產氣莢膜梭菌的快速檢測方法及檢測引物組和檢測試劑盒的製作方法

2023-10-05 18:13:44 1

專利名稱：產氣莢膜梭菌的快速檢測方法及檢測引物組和檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明屬微生物檢測領域，涉及一種產氣莢膜梭菌快速檢測方法及其檢測引物組 和檢測試劑盒。
背景技術：
產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)是一種能引起人食物中毒、抗生素相 關性腹瀉和動物腹瀉等疾病的重要病原菌。該菌是一種革蘭氏陽性產芽胞專性厭氧桿菌， 廣泛存在於自然界的土壤、水源及人和動物腸道中。研究發現，該菌至少可以產生15種以 上的毒素，目前根據產氣莢膜梭菌產生的四種重要的致病性毒素(α、β、ε、ι毒素)能 力，將其分為A、B、C、D和E五種類型，各型產氣莢膜梭菌均產生α-毒素，所以α-毒素被 認為是最基本、最重要的致病因子。對人致病的主要是A型產氣莢膜梭菌，也有少數為C型， 其中由A型產氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國等西方國家居前三位。在我國，隨著社會 的發展、人們生活節奏的加快及海內外文化交流的增加，人們生活方式也發生了許多變化， 生冷食品、罐頭製品等擺上了餐桌，產氣莢膜梭菌對食品的汙染也是引起人食物中毒和腹 瀉的一個重要原因。目前食品檢測過程中主要以平板分離鑑定為主對該菌進行檢測，操作 均較為複雜，且耗時長，不能及時做出判斷。同時，由於該菌為厭氧菌，培養時對環境要求較 高，隨著檢測環節的增加，其準確性受到一定限制。隨著分子生物學技術的快速發展，環介 導等溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)已逐步應用於食源性 致病菌的檢測。LAMP方法是一種新型的恆溫核酸擴增技術，該技術主要利用4種不同的特異性引 物識別靶DNA上6個特定區域，並利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(BstDNA)，在恆溫 條件下快速擴增核酸，保證了擴增的高特異性和高效率。由於LAMP獨特的核酸擴增機制， 它的產物是由多重複靶序列的莖一環狀DNA和花椰菜狀DNA所組成的混合物，在瓊脂糖凝 膠電泳上會呈現出LAMP反應典型的階梯狀條帶；同時，核酸大量生成時，從dNIPs中析出 的焦磷酸根離子與反應體系中的Mg2+結合，產生肉眼可見的擴增反應副產物-白色焦磷酸 鎂沉澱；另外，由於擴增產物大量生成，加入螢光染料(如Syber Green I、溴化乙錠、Gel Red等)。因此LAMP擴增結果不但觀察方式多樣，且結果鑑定簡單，非常適合高通量的快速 檢測。鑑於LAMP技術有眾多優勢，現已被用於病原微生物的檢測，如分支桿菌屬、阪崎 腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等。現尚未見有LAMP應用於產氣莢膜梭菌檢測的相關 報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種產氣莢膜梭菌的快速檢測方法及檢測引物組和檢測試劑盒。為實現上述目的，本發明所採取的技術方案是所述產氣莢膜梭菌的檢測引物組的外引物的上遊引物具有如SEQ No. 1所示的序列；其外引物的下遊引物具有如SEQ No. 2 所示的序列；其內引物的上遊引物具有如SEQ No. 3所示的序列；其內引物的下遊引物具有 如SEQ No. 4所示的序列。本發明利用所述引物組對待測樣品的DNA進行LAMP反應，反應結束後對反應液進 行陰陽性判定。進一步地，所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種方案進行第一種方案所述LAMP反應在59. 5-62. 5°C下反應50_70min ；第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟(1)先在 59. 5-62. 5°C下反應 50_70min ；(2)後在 80°C下反應 6_12min。進一步地，本發明在進行所述LAMP反應的反應液中，包含濃度均為0. 15-0. 25 μ M 的所述外引物的上遊引物和下遊引物、濃度均為0. 6-1. ομ M的內引物的上遊引物和下 遊引物，濃度為0. 6-0. 7Μ的甜菜鹼溶液，濃度為4. 8-6. 4mM的MgSO4,10 % (體積)的 10 X BstDNA聚合酶緩衝液，濃度為0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各濃度為0. 6-1. OmM的 三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸(dGTP)、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸(dATP)、三磷酸胸腺嘧啶脫氧 核苷酸(dTTP)、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸(dCTP)。本發明使用權利要求1所述引物組的一種快速檢測試劑盒包括所述引物組、陽性 對照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩衝液、MgSO4溶液、甜菜鹼溶液和無菌超純水， 所述陽性對照品為產氣莢膜梭菌的基因組DNA。本發明使用權利要求1所述引物組的另一種快速檢測試劑盒在其LAMP反應液 中包含有所述引物組、陽性對照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩衝液、MgSO4 溶液、甜菜鹼溶液和無菌超純水的混合液，所述外引物的上遊引物和下遊引物的度均為 0. 15-0. 25 μ M，內引物的上遊引物和下遊引物的濃度均為0. 6-1.0 μ Μ，甜菜鹼的濃度為 0. 6-0. 7Μ，MgSO4的濃度為4. 8-6. 4mM，10 X BstDNA聚合酶緩衝液與所述混合液的體積 比為10%，BstDNA聚合酶的濃度為0. 2-0. 4U/μ L的，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸 腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為 0. 6-1. OmM0與現有技術相比，本發明的有益效果是1、本發明是根據已公開的產氣莢膜梭菌(Pa基因序列，分析設計得到本發明的產 氣莢膜梭菌特異性LAMP檢測引物組，特異性強，能準確檢測產氣莢膜梭菌基因組DNA。2、本發明的快速檢測方法能快速高效擴增產氣莢膜梭菌基因組DNA目的片段，整 個LAMP擴增過程可在1小時內完成，擴增產物得率高，對產氣莢膜梭菌的檢測準確、迅速、 簡便、高效。3、在本發明的快速檢測方法中，LAMP擴增反應可在恆定溫度下完成，且允許的溫 度波動範圍較大(士 1.5°C )，因此對溫控的儀器設備要求不高，水浴器或板式加熱器均可 滿足要求。4、本發明的快速檢測方法靈敏度高，擴增模板產氣莢膜梭菌基因組DNA濃度僅需
IOfg/μ Lo5、本發明的快速檢測方法結果判定簡便，且可根據實驗室實際條件採用不同的結果判定方式，方法適應性較強。6、與常規的平板培養法相比，本發明的快速檢測方法可大大縮短檢測周期，減少 檢測環節，從而降低因檢測環節過多而導致產氣莢膜梭菌因接觸空氣而死亡的機率，使檢 測結果更為準確可靠。


圖1顯示了產氣莢膜梭菌LAMP反應產物經離心後的情況。圖2顯示了產氣莢膜梭菌LAMP反應產物經STOR Green I染色後，在紫外燈下觀
察的結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步闡述，但並不對本發明做任何限定。實施例1產氣莢膜梭菌PCR檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、PCR 反應2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌外引物的上下遊引物，其中，上遊引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列，下遊引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列。2. 2、PCR 反應體系PCR 反應體系為DNA 聚合酶 0. 05U/ μ L, dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 2mM, MgSO4 2mM, 10% (體積)的10 XDNA聚合酶緩衝液，引物F3和B3各0. 5 μ Μ,模板DNA 1 μ L。2.3、PCR 反應條件應用PCR 儀，PCR 反應條件為95°C 5min，95°C 30s，55°C 30s, 72°C 30s，30 個循 環，72°C 5min，4°C保存。2.4、結果觀察將反應液直接進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為0.5XTBE、2.0%瓊脂糖凝膠、 150V電壓條件下電泳30min，自動凝膠成像系統下成像觀察結果。電泳結果可見與預期分 子量(214bp) —致的明亮片段，說明本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與PCR檢測結果一 致。 實施例2產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測Mg2+濃度測試本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。
1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系分別應用不同的Mg2+濃度分別建立6組LAMP反應體系。反應體系的總體積為 25 μ L，各反應體系均包含外引物F3和Β3各0. 2 μ Μ、內引物FIP和BIP 0. 8 μ Μ、甜菜鹼溶 液 0. 65MU0% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM,BstDNA 聚合酶0. 3U/yL，模板DNA 1 μ L ；在6組反應體系中，MgSO4濃度分別採用2. 4mM、3. 2mM、 4mM、4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM ；反應體系的剩餘體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應條件為反應溫度為61°C，反應時間為60min ；終止反應的 溫度為80°C，反應時間為6min。2. 4、反應結果觀察將反應產物進行電泳分析，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條 件下電泳30min。圖 2 中，泳道 M 為 DNA Marker,泳道 1-6 的 Mg2+ 濃度分別為2. 4mM、3. 2mM、4mM、 4. 8mM、5. 6mM、6. 4mM。從圖2中可發現，當Mg2+濃度為4. 8-6. 4mM時，反應結果較為明亮，因 此本發明方法中，Mg2+最優反應濃度為4. 8-6. 4mM。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例3產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測靈敏度測試本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系建立9個反應管，反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3 各 0. 2 μ Μ、內引物FIP 和 BIP 0. 8 μ M,MgS04 5. 6mM、甜菜鹼 0. 65M、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3U/ μ L。各反應管還需加入模板DNA液1 μ L，所用模板DNA液濃度分別為IOng/ μ L、lng/ μ L、IOOpg/ μ L、IOpg/ μ L、lpg/ μ L、IOOfg/ μ L、IOfg/ μ L、lfg/ μ L、0. Ifg/ μ L，以測試該檢測方法的靈敏度。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應條件為反應溫度為61°C，反應時間為60min ；終止反應的 溫度為80°C，反應時間為6min。2. 4、反應結果觀察將反應產物進行電泳分析，電泳條件為0. 5XTBE、2. 0%瓊脂糖凝膠、150V電壓條 件下電泳30min。通過對反應產物的電泳分析，當模板DNA液的濃度降至IOfg/ μ L時，仍可見較為 明亮的反應產物。說明本方法的檢測靈敏度為10fg/yL。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例4產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。1. 3、同時準備12種非產氣莢膜梭菌菌種DNA作為陰性對照。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各為0. 15μΜ、內 引物 FIP 和 BIP 各為 0·6μΜ、MgSO4 4. 8mM、甜菜鹼 0· 6Μ、10 % (體積)IOXBstDNA 聚合酶 緩衝液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各為 0. 6mM、BstDNA 聚合酶為 0. 2U/ μ L,模板 DNA 為 1 μ L ； 剩餘體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應分別採用以下條件進行。2. 3. 1反應溫度為59. 5°C，反應時間為50min ；終止反應的溫度為80°C，反應時間 為 6min。2. 4、反應結果觀察將反應液在6000rpm條件下離心5min，樣品管底部呈現明顯沉澱，說明本實施例
樣品中存在產氣莢膜梭菌。圖1顯示各反應管離心後沉澱情況。其中1號和9號管為待測樣品DNA的反應管， 其餘12個反應管為非產氣莢膜梭菌菌種DNA的反應管。在肉眼觀察下，1號和9號管底部呈現明顯沉澱，說明本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。其餘12管底部未呈現沉澱，證明 該方法檢測特異性良好。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。 實施例5產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。1. 3、同時準備12種非產氣莢膜梭菌菌種DNA作為陰性對照。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3的濃度各為 0. 2 μ Μ、內引物 FIP 和 BIP 為 0. 8 μ M、MgS04 5. 6mM、甜菜鹼 0. 65MU0% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、dATP、dTTP、dGTP、dCTP的濃度各為0. 8mM、BstDNA聚合酶0. 3υ/μ L，模板 DNA IyL;剩餘體積以無菌超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應溫度為61°C，反應時間為60min ；終止反應的溫度為80°C， 反應時間為9min。2. 4、反應結果觀察在反應液中加入染料STOR Green I，樣品反應管在紫外燈下呈現明顯螢光。說明 本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。圖2顯示各反應管在加入STOR Green I後螢光情況。其中1號和2號管為待測 樣品DNA的反應管，其餘12管為非產氣莢膜梭菌菌種DNA的反應管。在肉眼觀察下，1號 和2號管呈現明顯螢光，說明本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。其餘12管未呈現明顯熒 光，證明該方法檢測特異性良好。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例6產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、內引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜鹼 0. 7Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩餘體積以無菌 超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應溫度為62. 5°C，反應時間為70min ；終止反應的溫度為 80°C，反應時間為12min。2. 4、反應結果觀察在反應液中加入染料STOR Green I，樣品反應管在紫外燈下呈現明顯螢光。說明 本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例7產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 15μΜ、內引 物 FIP 和 BIP 0. 6 μ M^MgSO4 4. 8mM、甜菜鹼 0. 6Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 6mM,BstDNA 聚合酶 0. 2U/ μ L,模板 DNAl μ L。剩餘體積以無菌 超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應溫度為59. 50C，反應時間為50min。
2. 4、反應結果觀察將反應液在6000rpm條件下離心5min，樣品管底部呈現明顯沉澱。說明本實施例 樣品中存在產氣莢膜梭菌。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例8產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No.2所示的核苷酸序列；內引 物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 2μΜ、內引 物 FIP 和 BIP 0. 8 μ M^MgSO4 5. 6mM、甜菜鹼 0. 65Μ、10% (體積)10 X BstDNA 聚合酶緩衝液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 0. 8mM、BstDNA 聚合酶 0. 3U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩餘體積以無菌 超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應溫度為61°C，反應時間為60min。2. 4、反應結果觀察在反應液中加入染料STOR Green I，樣品反應管在紫外燈下呈現明顯螢光。說明 本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例9產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測本實施例採用灌溉用水作為檢測樣品，具體檢測步驟為1、樣品DNA的提取1. 1、取ImL待檢測水樣至9mL皰肉液體培養基，封口後應用Mart II厭氧系統 360C 士 1°C培養M小時。1. 2、應用細菌基因組DNA提取試劑盒提取培養產物中細菌DNA。2、LAMP快速檢測2. 1、人工合成產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物組，外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列。2. 2、LAMP 反應體系反應體系總體積為25 μ L，體系的組成及濃度為外引物F3和Β3各0. 25 μ Μ、內引 物 FIP 和 BIP 1. OyM^MgSO4 6. 4mM、甜菜鹼 0. 7Μ、10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液、 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 各 1. OmM, BstDNA 聚合酶 0. 4U/ μ L,模板 DNAl μ L ；剩餘體積以無菌 超純水補充。2. 3、LAMP 反應條件應用恆溫水浴器，反應溫度為62. 50C，反應時間為70min2. 4、反應結果觀察在反應液中加入染料STOR Green I，樣品反應管在紫外燈下呈現明顯螢光。說明 本實施例樣品中存在產氣莢膜梭菌。2. 5、結果驗證採用常規平板檢測方法對樣品進行檢測，檢出產氣莢膜梭菌，與LAMP檢測結果一 致。實施例10產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測試劑盒本實施例試劑盒由如下試劑組成1、產氣莢膜梭菌LAMP檢測引物，包括外引物的上遊引物F3，具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3，具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引物的上遊引物FIP，具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP，具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、BstDNA 聚合酶；3、陽性對照品產氣莢膜梭菌的標準菌株的基因組；4、空白對照品無菌超純水；5、10 X BstDNA聚合酶緩衝液；6、MgSO4 溶液；7、甜菜鹼溶液。8、顯色劑SYBR Green I ；實施例11產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測試劑盒本實施例試劑盒由如下試劑組成1、產氣莢膜梭菌LAMP檢測反應液，其具體組成及濃度為外引物F3和B3均0.2 μ M，內引物FIP和BIP 0. 8 μ M, MgSO4 5. 6mM，甜菜鹼溶液 0. 65M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 8mM,BstDNA 聚 合酶0. 3U/yL;其中，外引物的上遊引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引物的上遊引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；
2、陽性對照品產氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對照品無菌超純水；4、顯色劑SYBR Green I。實施例12產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測試劑盒本實施例的試劑盒由如下試劑組成1、產氣莢膜梭菌LAMP檢測反應液，其具體組成及濃度為外引物F3和B3均0. 15 μ M，內引物FIP和BIP 0. 6 μ MjMgSO4 4. 8mM，甜菜鹼溶液 0. 6M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 0. 6mM、BstDNA 聚 合酶0. 2U/yL;其中，外引物的上遊引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引物的上遊引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、陽性對照品產氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對照品無菌超純水；實施例13產氣莢膜梭菌LAMP快速檢測試劑盒本實施例的試劑盒由如下試劑組成1、產氣莢膜梭菌LAMP檢測反應液，其具體組成及濃度為外引物F3禾口 B3均0.25 μ M，內引物FIP禾口 BIP 1. OyMjMgSO4 6. 4mM，甜菜鹼溶液 0. 7M, 10% (體積)IOXBstDNA 聚合酶緩衝液，dATP、dTTP、dGTP、dCTP 均 1. OmM, BstDNA 聚 合酶0. 4U/yL;其中，外引物的上遊引物F3具有如SEQ No. 1所示的核苷酸序列；外引物的下遊引物B3具有如SEQ No. 2所示的核苷酸序列；內引物的上遊引物FIP具有如SEQ No. 3所示的核苷酸序列；內引物的下遊引物BIP具有如SEQ No. 4所示的核苷酸序列；2、陽性對照品產氣莢膜梭菌基因組DNA ；3、空白對照品無菌超純水。
權利要求
1.一種產氣莢膜梭菌的檢測引物組，其特徵是其外引物的上遊引物具有如SEQ No. 1 所示的序列，其外引物的下遊引物具有如SEQ No. 2所示的序列；其內引物的上遊引物具有 如SEQ No. 3所示的序列，其內引物的下遊引物具有如SEQ No. 4所示的序列。
2.一種使用權利要求1所述的引物組對產氣莢膜梭菌進行快速檢測的方法，其特徵 是利用所述引物組對待測樣品的DNA進行LAMP反應，反應結束後對反應液進行陰陽性判 定。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵是所述LAMP反應按以下第一種方案或第二種 方案進行第一種方案所述LAMP反應在59. 5-62. 5°C下反應50_70min ；第二種方案所述LAMP反應包含以下步驟(1)先在59. 5-62. 5°C下反應 50_70min ；(2)後在80°C下反應6-12min。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特徵是在進行所述LAMP反應的反應液中，包含 濃度均為0. 15-0. 25 μ M的所述外引物的上遊引物和下遊引物、濃度均為0. 6-1. 0μ M的所 述內引物的上遊引物和下遊引物，濃度為0. 6-0. 7Μ的甜菜鹼，濃度為4. 8-6. 4mM的MgS04， 10% (體積)的IOXBstDNA聚合酶緩衝液，濃度為0. 2-0. 4U/ μ L的BstDNA聚合酶，各濃 度為0. 6-1. OmM的三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶 脫氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸。
5.一種使用權利要求1所述引物組的快速檢測試劑盒，其特徵在於包括所述引物組、 陽性對照品、BstDNA聚合酶、IOXBstDNA聚合酶緩衝液、MgSO4溶液和甜菜鹼溶液和無菌超 純水，所述陽性對照品為產氣莢膜梭菌的基因組DNA。
6.一種使用權利要求1所述引物組的快速檢測試劑盒，其特徵在於在其LAMP反應液 中包含有所述引物組、BstDNA聚合酶、10 XBstDNA聚合酶緩衝液、MgSO4溶液、甜菜鹼溶液 和無菌超純水的混合液，所述外引物的上遊引物和下遊引物的度均為0. 15-0. 25μΜ，內引 物的上遊引物和下遊引物的濃度均為0. 6-1. 0 μ Μ,甜菜鹼的濃度為0. 6-0. 7Μ，MgSO4的濃 度為4. 8-6. 4mM, IOXBstDNA聚合酶緩衝液與所述混合液的體積比為10%，BstDNA聚合酶 0. 2-0. 4U/μ L，三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脫氧 核苷酸和三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸的濃度各為0. 6-1. OmM。
全文摘要
本發明公開一種產氣莢膜梭菌檢測方法及其引物組和檢測試劑盒。該引物組是基於環介導等溫擴增技術(LAMP)，根據產氣莢膜梭菌特有的α毒素(C.perfringensalphatoxin，CPa)基因序列分析設計並人工合成獲得，包含的核苷酸序列如SEQ No.1-4所示，該引物組對產氣莢膜梭菌具有很高特異性。該產氣莢膜梭菌快速檢測方法利用上述檢測引物組對樣品中產氣莢膜梭菌DNA進行LAMP反應，通過對反應產物的鑑定來判斷樣品中是否含有產氣莢膜梭菌。本發明還依據上述檢測方法設計了產氣莢膜梭菌快速檢測試劑盒，可對樣品進行快速、簡便、準確、高效的產氣莢膜梭菌檢測鑑定。
文檔編號C12Q1/68GK102134590SQ20101059069
公開日2011年7月27日 申請日期2010年12月7日 優先權日2010年12月7日
發明者姜侃, 張東雷, 金燕飛, 陳小珍, 魯燕驊 申請人:浙江省質量技術監督檢測研究院