一種用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片的製作方法
2023-10-06 08:09:49 2
專利名稱：一種用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種低密度基因晶片，尤其涉及一種用於血液腦脊液病原菌檢測的rRNA寡核苷酸膜晶片，屬生物晶片技術領域。
背景技術：
長期以來，對病原菌感染的診斷主要依靠細菌培養、組織學與免疫學技術，但普遍缺乏敏感性和特異性而且費時費力，難以滿足臨床要求，尤其是敗血症和中樞神經系統感染，必須進行及時有效的抗菌素治療，才能降低死亡率和併發症；由於不同病原菌感染的治療原則大相逕庭，如果病原菌不明，臨床就難以用藥；而不少病人在發病同時或在病程中的某些時期，還可出現兩種或更多種病原菌感染，並且有些細菌難以分離培養或培養時間太長，使早期診斷更加困難。目前，檢測細菌的最敏感的方法仍然是細菌培養，這至少需要培養8h，然後再做生化及免疫學鑑定，對於之前用過抗菌素或生長緩慢的細菌如結核桿菌，所需要的時間更長。最快的檢測方法是乳膠凝集試驗，但缺乏敏感性，只有當腦脊液細菌達到105CFU以上，結果才能可靠，而多達45％的腦膜炎病人腦脊液中細菌含量少於105CFU。因此，建立一種早期平行快速診斷方法至關重要。
20世紀90年代以來，分子生物學飛速發展，為解決這一難題提供了條件，而隨著人類基因組計劃的實施，人類病原菌的測序工作也發展迅速，目前常見病原菌的rRNA基因的測序工作已基本完成，這就為病原菌的基因診斷奠定了基礎。建立在分子生物學和生物信息學基礎上的生物晶片技術，以其高度並行性、多樣性、微型化和自動化的突出特點，顯示出無可比擬的優越性，已在病原菌的基因分型和菌種鑑定以及檢測細菌抗藥基因方面進行了初步研究，顯示出了非常廣闊的應用前景，多以玻璃為基片，螢光標記探針，通過雷射共聚焦顯微鏡或電荷偶聯攝相機對螢光信號的強弱進行檢測，計算機收集螢光信號並對每個點的螢光強度數位化後進行量化分析，能夠在同一時間內分析大量的基因，但其探針費用較高，玻璃基片處理複雜；而用膜基片的檢測多用同位素標記，使該技術的應用受到限制。
發明內容
本實用新型針對現有技術的不足，提供一種用於檢測血液腦脊液病原菌的寡核苷酸膜晶片，目的在於把二十種病原菌的四十條種或屬特異性寡核苷酸同時點陣於一張膜基片上，僅通過一次雜交就可得到多種指標的反應結果，力求快速、準確的判斷出不同病原菌的感染。
本實用新型涉及的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原菌種或屬特異性寡核苷酸探針與對照的點塗層組成，其中，所述基片是帶正電荷的、任意幾何形狀的、厚度為0.1～0.5mm的尼龍膜；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；設24組，各組間相互平行排列，每組塗層分別塗布有待檢血液腦脊液病原菌的40條探針及陽性對照、陰性對照、空白對照。
其中，所述基片形狀及面積可根據探針的數量、點塗層圓面積的大小，各組陣列間的距離變化而變化。
其中，所述基片的形狀優選是長方形，面積是10.0～20.0mm×7.0～15.0mm，厚度為0.3mm。
其中，所述的點塗層每組陣列中優選由4個圓形點塗層組成，優選設24個組，分列六排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別塗布有醋酸鈣不動桿菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌的寡核苷酸探針；第二排各組塗層分別塗布有腦膜敗血性黃桿菌、死亡梭桿菌、流感嗜血桿菌、單核增多性李斯特菌的寡核苷酸探針；第三排各組塗層分別塗布有卡他莫拉球菌、結核桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、消化鏈球菌的寡核苷酸探針；第四排各組塗層分別塗布有巴斯德桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針；第五排各組塗層分別塗布有葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌的寡核苷酸探針；第六排各組塗層分別塗布有陽性對照、人DNA、HBVDNA、雙蒸水空白。
其中，所述的點塗層面積的大小，可以根據圓形點塗層的直徑，各組間的距離變化而變化；陣列的排列和分布數量可以根據待檢樣品的數目而變化。
其中，所述的圓形點塗層直徑優選為200μm，組內點間距優選為400μm，各組間的距離優選為1600μm時，檢測陣列面積為13.0×8.0mm，一張膜基片上只設置1個檢測陣列。
其中，所述的圓形點塗層優選平行緊密排列成兩排，其中上排為寡核苷酸探針1，下排為寡核苷酸探針2；所述的寡核苷酸探針1或2是根據細菌rRNA可變區設計的種或屬特異性探針，長度為18-25mer，濃度為25mmol/L；其中，寡核苷酸探針1或2的選擇是依據檢測目的在細菌rRNA的不同可變區的18-25mer中分段選定。
其中，上述晶片的檢測區域是採用地高辛標記病原菌的擴增產物，酶聯的抗地高辛抗體及NBT/BCIP顯色，普通掃描儀掃描分析結果，僅通過一次雜交即可得到多種指標的反應結果。
本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片在應用中，反應條件一致，簡便快速敏感特異，能準確的判斷出不同病原菌的感染，大大提高了檢測的速度和效率，具有快速、高效、準確、平行診斷的特點，為臨床用藥、治療提供重要依據。
利用本實用新型涉及的檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片具有以下優越性(1)簡便快速該方法以尼龍膜為載體，探針不加修飾，不需要特殊的檢測設備，其價格低廉，操作簡便。以rRNA通用引物將標本行體外擴增2小時，再與膜微陣列雜交0.5小時，顯色1.5小時，結果掃描分析1小時，共5小時即可將病原菌鑑定到種或屬的水平。
(2)敏感特異以rRNA通用引物將標本行體外擴增的靈敏度可達0.1pg，地高辛標記的膜微陣列雜交檢測的敏感度可達0.1pg，以該引物擴增人DNA、B肝病毒DNA、白色念珠菌DNA無目的帶產生，rRNA基因的寡核苷酸探針可與其相應的細菌基因組DNA發生特異性結合。
(3)準確可靠探針設計過程是根據細菌rRNA基因的可變區，經計算機軟體設計，在國際生物技術信息中心(NCBI)公共序列庫BLAST上比對後，確定最佳的針對每種細菌的特異性核酸序列作為該細菌特異的寡核苷酸探針，然後點在尼龍膜上，固定後進行雜交，其結果準確可靠。
(4)使用安全該方法可用於檢測各種臨床標本，包括血、腦脊液、胸腹腔積液、尿液以及各種膿性分泌物。而且使用材料試劑安全，無放射性物質汙染。
總之，使用該實用新型進行血液腦脊液病原菌的檢測，具有樣品用量少、省時、省力、準確度高的特點。
圖1檢測血液腦脊液病原菌rRNA膜晶片的點樣陣列圖。
第一排為醋酸鈣不動桿菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌的寡核苷酸探針；第二排為腦膜敗血性黃桿菌、死亡梭桿菌、流感嗜血桿菌、單核增多性李斯特菌的寡核苷酸探針；第三排為卡他莫拉球菌、結核桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、消化鏈球菌的寡核苷酸探針；第四排為巴斯德桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針；第五排為葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌的寡核苷酸探針；第六排為陽性對照、人DNA、HBVDNA、雙蒸水空白。
圖2大腸桿菌DNA檢測呈陽性圖示。
圖3腦膜炎雙球菌DNA檢測呈陽性圖示。
具體實施方式
實施例1下面結合圖1檢測血液腦脊液病原菌rRNA膜晶片的點樣陣列圖，對本實用型的檢測血清腦脊液病原菌rRNA膜晶片作進一步的描述。
本實用新型涉及的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原菌種或屬特異性寡核苷酸探針與對照的點塗層組成，其中，所述基片是帶正電荷的、長方形的、面積是20.0mm×15.0mm，厚度為0.3mm的尼龍膜；所述的點塗層每組陣列中優選由4個圓形點塗層組成，優選設24個組，分列六排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別塗布有醋酸鈣不動桿菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌的寡核苷酸探針；第二排各組塗層分別塗布有腦膜敗血性黃桿菌、死亡梭桿菌、流感嗜血桿菌、單核增多性李斯特菌的寡核苷酸探針；第三排各組塗層分別塗布有卡他莫拉球菌、結核桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、消化鏈球菌的寡核苷酸探針；第四排各組塗層分別塗布有巴斯德桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針；第五排各組塗層分別塗布有葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌的寡核苷酸探針；第六排各組塗層分別塗布有陽性對照、人DNA、HBVDNA、雙蒸水空白。
其中，所述的圓形點塗層直徑為200μm，組內點間距為400μm，各組間的距離為1600μm時，檢測陣列面積為13.0×8.0mm，一張膜基片上只設置1個檢測陣列。
其中，所述的圓形點塗層優選平行緊密排列成兩排，其中上排為寡核苷酸探針1，下排為寡核苷酸探針2；所述的寡核苷酸探針1或2是根據細菌rRNA可變區設計的種或屬特異性探針，長度為20mer，濃度為25mmol/L。
其中，上述晶片的檢測區域是採用地高辛標記病原菌的擴增產物，酶聯的抗地高辛抗體及NBT/BCIP顯色，普通掃描儀掃描分析結果，僅通過一次雜交即可得到多種指標的反應結果。
實施例2膜基片的處理與寡核苷酸探針的固定，如圖1為檢測血清腦脊液病原菌rRNA膜晶片的點樣陣列圖。
剪一帶正電荷的、長方形的、面積是20.0mm×15.0mm、厚度為0.2mm的尼龍膜，用Pixsys 5500晶片自動點樣儀，接觸式點樣，以無菌雙蒸水稀釋寡核苷酸探針，點樣針從384孔板吸出病原菌探針及對照後直接點印在膜上，將膜的DNA面朝上於紫外交聯儀4500焦耳交聯3min，以固定DNA，室溫保存備用。用前以雜交液漂洗15min以除去未結合的寡核苷酸。點陣形式為四點矩形陣列，點直徑為200μm，組內點間距為400μm，各組間的距離為1600μm時，陣列大小為13.0mm×8.0mm；點樣後將膜的DNA面朝上於紫外交聯儀4500焦耳交聯3min，以固定DNA，室溫保存備用。
用於檢測血液腦脊液病原菌rRNA膜晶片，是將如實施例1所述的20種40條病原菌特異性的寡核苷酸及陽性對照、陰性對照、空白對照點陣於尼龍膜上，其中空白對照用雙蒸水，陰性對照用人DNA、HBVDNA，陽性對照用地高辛標記的PCR產物，如圖1所示。
實施例3探針與靶基因的雜交檢測。
將點有探針的膜用雜交液(5×SSC/0.5％SDS)漂洗15min以除去未結合的寡核苷酸，將10μ1地高辛標記的PCR產物置於擴增儀中98℃，10min，迅速冰浴5min，與55℃預溫的雜交液100μl混合，於雜交室內55℃雜交30min。用2×SSC/0.1％SDS洗膜2次×5min，0.2×SSC/0.1％SDS洗膜2次×5min，通過免疫顯色，普通掃描儀掃描信號，分析檢測結果。
如圖2大腸桿菌DNA檢測陽性圖示，圖3腦膜炎雙球菌DNA檢測陽性圖示。
權利要求1.一種用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原菌種或屬特異性寡核苷酸探針與對照的點塗層組成，其特徵在於，所述基片是帶正電荷的、任意幾何形狀的、厚度為0.1～0.5mm的尼龍膜；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；設24組，各組間相互平行排列，每組塗層分別塗布有待檢血液腦脊液病原菌的40條探針及陽性對照、陰性對照、空白對照。
2.如權利要求1所述的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，其特徵在於，所述基片形狀及面積可根據探針的數量、點塗層圓面積的大小，各組陣列間的距離變化而變化。
3.如權利要求2所述的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，其特徵在於，所述基片的形狀是長方形，面積是10.0～20.0mm×7.0～15.0mm，厚度為0.3mm。
4.如權利要求1所述的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，其特徵在於，所述的點塗層每組陣列中由4個圓形點塗層組成，設24個組，分列六排，相互平行排列；自上而下，自左至右數，第一排各組塗層分別塗布有醋酸鈣不動桿菌、脆弱擬桿菌、大腸桿菌、腸球菌的寡核苷酸探針；第二排各組塗層分別塗布有腦膜敗血性黃桿菌、死亡梭桿菌、流感嗜血桿菌、單核增多性李斯特菌的寡核苷酸探針；第三排各組塗層分別塗布有卡他莫拉球菌、結核桿菌、腦膜炎奈瑟氏菌、消化鏈球菌的寡核苷酸探針；第四排各組塗層分別塗布有巴斯德桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的寡核苷酸探針；第五排各組塗層分別塗布有葡萄球菌、無乳鏈球菌、沙門氏菌、肺炎鏈球菌的寡核苷酸探針；第六排各組塗層分別塗布有陽性對照、人DNA、HBVDNA、雙蒸水空白。
5.如權利要求1或4所述的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，其特徵在於，所述的點塗層面積的大小，可以根據圓形點塗層的直徑，各組間的距離變化而變化；陣列的排列和分布數量可以根據待檢樣品的數目而變化。
6.如權利要求5所述的用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，其特徵在於，所述的圓形點塗層直徑為200μm，組內點間距為400μm，各組間的距離為1600μm時，檢測陣列面積為13.0×8.0mm，一張膜基片上只設置1個檢測陣列。
專利摘要本實用新型公開了一種用於檢測血液腦脊液病原菌的rRNA膜晶片，由基片和陣列式分布於基片之上的病原菌種或屬特異性寡核苷酸探針與對照的點塗層組成，其中，所述基片是帶正電荷的、任意幾何形狀的、厚度為0.1～0.5mm的尼龍膜；所述點塗層的形狀為圓形，每組陣列設2～6個點塗層，平行緊密排列成兩排；設24組，各組間相互平行排列，每組塗層分別塗布有待檢血液腦脊液病原菌的40條探針及陽性對照、陰性對照、空白對照。本實用新型的晶片可同時平行檢測多種病原菌的感染，具有快速、高效、準確、平行診斷的特點。
文檔編號G01N21/00GK2771862SQ20052008161
公開日2006年4月12日 申請日期2005年3月22日 優先權日2005年3月22日
發明者韓金祥, 劉毅 申請人:山東省醫藥生物技術研究中心