水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝的製作方法
2023-10-04 01:11:29 6
專利名稱：水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及利用高山被孢黴(Mortierella alpina)生產花生四烯(Arachidonic acid，簡稱ARA)油脂的工藝，屬於生物工程領域。具體地說，利用生物酶破碎高山被孢黴的 細胞壁，從而提取花生四烯酸油脂的方法，是生物工程下遊過程中分離提取的技術領域。
背景技術：
花生四烯酸(Arachidonic acid，ARA，即5，8，11，14-二十碳四烯酸)屬於ω-6系 列長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)，是一種人體最活躍和必需的多不飽和脂肪酸，具有促進智 力發育、提高人體視力、降低血脂、增強免疫力和抗癌等功效，被廣泛應用於功能保健、生物 醫藥、化妝品及飼料添加劑等方面。由於花生四烯酸油脂在成年人體內合成量極少，嬰幼兒 體內則無法合成，因此從食物中攝取額外的花生四烯酸油脂對人體許多組織特別是腦組織 的生長發育至關重要。花生四烯酸油脂的傳統來源是從動物肝臟、豬腎上腺、血液、魚油中提取，但動物 組織中的花生四烯酸油脂含量很低(約為0.2% )，來源少，且受季節限制，價格昂貴，無 法滿足日益增長的市場需求。微生物合成花生四烯酸油脂以生產周期短、環境汙染小、 原料來源廣泛、可持續發展性強和產品質量好等優點逐漸替代了傳統花生四烯酸油脂的 製備方法，其中以高山被孢黴(Malpina)的花生四烯酸油脂含量最高(Higashiyama K， Biotechnology and Bioprocess Engineering，2002，7 :252_262)，且利用高山被孢黴生產 花生四烯酸油脂已經實現工業化。因此，花生四烯酸油脂的提取工藝成為微生物合成法工 業化生產的一個必要環節。從高山被孢黴中提取花生四烯酸油脂的方法主要有(1)索式提取法，發酵液抽 濾集菌，烘乾研碎，裝入索式提取器，正己烷加熱回流提取十二小時，旋轉蒸發去除正己烷 即得油脂。(2)有機溶劑萃取法，發酵液抽濾集菌，按一定比例加入有機溶劑(常用的有石 油醚，乙醇 正己烷，氯仿 甲醇，乙醚)，振蕩混勻，離心取有機相，蒸發去除有機溶劑即得 油脂。(3)超聲波提取法，發酵液超聲波破解細胞壁，加入機溶劑萃取，離心取有機相，蒸發 去除有機溶劑即得油脂。(4)超臨界CO2萃取法，發酵液抽濾集菌，烘乾研碎，裝入萃取管， 超臨界狀態下分離出油脂。但是，這些油脂提取方法存在著種種缺點與不足(1)索式提取法，耗時長，冷卻 水用量大，難以批量提取，僅局限在實驗室規模的油脂提取。(2)有機溶劑法油脂收率低，油 脂品質差，對花生四烯酸而言，有機溶劑的殘留存在食用安全性的潛在問題。(3)超聲波提 取所需功率大，處理規模小，難以實現工業化。(4)超臨界CO2萃取，設備複雜，生產成本高， 僅局限在實驗室規模的油脂提取。因此，需要尋求一種油脂收率高、油脂品質高、功效高、能 耗低且易於工業化的油脂提取方法，利用水酶法對高山被孢黴菌體進行花生四烯酸油脂的 提取工藝未見文獻報導。水酶法以功效高、油脂品質高、能耗低、易於批量化處理等特點，日益得到科研界 和工業界的重視。公開號CN101307341A利用生物酶對寇式隱甲藻進行油脂提取，論證了酶解法對海藻細胞的可行性；公開號CN101531689A和CN101235399A論證了酶解法對植物細 胞的可行性。本發明以三種蛋白酶(鹼性蛋白酶，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶)以及六種多 糖水解酶(纖維素酶，木聚糖酶，果膠酶，糖化酶，澱粉酶和蝸牛酶)為研究重點，提供一種 花生四烯酸水酶法提取工藝。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，以高 效、批量化萃取花生四烯酸油脂，並通過優化工藝條件，獲得較高的油脂收率。為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案如下一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，包含如下步驟(1)培養高山被孢黴發酵生產花生四烯酸；(2)向步驟(1)得到的發酵液中，加蒸餾水稀釋1 3體積倍數製成菌體懸浮液， 加入0. 25 2. 5g/L的生物酶，調節體系pH值至生物酶的酶解反應最適pH，調節體系溫度 至生物酶的酶解反應最適溫度，進行酶解6 10h ；(3)向步驟(2)得到的酶解後的體系中，加入體系體積的10 15% (v/v)的乙醇 和20 40% (v/v)的正己烷進行油脂萃取，離心分層，取有機相；向剩下的水相和固體相 中，加入步驟(2)得到的酶解後體系體積的20 40% (v/v)的正己烷進行二次萃取，離心 分層，取有機相，合併兩次有機相；(4)旋轉蒸發收集的有機相，得到花生四烯酸油脂。其中，所述的生物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、澱粉酶、蝸牛酶、木瓜 蛋白酶、鹼性蛋白酶和中性蛋白酶中的任意一種或幾種。當所加入的生物酶為單一酶時，各種酶的酶解條件如下纖維素酶，最適pH為4. 5 5. 5，最適溫度為40 50°C ；木聚糖酶，最適pH為3. 5 5. 5，最適溫度為50 60°C ；果膠酶，最適pH為3. 5 4. 5，最適溫度為50 60°C ；糖化酶，最適pH為4.0 4. 5，最適溫度為60 62°C ；澱粉酶，最適pH為5. 5 6. 5，最適溫度為50 55°C ；蝸牛酶，最適pH為5. 8 7. 2，最適溫度為37 45°C ；木瓜蛋白酶，最適pH為5. 5 6.0，最適溫度為45 65°C ；鹼性蛋白酶，最適pH為7. 5 9.0，最適溫度為45 60°C ；中性蛋白酶，最適pH為6. 5 7. 5，最適溫度為45 60°C。當所加入的生物酶為多種酶時，採用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進行酶解的 方式，每一種酶都在其最適PH條件和最適反應溫度下進行酶解，一種酶的反應結束之後， 再加入另外一種酶。本發明對每一種酶的比例沒有任何限制，只要求所有酶的總加入量為 0. 25 2. 5g/L。本發明對每一種酶的酶解時間沒有任何限制，只要求所有酶的酶解總時間 為6 10h。有益效果本發明與現有技術相比有如下優點(1)水酶法效率高，能耗低，易於批量化大規模應用。相對於常規花生四烯酸油脂的提取方法，水酶法易於實現工業化生產，和超聲波提取相比，水酶法反應條件溫和，效率高，能耗低。和索式提取法相比，可以節約大量冷卻水 的使用。(2)水酶法反應設備簡易，成本低，適用性強。
水酶法反應設備簡單，實驗室規模可以直接使用試管或搖瓶進行油脂提取；工業 化規模可以直接使用花生四烯酸發酵生產的發酵罐進行原位酶解提取，不需要對其進行任 何改造，從而使操作成本大大降低，適用性強。(3)水酶法提取花生四烯酸油脂收率高，品質高。在水酶法提取工藝的基礎上，通過優化工藝條件，相比索式提取法(文獻報導此 法提油，收率最高)最終獲得90 100%的油脂收率，水酶法提取的油脂，呈金黃色，清澈明 亮，並且油脂中花生四烯酸相對含量相比索式提取法偏高10 15%。
圖1為本發明水酶法提取花生四烯酸油脂工藝流程圖。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。以下實施例所用的菌種為高山被孢酶(Mortierella alpine)，保藏編號為CCTCC NO :M 207067。實施例1 菌種發酵培養培養基配方如下種子培養基100g/L葡萄糖，llg/L酵母粉，8g/L玉米漿，3. 8g/L KH2PO4,初始pH 為 5. 0-6. 0。發酵培養基100g/L葡萄糖，llg/L 酵母粉，3.8g/L KH2PO4, 3. 4g/L NaNO3,0. 5g/ LMgSO4. 7H20。初始 pH 為 5. 5-6. 5。1)菌種活化在製備種子之前，採用PDA斜面進行菌種活化，並將活化的菌種轉入PDA固體培養 基中培養3 5天，以積累大量孢子備用。2)種子一次放大將生長在PDA固體培養基上的高山被孢黴的孢子用無菌水洗脫後，通過無菌操作 接入裝有種子培養基的凹槽搖瓶中。搖瓶裝液量為50ml/250ml。種子培養條件搖床轉速 為150rpm，培養溫度為25°C，培養時間為2 3天。3)種子二次放大將2)中培養的菌種通過無菌操作接入裝有種子培養基凹槽搖瓶中。凹槽搖瓶裝 液量為100mL/500mL。接種量為5% (ν/ν)，即5mL。種子培養條件搖床轉速為150rpm，培 養溫度為25°C，培養時間為3天。4)菌種發酵培養將3)中培養的菌種通過無菌操作接入裝有發酵培養基的凹槽搖瓶中。凹槽搖裝液量為100mL/500mL。接種量為10% (v/v)，即10mL。培養條件搖床轉速為150rpm，培養 溫度為25°C，培養時間為7 8天。實施例2 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，40°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇4mL和10mL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4854g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為97. 2%。實施例3 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，37°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇4. 5mL和10mL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下 的水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉 蒸發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4752g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂 收率為95. 1%0實施例4 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入蝸牛酶20mg，45°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇3mL和12mL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加12mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4823g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為96. 6%。實施例5 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節pH值為7. 2，按30mL等量分裝在50mi試管中，加入蝸牛酶20mg，40°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇3mL和6mL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的水 相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸發 得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4741g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收率 為 94. 9%。實施例6 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為8. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入鹼性蛋白酶40mg，50°C恆溫振 蕩8小時；加乙醇4mL和10mL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩 下的水相和固體相中，加10mL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋 轉蒸發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4472g，對照組索式提取法得到油脂0. 4883g，油 脂收率為91.6%。實施例7 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋3體積倍數製成菌體懸浮
6液，調節PH值為4. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入果膠酶40mg，55°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4783g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為95. 8%。表1是實施例2 7所提油脂成分分布情況。表 1 實施例8 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為4. 8，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入纖維素酶40mg，45°C恆溫振蕩 8小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4703g,對照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油脂收 率為90. 7%。實施例9 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋1體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為5. 5，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入木瓜蛋白酶40mg，55°C恆溫振 蕩8小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩 下的水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋 轉蒸發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4943g，對照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油 脂收率為95.3%。實施例10 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為7. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入中性蛋白酶40mg，50°C恆溫振 蕩8小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩 下的水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋 轉蒸發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4685g，對照組索式提取法得到油脂0. 4883g，油 脂收率為95. 9%。表2是實施例8 10所提油脂成分分布情況。表 2 實施例11 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為4. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入木聚糖酶20mg，55°C恆溫振蕩 8小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4808g,對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為96. 3%。實施例12 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為4. 5，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入糖化酶40mg，60°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4682g，對照組索式提取法得到油脂0. 5186g，油脂收 率為90. 3%。實施例13 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，調節PH值為6. 0，按30mL等量分裝在50mL試管中，加入澱粉酶60mg，55°C恆溫振蕩8 小時；加乙醇4mL和IOmL正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的 水相和固體相中，加IOmL正己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸 發得到有機溶劑和花生四烯酸油脂0. 4465g，對照組索式提取法得到油脂0. 4994g，油脂收 率為89. 4%。表3是實施例11 13所提油脂成分分布情況。表3脂肪酸種類 _ 油脂中含_ (%)_ 實施例14 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調節ρΗ值為8.0，加入鹼性蛋白酶40mg，50°C恆溫振蕩 4小時後，將pH值調為4. 0，再加入果膠酶40mg，55°C恆溫振蕩4小時；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的水相和固體相中，加IOmL正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸發得到有機溶劑和花生四 烯酸油脂0. 5238g，對照組索式提取法得到油脂0. 5422g，油脂收率為96. 6%。實施例15 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調節pH值為6. 0，加入蝸牛酶20mg，40°C恆溫振蕩4小 時後，將PH值調為7.0，再加入中性蛋白酶40mg，50°C恆溫振蕩4小時；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的水相和固體相中，加IOml正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸發得到有機溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4986g，對照組索式提取法得到油脂0. 5075g,油脂收率為98. 2 %。實施例16 按照實施例1發酵培養菌體，在發酵液中加蒸餾水稀釋2體積倍數製成菌體懸浮 液，按30mL等量分裝在50mL試管中，調節pH值為6. 0，加入蝸牛酶20mg，40°C恆溫振蕩4小 時後，將PH值調為5. 5，再加入木瓜蛋白酶60mg，55°C恆溫振蕩4小時；加乙醇4mL和IOmL 正己烷進行第一次萃取，5000rpm離心5min取有機相，向剩下的水相和固體相中，加IOml正 己烷二次萃取，5000rpm離心5min取有機相，合併有機相旋轉蒸發得到有機溶劑和花生四 烯酸油脂0. 4225g，對照組索式提取法得到油脂0. 4209g,油脂收率為100. 3 %。表4是實施 例14 16所提油脂成分分布情況。表 權利要求
一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特徵在於，該工藝包含如下步驟(1)培養高山被孢黴發酵生產花生四烯酸；(2)向步驟(1)得到的發酵液中，加蒸餾水稀釋1～3體積倍數製成菌體懸浮液，加入0.25～2.5g/L的生物酶，調節體系pH值至生物酶的酶解反應最適pH，調節體系溫度至生物酶的酶解反應最適溫度，進行酶解6～10h；(3)向步驟(2)得到的酶解後的體系中，加入體系體積的10～15％(v/v)的乙醇和20～40％(v/v)的正己烷進行油脂萃取，離心分層，取有機相；向剩下的水相和固體相中，加入步驟(2)得到的酶解後體系體積的20～40％(v/v)的正己烷進行二次萃取，離心分層，取有機相，合併兩次有機相；(4)旋轉蒸發收集的有機相，得到花生四烯酸油脂。
2.根據權利要求1所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特徵在於，所述的生 物酶為纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、糖化酶、澱粉酶、蝸牛酶、木瓜蛋白酶、鹼性蛋白酶和中 性蛋白酶中的任意一種或幾種。
3.根據權利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特徵在於當所加 入的生物酶為單一酶時，各種酶的酶解條件如下纖維素酶，最適pH為4. 5 5. 5，最適溫度為40 50°C ； 木聚糖酶，最適pH為3. 5 5. 5，最適溫度為50 60°C ； 果膠酶，最適pH為3. 5 4. 5，最適溫度為50 60°C ； 糖化酶，最適pH為4. 0 4. 5，最適溫度為60 62V ； 澱粉酶，最適pH為5. 5 6. 5，最適溫度為50 55°C ； 蝸牛酶，最適pH為5. 8 7. 2，最適溫度為37 45°C ； 木瓜蛋白酶，最適pH為5. 5 6. 0，最適溫度為45 65°C ； 鹼性蛋白酶，最適pH為7. 5 9. 0，最適溫度為45 60°C ； 中性蛋白酶，最適pH為6. 5 7. 5，最適溫度為45 60°C。
4.根據權利要求1或2所述的水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，其特徵在於當所加 入的生物酶為多種酶時，採用依次向菌體懸浮液中加入單一酶進行酶解的方式，每一種酶 都在其最適PH條件和最適反應溫度下進行酶解，一種酶的反應結束之後，再加入另外一種
全文摘要
本發明公開了一種水酶法提取花生四烯酸油脂的工藝，以高山被孢黴為出發菌株，經發酵培養後，加入蒸餾水稀釋製成菌體懸浮液，調節懸浮液pH值，加入生物酶恆溫振蕩6～10小時後，加入乙醇和正己烷進行油脂萃取，離心分層後取有機溶劑相，然後在剩下的水相和固體相中加入正己烷進行二次萃取，離心分層後合併有機溶劑相，有機溶劑相經旋轉蒸發即可得到油脂和有機溶劑。本發明具有能耗低、成本低、花生四烯酸油脂收率高、品質高、反應設備簡易，易於批量大規模應用等優點。
文檔編號C11B1/00GK101870915SQ20101021459
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者叢蕾蕾, 劉欣, 尤江英, 彭超, 紀曉俊, 路金淼, 黃和, 黎志勇 申請人:南京工業大學