖線蟲群體的rDNA-ITS擴增結果。
M標準DNA分子標記(DL2000)，1為Dm；2-9分別為Dd1，Dd2，Dd3，Dd4，Dd5，Dd6，Dd7和Dd8，10-11分別為Dd9和Dd10；12位陰性對照。
圖2馬鈴薯腐爛莖線蟲特異引物SSsj與AB28以及D3A和D3B的一步雙重PCR擴增結果。M為標準DNA分子量標記(DL2000)，泳道1-9分別為Dm，Dd1，Dd2，Dd3，Dd4，Dd5，Dd6，Dd7和Dd8；泳道10-11分別為Dd9和Dd10；12為陰性對照。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的詳細說明。
本發明的實驗選用的材料甘薯上莖線蟲樣品的採集危害甘薯的莖線蟲群體樣品是本試驗室在甘薯收穫季節從河北盧龍、河北撫寧、河北易縣、河北灤縣、河北灤南等發病的田間採集和收集而來，山東省平陰縣的甘薯莖線蟲樣品由山東省農科院作物所的王慶美研究員提供；安徽省泗縣和江蘇省銅山縣甘薯莖線蟲樣品由中國農科院甘薯研究所的謝逸萍副研究員提供；北京市大興區樣品由北京市植保站張建華農藝師提供；食菌莖線蟲(D.myceliophagus)樣品由英國威爾斯草原環境研究所RogerCook博士贈送(表1)。
表1甘薯上莖線蟲群體的採集地點及代碼

主要試劑Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、DNA marker購自TaKaRa公司，限制性內切酶(Biolabs)購自京科宏達生物技術公司；引物由上海博亞生物技術有限公司合成；pGEM-T Easy Vector(Promega，美國)購自北京華綠源生物技術公司。
實施例1危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS的擴增1.1莖線蟲DNA的提取手挑10頭危害甘薯的莖線蟲，放入盛有14μl滅菌重蒸水的離心管中，-20℃冰箱中冷凍2小時。用75％酒精消毒的玻璃棒在離心管中轉動至冰融化，加入3μl的10×PCR buffer，3μl蛋白酶K溶液(600μg/ml)，-20℃下冷凍至少1小時。將離心管從冰箱中取出，置65℃下溫育1小時，以降解脫氧核糖核酸；接著在95℃10分鐘，使蛋白酶K變性，最後10000r/min離心1分鐘，取上清DNA懸浮液於-20℃保存備用。
1.2rDNA-ITS的PCR擴增採用Joyce et al(1994)設計的通用引物TW81和AB28，由上海博雅生物有限公司合成，TW81和AB28的序列如下TW81(5』-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3』)AB28(5』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3』)。
採用50μl PCR反應體系，配比如下10×Buffer(含Mg2+) 5μl10mM dNTP 4μlddH2O 37.1μl引物TW81(1μg/μl) 0.3μl引物AB28(1μg/μl) 0.3μlTaq酶(5U/μl，Takara) 0.3μl模板DNA 3μl總計50μlPCR反應擴增條件為94℃4min；94℃1min，55℃2min，72℃2min，9個循環；94℃1min；55℃90min；72℃2min；72℃10min；4℃過夜。PCR擴增後，取5μl擴增產物加1μl加樣緩衝液在1.0％瓊脂糖凝膠上電泳，用1×TAE作為電泳緩衝液，100V下電泳40分鐘，用EB染色，在紫光燈下觀察照相。(圖1)PCR擴增結果表明我國10個不同地區的甘薯莖線蟲群體和食菌莖線蟲均產生單一明顯的擴增條帶，但是擴增片段大小不等，大致可以歸為兩類。北京大興、河北盧龍、河北撫寧、河北易縣、河北灤縣、河北灤南、山東平陰、安徽泗縣等8個甘薯莖線蟲群體(Dd1-Dd8)和食菌莖線蟲群體(Dm)的rDNA-ITS擴增產物長度約為730bp；而山東沂水和江蘇銅山甘薯莖線蟲群體的擴增片段長度約為920bp，在陰性對照中沒有PCR產物。因此將我國北京大興、山東平陰、安徽泗縣、河北盧龍、撫寧、易縣、灤縣和灤南等地危害甘薯的莖線蟲稱之為I型甘薯莖線蟲，而將山東沂水和江蘇銅山等地危害甘薯的莖線蟲群體稱之為II型甘薯莖線蟲。
1.3危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲I TS序列測定及構建基於rDNA的特異性標記引物將通用引物TW81和AB28擴增的II型甘薯莖線蟲獲得的900bp的ITS產物從瓊脂糖凝膠上切割，使用大連寶生物公司的DNA回收試劑盒對900bp的ITS進行回收和純化。按《分子克隆》CaCl2方法製備感受態細胞(Joseph Sambrook，2001)將純化後的ITS產物連接到pGEM-T easy Vector載體上，PCR產物與載體連接後，轉化到E.coli中進行克隆，採用熱擊法進行轉化，採用鹼法提取重組質粒，用限制性內切酶EcoRJ對提取的質粒進行酶切鑑定和檢測。將表現為陽性克隆的重組質粒多克隆位點兩端的通用引物對插入片段進行序列測定，序列測定由北京三博遠志生物技術有限公司完成。用Vector NTI 9.0(IrforrMax Co.)軟體對序列進行分析比較。
測定的900bp馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性ITS全序列如下序列測定結果表明，山東沂水(Dd9)和江蘇銅山(Dd10)兩個II甘薯莖線蟲群體的ITS擴增產物的序列均為917bp。
Dd9 1GTTTCCGTAGGTGAACCTGCTGCCGGATCATTAACGATCATACCAATCCA 50Dd10GTTTCCGTAGGTGAACCTGCTGCCGGATCATTAACGATCATACCAATCCADd9 51 CTTTCAGTGGTTATATTAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGCAG 100Dd10 CTTTCAGTGGTTATATTAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGCAGDd9 101 GCACAGAGTAGTTGTCCCGCTCTGTATTTGTACTTGCGTTTGGGCTTGCA 150Dd10 GCACAGAGTAGTTGTCCCGCTCTGTATTTGTACTTGCGTTTGGGCTTGCADd9 151 CTTT GCT TG ACTTGCGCT TGT CTTGC CTGTGT C TGC CTGT200Dd10 CTTT GCT TG ACTTGCGCT TGT CTTGC CTGTGT C TGC CTGTDd9201 GT CTTG GCTGTGT CTTGCTTTA AGCTTGCATT G GCTTGCATTAG250Dd10 GT CTTG GCTGTGT CTTGCTTTA AGCTTGCATT G GCTCGCATTAGDd9251 AGCT GCATT G GCTT CATTTGTGCTTG ATTTGCG TTGTGTTTGCT300Dd10 TGCT GCATT G GCTT CATTTGTGCTTG ATTTGCG TTGTGTTTGCTDd9 301 GGTGCGCTTGTGCCTGGCTAATTTGTGGGCGAAAAACGGCTTTGTTGGCC 350Dd10 GGTGCGCTTGTGCCTGGCTAATTTGTGGGCGAAAAACGGCTTTGTTGGCCDd9 351 TCTAAGTTTTCCTGAGCAGTTGTATGCTTCTTTGTCCGTGGCTGTGATGA 400Dd10 TCTAAGTTTTCCTGAGCAGTTGTATGCTTCTTTGTCCGTGGCTGTGATGADd9 401 AGGAAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAGTTAATGAGCACTGGC 450Dd10 AGGAAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAGTTAATGAGCACTGGCDd9 451 TTTGGTGCCGCCAACACAAAACCCCA TTTTACAAATTTTTCAAGAGAAT 500Dd10 TTTGGTGCCGCCAACACAAAACCCCA TTTTACAAATTTTTCAAGAGAATDd9 501 ATTTTTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTAGATCGATGAAGAACG 550Dd10 ATTTTTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTAGATCGATGAAGAACGDd9 551 CAGCCAACTGCGATAATTAGTGCGAACTGCAGATATTTTGAGCACTAAAG 600Dd10 CAGCCAACTGCGATAATTAGTGCGAACTGCAGATATTTTGAGCACTAAAGDd9 601 TTTCGAATGCACATTGCGCCATTGGATTTTATCCTTTGGCACGTCTGATT 650Dd10 TTTCGAATGCACATTGCGCCATTGGATTTTATCCTTTGGCACGTCTGATTDd9 651 CAGGGTCGTAAATACAAAACCCCAAGCTAATGGTGGTGATATGACCTGTG 700Dd10 CAGGGTCGTAAATACAAAACCCCAAGCTAATGGTGGTGATATGACCTGTGDd9 701 CGGACCGCTGTCTCTTTGGCCTAGCACGTGTTTCTTGTGCAGCCTCTTGG 750Dd10 CGGACCGCTGTCTCTTTGGCCTAGCACGTGTTTCTTGTGCAGCCTCTTGGDd9 751 CCAATGTTGACATCGCTCTCACTCGAGAAAACGCTGTCCAGTGTTTGGTG 800Dd10 CCAATGTTGACATCGCTCTCACTCGAGAAAACGCTGTCCAGTGTTTGGTGDd9 801 ACATTGCTGTAAGTCCTAGCGATTCCTATGGACGTAAGGCTTTGAAGCCA 850Dd10 ACATTGCTGTAAGTCCTAGCGATTCCTATGGACGTAAGGCTTTGAAGCCA
Dd9 851 AACGCAGAGCAGTCGATTTTTCGACCTGAATCTGACGTGATTACCCGCTG900Dd10 AACGCAGAGCAGTCGATTTTTCGACCTGAATCTGACGTGATTACCCGCTGDd9 901GCTGAACTTAAGCATAT917Dd10GCTGAACTTAAGCATAT將我國的II型甘薯莖線蟲(Dd9和Dd10)的序列在GenBank上進行blast同源性檢索，發現與馬鈴薯腐爛莖線蟲Ditylenchus.destructor的序列(登記號AF363110)同源性最高，序列分析比對發現山東沂水(Dd9)的ITS序列的139-293位(ITS1)與GeneBank中的腐爛莖線蟲(AF363110)的ITS1序列相似性高達96.8％，只有4個鹼基的差異；而江蘇銅山(Dd10)與其相似性則為92.1％。將Dd9和Dd10序列進行比對發現，它們的ITS序列相似性達96.5％。因此可以確認山東沂水(Dd9)和江蘇銅山(Dd10)的甘薯上的莖線蟲為馬鈴薯腐爛莖線蟲(Ditylenchus.destructor)根據馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性ITS序列分析比對結果，構建了一個我國甘薯上的馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異引物，命名為SSsj，引物序列為SSsj5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTT-3′下遊引物採用通用引物AB28，引物序列為AB285』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3』預期SSsj與AB28的擴增區域為ITS序列的292-917位，長度為623bp。
實施例2馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性標記引物與通用引物(D3A和D3B)一步雙重PCR檢測方法本發明採用一步雙重PCR方法，將上述特異性引物SSsj和AB28相結合擴增馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性片段，同時為防止假陰性反應，在PCR反應體系中加入核糖體基因28S的D3區域的通用引物D3A和D3B作內標，利用一步雙重PCR方法檢測危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲，相同樣品的一步雙重PCR至少重複四次以證實研究結果，增加可靠性。
馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性引物SSsj與通用引物AB28及核糖體DNA28S基因D3擴展區通用引物D3A和D3B的序列如下上遊引物SSsj5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTT-3′下遊引物AB285』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3』D3A 5′-GACCCGTCTTGAAACACGGA-3′D3B 5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′預期SSsj與AB28的擴增區域為ITS序列的292-917位，長度為623bp；D3A和D3B擴增的DNA片段為345bp，本發明的馬鈴薯腐爛莖線蟲的一步雙重分子檢測方法含用20μl的PCR反應體系，配比如下10×Buffer(含Mg2+)2μl，10mM dNTP1.6μl，ddH2O 14.4μl，引物D3A(1μg/l)、D3B(1μg/l)、SSsj(1μg/l)和AB28(1μg/l)各0.2μl，Taq酶(5U/μl，Takara)0.2μl，模板DNA1μl，加ddH2O至20μl。
PCR反應擴增程序為94℃預變性5min，然後94℃1min，55℃1min，72℃30s，共計35個循環，72℃延伸10rmin。4℃條件下保存。取5μl擴增產物加1山加樣緩衝液在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，用1×TAE作為電泳緩衝液，100V下電泳40min，用EB染色，在紫光燈下觀測並照相。相同樣品的一步雙重PCR至少重複四次以證實結果的準確性。
應用兩組引物D3A和D3B及特異性引物SSsj和AB28成功地從山東省臨沂市沂水縣(Dd9)、江蘇省徐州市銅山縣(Dd10)的2個危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲群體中都擴增出623bp的特異性片段，以及345bp兩個明顯的DNA片段(圖2中10-11泳道)，而在北京大興、河北盧龍、河北撫寧、河北易縣、河北灤縣、河北灤南、山東平陰、安徽泗縣等其他8個地區的I型甘薯莖線蟲群體(Dd1-Dd8)(圖2中2-9泳道)及食菌莖線蟲群體(Dm)(圖2中1泳道Dm)中僅僅擴增出一個345bp的片段，而沒有擴增出623bp的特異性片段，也沒有其它的額外片段，說明623bp的DNA片段是危害甘薯的馬鈴薯腐爛莖線蟲種特異性片段，是馬鈴薯腐爛莖線蟲種的特異引物SSsj和通用引物AB28共同擴增的結果(圖2)。
附本發明所涉及的核苷酸序列SEQ N01馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性rDNA-ITS的全序列(樣品Dd9)1GTTTCCGTAGGTGAACCTGCTGCCGGATCATTAACGATCATACCAATCCA 5051 CTTTCAGTGGTTATATTAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGCAG 100101 GCACAGAGTAGTTGTCCCGCTCTGTATTTGTACTTGCGTTTGGGCTTGCA 150151 CTTTGCGCTATGTACTTGCGCTATGTACTTGCTCTGTGTACTTGCTCTGT 200201 GTACTTGCGCTGTGTACTTGCTTTAGAGCTTGCATTAGTGCTTGCATTAG 250251 AGCTTGCATTAGAGCTTGCATTTGTGCTTGCATTTGCGCTTGTGTTTGCT 300301 GGTGCGCTTGTGCCTGGCTAATTTGTGGGCGAAAAACGGCTTTGTTGGCC 350351 TCTAAGTTTTCCTGAGCAGTTGTATGCTTCTTTGTCCGTGGCTGTGATGA 400401 AGGAAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAGTTAATGAGCACTGGC 450451 TTTGGTGCCGCCAACACAAAACCCCAATTTTACAAATTTTTCAAGAGAAT 500501 ATTTTTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTAGATCGATGAAGAACG 550551 CAGCCAACTGCGATAATTAGTGCGAACTGCAGATATTTTGAGCACTAAAG 600601 TTTCGAATGCACATTGCGCCATTGGATTTTATCCTTTGGCACGTCTGATT 650651 CAGGGTCGTAAATACAAAACCCCAAGCTAATGGTGGTGATATGACCTGTG 700701 CGGACCGCTGTCTCTTTGGCCTAGCACGTGTTTCTTGTGCAGCCTCTTGG 750751 CCAATGTTGACATCGCTCTCACTCGAGAAAACGCTGTCCAGTGTTTGGTG 800801 ACATTGCTGTAAGTCCTAGCGATTCCTATGGACGTAAGGCTTTGAAGCCA 850851 AACGCAGAGCAGTCGATTTTTCGACCTGAATCTGACGTGATTACCCGCTG900901GCTGAACTTAAGCATAT917SEQ N02馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性rDNA-ITS的全序列(樣品Dd10)1GTTTCCGTAGGTGAACCTGCTGCCGGATCATTAACGATCATACCAATCCA 5051 CTTTCAGTGGTTATATTAGTCCTCAAAGGTGGCATGCTTCTGCCATGCAG 100101 GCACAGAGTAGTTGTCCCGCTCTGTATTTGTACTTGCGTTTGGGCTTGCA 150151 CTTTCTGCTGTGCACTTGCGCTGTGTGCTTGCGCTGTGTGCCTGCGCTGT 200201 GTGCTTGTGCTGTGTGCTTGCTTTAAAGCTTGCATTTGCGCTCGCATTAG 250251 TGCTCGCATTTGTGCTTTCATTTGTGCTTGTATTTGCGGTTGTGTTTGCT 300301 GGTGCGCTTGTGCCTGGCTAATTTGTGGGCGAAAAACGGCTTTGTTGGCC 350351 TCTAAGTTTTCCTGAGCAGTTGTATGCTTCTTTGTCCGTGGCTGTGATGA 400401 AGGAAAACGGTACGTGGTTTTCGTAATCGCGAGAGTTAATGAGCACTGGC 450451 TTTGGTGCCGCCAACACAAAACCCCATTTTTACAAATTTTTCAAGAGAAT 500501 ATTTTTAGTCTTATCGGTGGATCACTCGGCTCGTAGATCGATGAAGAACG 550551 CAGCCAACTGCGATAATTAGTGCGAACTGCAGATATTTTGAGCACTAAAG 600601 TTTCGAATGCACATTGCGCCATTGGATTTTATCCTTTGGCACGTCTGATT 650651 CAGGGTCGTAAATACAAAACCCCAAGCTAATGGTGGTGATATGACCTGTG 700701 CGGACCGCTGTCTCTTTGGCCTAGCACGTGTTTCTTGTGCAGCCTCTTGG 750751 CCAATGTTGACATCGCTCTCACTCGAGAAAACGCTGTCCAGTGTTTGGTG 800801 ACATTGCTGTAAGTCCTAGCGATTCCTATGGACGTAAGGCTTTGAAGCCA 850851 AACGCAGAGCAGTCGATTTTTCGACCTGAATCTGACGTGATTACCCGCTG900901GCTGAACTTAAGCATAT917SEQ NO3馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性引物序列上遊引物SSsj5′-TTGTGTTTGCTGGTGCGCTT-3′
權利要求
1.馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS，其特徵在於具有如SEQ NO1所示的核苷酸序列。
2.馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS，其特徵在於具有如SEQ NO2所示的核苷酸序列。
3.權利要求1或2所述的馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS的特異性引物，其核苷酸序列如SEQNO3所示。
4.馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速PCR檢測方法，其特徵在於PCR反應體系中含有權利要求3所述的特異性引物和引物AB28，所述引物AB28的核苷酸序列為5』-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3』。
5.根據權利要求4所述的馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速PCR檢測方法，所述PCR反應體系中還含有內標引物。
6.根據權利要求5所述的馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速PCR檢測方法，所述內標引物為D3A和D3B，其核苷酸序列為D3A5』-GACCCGTCTTGAAACACGGA-3』。D3B5』-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3』。
7.根據權利要求6所述的馬鈴薯腐爛莖線蟲的快速PCR檢測方法，所述快速PCR檢測為一步雙重PCR檢測。
全文摘要
本發明涉及「馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA－ITS序列、特異性檢測引物及一步雙重PCR檢測方法」。馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA－ITS，其具有如SEQ NO1或SEQ NO2所示的核苷酸序列；針對該rDNA－ITS序列設計的特異性檢測引物SSsj與通用引物AB28結合，同時加入內標引物D3A和D3B，利用一步雙重PCR方法檢測，馬鈴薯莖線蟲的PCR擴增結果能得到特異性623bp片段和345bp片段，而其它莖線蟲的PCR擴增結果只能得到345bp片段。該發明對為莖線蟲的檢疫檢驗和生產實踐中莖線蟲的識別提供快速準確的分子檢測方法，為制定莖線蟲病害綜合治理決策提供理論參考。
文檔編號C12Q1/68GK1763193SQ20051008626
公開日2006年4月26日 申請日期2005年8月19日 優先權日2005年8月19日
發明者彭德良, 楊玉文 申請人:中國農業科學院植物保護研究所