表達馬鏈球菌獸疫亞種類m蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗的製作方法
2023-10-04 04:44:44 3
專利名稱：表達馬鏈球菌獸疫亞種類m蛋白的重組豬痘病毒載體疫苗的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製品領域。本發明涉及一種重組豬痘病毒載體疫苗，具體而言，涉及一種表達馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)類M蛋白(SzP)的重組豬痘病毒(rSPV-SzP)載體疫苗，該疫苗能提供針對SEZ的免疫保護作用，及減少養豬業的經濟損失。
背景技術：
gljli求胃·禾中(Streptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ) 鏈球菌病的重要病原之一，同時也是一種重要的人畜共患病病原。其引發的豬鏈球菌病曾在我國華南、西南和華東等地區廣泛流行，給我國養豬業造成較大的危害，豬鏈球菌病也是嚴重危害世界養豬業的一種重要的細菌性傳染病，並可引起人類的感染。類 M 蛋白(M_Like Protein)是馬鏈球菌獸疫亞種(Sti^ptococcus equi subsp zooepidemicus SEZ)細胞壁表面一種纖絲狀表面蛋白，是該菌重要的毒力因子和保護性抗原(Timoney J F，Walker J，Zhou M，et al. Cloning and sequence analysis of a protective M-Iike gene from streptococcus equi subsp. Zooepidemicus. Infect， Immune，1995，63 :1440-1445)。馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白(SzP)高度抗酸，具有多種生物學功會邑(Timoney JFiArliushin SC,Boschwitz JS. Comparison of the sequences and functions of Streptococcus equi M-Iike protein Sem and SzPse. Infect Immun,1997, 65(9) :3600 3605)。其表面有調理素表位，能剌激機體產生抗調理素抗體(Timoney JF， Mukhtar M. Varability in the M proteins of the equine strains of Streptococcus equi subsp zooepidemicus，P. 15 20In W. PlowrightiP D Rossdale,and J F Wade(ed)， Equine Infectious diseases VI， Cambridge 1991， R&W Publications， Newmarket, Englmd)；能抑制補體C3b在菌體表面沉積，從而抑制機體補體系統的活化(Boschwitz JS, Timoney JF. Inhibition of C3 deposition of Streptococcus equi by M protein a mechanism for survival in equine blood. Infect Immun,1994，62 :3515 3520)； 能結合機體的纖維蛋白原，使其具有抗吞噬細胞的吞噬活性(Boschwitz JS，Timoney JF. Characterization of the antiphagocytic activity of equine fibrinogen for Streptococcus, zooepidemicus. Microb Pathog，1994，17 :121 129)。類 M 蛋白與 SEZ 致病性和機體的免疫保護作用密切相關，一直是研製鏈球菌疫苗的焦點。重組痘病毒載體疫苗已經有近30年的安全應用，作為表達載體，痘病毒有許多特有的優點(1)凍幹疫苗較穩定、費用低、容易進行生產和使用。(2)疫苗有多種用藥途徑， 包括口服，尤其是針對野生動物進行免疫預防時。(3)痘病毒作為基因重組活疫苗的載體， 不需佐劑即可免疫動物，病毒在體內增殖過程中產生的外源蛋白可刺激機體產生免疫應答，不僅誘導機體產生體液免疫，而且誘導很強的細胞免疫。接種一次就能獲得長期的免疫效果，能誘導抗外來抗原的抗體和細胞毒性T細胞反應。(4)基因組容易組裝，允許大片段的基因丟失或刪除，以及外源DNA的插入.(5)重組痘病毒疫苗能區分天然感染和接種的動物並與之兼容。(6)與其它哺乳動物病毒表達載體相比，被表達的外源蛋白在感染細胞中能
3忠實地進行修飾具有較高的表達效率。通過對動物接種重組痘病毒的辦法，能了解外源蛋白對個體的作用以及機體的免疫應答。應用重組痘病毒已經成功地表達了來源於動植物，乃至人類的許多種基因。表達抗原基因的重組痘病毒作為基因重組疫苗。目前用作表達載體的痘病毒主要有痘苗病毒、禽痘病毒、山羊痘病毒等。使用豬痘病毒作為載體構建重組疫苗迄今尚無成功報導，更無利用重組豬痘病毒載體表達馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白基因的重組疫苗的相關報導。
發明內容
本發明的目的是研製一種能夠有效控制豬鏈球菌病的重組疫苗。一方面，本發明提供了一種重組豬痘病毒(rSPV-SzP)，該重組豬痘病毒是在豬痘病毒載體中插入本發明所述SzP基因重組製備得到的。在優選的實施方案中，本發明所述SzP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發明通過動物免疫試驗發現本發明提供的重組豬痘病毒能夠在免疫動物體內大量增殖，表達目的蛋白SzP，能夠誘導動物體內產生較高效價的抗體，並對免疫動物產生良好的保護作用因此，另一方面，本發明提供了一種疫苗組合物，其中含有本發明所述的重組豬痘病毒和一種或多種藥物學上可接受的載體或佐劑。該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和本發明所述的SzP基因。在一個優選實施方案中，所述的SzP基因具有如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列。在一個優選實施方案中，所述的豬痘病毒載體為VR-363。另一方面，本發明提供了本發明所述的重組豬痘病毒及含有其的疫苗組合物在製備預防和/或治療馬鏈球菌獸醫亞種引發的疾病的藥物中的用途，優選用於製備預防和/ 或治療馬鏈球菌獸醫亞種引發的豬鏈球菌病的藥物中的用途。本發明所述聯合免疫的接種途徑包括但不限於肌肉注射等。另一方面，本發明提供了一種製備重組豬痘病毒的方法，該方法包括(1)利用特異性引物對擴增馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)類M蛋白(SzP)的編碼基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭載體pUSZll/P28M中，然後通過PCR和酶切鑑定，獲得含有SzP基因的穿梭載體PUSZ11/P28S ；(3)讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZl 1/P28S與豬痘病毒同源重組，獲得重組豬痘病毒 rSPV-SzP。(4)純化重組豬痘病毒rSPV-SzP。在本發明的一個優選實施方案中，所述特異性引物對的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示在本發明的一個優選實施方案中，所述讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZl 1/P28S 與豬痘病毒同源重組具體操作為用豬痘病毒(SPV)感染PK15單層細胞，2小時後用脂質體轉染法加入穿梭載體PUSZ11/P28S，二者發生同源重組。PK15細胞在常規條件下培養4 天后，反覆凍融3次，獲得最初的重組豬竇病毒rSPV-SzP。在本發明的一個優選實施方案中，所述純化重組豬痘病毒rSPV-SzP的具體操作為將所述重組豬痘病毒rSPV-SzP經倍比稀釋，接種PK15單層細胞，使其在3_4天內形成獨立的藍色噬斑，挑取單獨的病毒噬斑，適當稀釋後再次接種PK15單層細胞，重複6次，直至最後得到的重組豬痘病毒能夠穩定遺傳。另一方面，本發明提供了一種將上述重組豬痘病毒製成疫苗的方法，該方法包括(1)將純化的重組豬痘病毒rSPV-SzP在PK15細胞上連續傳代30次，檢測其SzP 基因的表達情況，至SzP穩定表達，且重組豬痘病毒的毒價穩定在106PFU/mL。(2)在擴大培養過程中取用保存的rSPV-SzP按5M0I接種長成單層的PK15細胞， 當細胞病變達70-90%時收毒，經反覆凍融2次，即可獲得表達SzP的重組豬痘病毒載體疫
田ο有益效果1.本發明首次成功構建了表達SzP的重組豬痘病毒，該重組豬痘病毒突破了 SEZ 常規滅活疫苗和弱毒疫苗的局限性。該重組疫苗兼具弱毒疫苗的複製特性和滅活疫苗的安全性，而且對人、豬等動物沒有致病性，容易通過安全性評價。2.試驗證明，本發明構建的表達SzP的重組豬痘病毒對外源蛋白表達穩定，種毒的毒價穩定在106PFU/mL。通過小鼠免疫試驗和攻毒保護試驗證明了該重組豬痘病毒產生了針對SEZ的抗體，對ICR小鼠的免疫保護率高達62. 5%。3.重組豬痘病毒對動物不致病，並可以通過多種途徑進行傳播，能夠使混養豬發生感染。這種特性可以使沒有免疫或漏免的豬也獲得免疫，使群體的抗體水平較一致，能夠更好的抵抗外源病毒的攻擊。與現在應用的SEZ的弱毒疫苗和滅活疫苗相比，該病毒能在豬體內複製增殖並且不斷表達SzP蛋白，使機體持續受到SzP的刺激，不斷產生針對SzP的中和抗體，這樣就能對豬體提供持久的保護力，因此在SEZ的防治方面具有廣闊的應用前
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圖1為穿梭載體PUSZ11/P28S結構示意圖。其中，LF和RF分別為豬痘病毒的左、 右同源交換序列；Pll和P28為痘病毒啟動子；LacZ為報告基因；szp為目的蛋白基因圖2圖示的是免疫小鼠血清抗體效價測定結果。圖3圖示的是攻毒保護試驗結果下列實施例的給出是為了更好地理解和闡述本發明，而決不應理解為對本發明的任何限制。除另有說明外，本申請中的所有科技術語都具有與本發明所屬領域普通技術人員通常理解相同的含義。本申請中引用的任一專利、專利申請和出版物在此引入作為參考。
實施例實施例ISzP基因的擴增、克隆、鑑定和測序分析1. IPCR引物設計及合成根據SEZ標準毒株ATCC 35246的基因序列設計了一對針對SzP基因(GenBank EU624402)的特異性引物，在引物的5』端分別含有限制性內切酶BamHI和SalI的酶切位點。引物由上海invitrogen生物公司合成。SzPl 5' -gtc gac gat tct gtt gag tea get aag-3' (SEQ ID NO 1)SzP2 5' -gga tcc tta tta gtt ttc ttt gcg tct tg_3，(SEQ ID NO :2)。L2PCR 擴增取2*Taq PCR Mix 25. O μ L, SzPll. O μ L，SzP21. Ομ L, SEZ 菌(ATCC35246)液 3. O μ L，用無菌超純水補至總體積50. O μ L0在PCR儀上進行反應。循環參數為94°C預變性 5min ；94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸60s，共進行35個循環；然後72°C延伸lOmin。 PCR產物進行(g/mL)瓊脂糖凝膠電泳。1. 3PCR產物回收與純化PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳後，在紫外燈下切下含目的條帶的瓊脂糖凝膠塊，用 DNA快速回收純化試劑盒回收凝膠中的目的片段。具體操作步驟按Geneaid公司凝膠回收試劑盒的說明書進行。1. 4PCR產物酶切與純化酶切反應總體積為40 μ L =PCR 回收片段 30. OyL, 10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI 2. 0 μ L, Sail 2. Ομ L。37°C作用3. 0h，然後進行瓊脂糖凝膠電泳並用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收，方法同上。1. 5pUSZll/P28M 酶切純化酶切反應總體積為40yL :pUSZll/P28M 質粒 30. 0yL，10XT buffer 6. 0 μ L, BamHI2. OyL, Sail 2. 0 μ L。37°C作用3. Oh,然後進行瓊脂糖凝膠電泳並用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對酶切後的產物進行回收，方法同上。1. 6目的片段SzP與酶切pUSZll/P28M的連接酶切回收PCR產物6. 0μ L，載體pUSZll/P28M酶切回收產物2. 0μ L，10*Τ4連接酶緩衝液1. 0 μ L，T4DNA連接酶1. 0 μ L，混勻各產物後在16°C連接過夜。連接產物轉化DH5 α。1. 7大腸桿菌DH5 α感受態細菌的製備和轉化DH5 α感受態細菌的製備及連接產物的轉化過程詳見《分子克隆實驗指南》。1. 8重組質粒的提取和鑑定用質粒提取試劑盒提取重組質粒pUSZll/P28S並用PCR和雙酶切鑑定，在PCR和雙酶切鑑定中都可以見到目的條帶。1. 9目的基因SzP序列分析測序工作由invitrogen公司協助完成。測序結果如SEQ ID NO 3所示，克隆入的基因完全符合載體閱讀框要求。實施例2重組豬痘病毒的製備及測定2. 1PK15細胞的復甦、培養與凍存在37°C水浴中輕輕振蕩融化一管凍存的PK15細胞；用70%的酒精仔細洗滌外壁後放入超淨工作檯中；把細胞轉入一個無菌的15mL的離心管中，加入10%血清的MEM，600g 離心5min，以沉澱細胞；棄去上清，用10. OmL的10%的新生牛血清的MEM重懸細胞，然後加入IOOmL的細胞瓶中；37°C 5%的二氧化碳培養箱中培養。至形成單層，再用胰酶在室溫下消化l-3min分離細胞；輕敲細胞瓶壁使細胞移動，用倒置顯微鏡來觀察細胞是否變圓和分離；用新的營養液對細胞按需要分瓶。為了保存細胞亞型的特殊表型，建立細胞貯存庫的細
6胞密度必須低於50%。把健康生長處於對數期的細胞完全消化下來；離心，沉澱細胞；用少量含10%血清的MEM重懸細胞；用血細胞計數器進行記數；用50% MEM+10% DMS0+40%新生牛血清使每毫升細胞密度達到1 X IO6個；在1. SmL的凍存管分裝1. OmL的細胞；把凍存管放在泡沫盒內置低溫冰箱24h ；24h後迅速把低溫冰箱的細胞轉入液氮中。2. 2重組豬痘病毒的獲取用脂質體轉染法使穿梭載體PUSZ11/P28S與豬痘病毒(SPV)株VR-363 (購自 ATCC)發生同源重組。提前一天將PK15細胞接種到24孔細胞培養板上，使其長成單層細胞。先用0. 05M0I的SPV感染PK15單層細胞，Ih後將脂質體與穿梭載體的混合液加入到 24孔細胞培養板中。PK15細胞繼續在37°C 5%的二氧化碳培養箱中培養4天，待能看到明顯的病毒噬斑後，將其反覆凍融3次，收穫重組豬痘病毒rSPV-SzP原液。2. 3重組豬痘病毒的噬斑純化在6孔細胞板的每一個孔接種3. OX IO5個細胞，5 %的二氧化碳溫箱中靜止培養；待細胞長成完全單層後，把重組病毒原液按1 5倍比稀釋接種到單層細胞上，37°C吸附1. 5h ；棄去感染液，用DHanks緩衝液輕輕地洗兩次；在一無菌的100. OmL的玻璃瓶中加入10. OmL的2XMEM和10. OmL的2%低熔點瓊脂糖，充分混勻後置37°C水浴鍋中；按每孔 3. OmL加入6孔板中，37°C 5 %的二氧化碳溫箱中靜止培養3_5天，觀察噬斑；待能觀察到明顯的噬斑後，按每孔2. OmL加入含80 μ g/mL X-gal和2%低熔點瓊脂糖的MEM細胞培養液，繼續培養1-2天，重組病毒中的LacZ基因充分表達後，病毒噬斑部分將會形成藍色的斑點；用滅菌槍頭挑取含藍色噬斑的瓊脂糖凝膠塊放入無菌離心管中，加入200. 0μ L的無菌 PBS，將瓊脂塊搗碎後反覆凍融三次；12000rpm離心5min ；收穫的病毒接種於一新的6孔細胞培養板中，重複7次。2. 4重組豬痘病毒滴度的測定按病毒學操作手冊介紹的方法，用含青黴素和鏈黴素的DHanks緩衝液將病毒作 10倍梯度稀釋。然後分別接種於長滿PK15細胞單層的96孔細胞培養板，每個稀釋度接種 8個孔，每孔接種100 μ L。同時設定陰、陽性對照。3715%0)2溫箱培養2h後，換維持液繼續培養。逐日觀察細胞病變，並按Reed-Muech法計算病毒滴度。滴度為106 24PFU/mL。2. 5PCR檢測重組豬痘病毒取出同步接種重組豬痘病毒的PK15細胞和接種野生型豬痘病毒的PK15細胞各一管，用Geneaid病毒核酸提取試劑盒按其說明提取病毒DNA，以提取的DNA為模板，進行PCR 檢測SzP基因。結果表明重組豬痘病毒中含有SzP基因片段，而對照的豬痘病毒野毒中擴增不出SzP基因。2. 6ffestern bloting檢測目的蛋白SzP的表達按5M0I將重組豬痘病毒rSPV-SzP接種到PK15細胞單層上，37°C 5%的二氧化碳溫箱中培養2天，使病毒大量增殖；棄去細胞培養液，並用滅菌PBS衝洗兩次，加入少量滅菌 PBS，用細胞刮子將單層細胞刮下，收穫細胞；反覆凍融兩次，使重組豬竇病毒充分釋放，進行SDS-PAGE電泳，同時設SPV野毒感染的陰性對照和PK15細胞空白對照；再將聚丙烯醯胺凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜上；然後用5%脫脂奶封閉，置4°C冰箱中過夜；次日將膜放入含1 5000稀釋的含一抗(SzP單抗)的封閉液中置37°C搖床中50rpm作用lh，將膜取出用TBST洗三次，每次5min，再將膜放入含1 10000稀釋的含酶標二抗(HRP標記的SPA)的封閉液中，同樣條件作用lh，再用TBST洗三次，每次5min，將膜放入「沉澱型TMB單組份底物」中，使其顯色。結果表明目的蛋白SzP在重組豬痘病毒中有較高效率的表達，而在陰性對照和空白對照中則沒有目的蛋白出現。2. 7間接免疫螢光實驗在24孔細胞培養板上接種PK15細胞，使其長成細胞單層；用DHanks緩衝液將重組豬痘病毒進行稀釋，按15PFU/孔接種細胞，同時設定陰性對照；在37°C 5%的二氧化碳溫箱中溫育60h ；棄去營養液，用PBS洗滌細胞，然後棄去PBS ；加入-20°C預冷的甲醇，固定 IOmin ；用PBST衝洗3次後加入含10% BSA的PBST，37°C封閉Ih ；加入抗SzP的單抗，37°C 孵育Ih ；PBST衝洗3次，加入羅丹明標記的羊抗小鼠IgG-R 二抗，37°C作用0. 5h ；最後用 PBST衝洗3次後，在螢光顯微鏡下觀察。結果表明A組接種了重組豬痘病毒，感染的PK15細胞胞漿內出現了明顯的螢光； 而陰性對照組B組接種了豬痘病毒野毒，未觀察到螢光。實施例3重組豬痘病毒疫苗的免疫保護實驗3. 1重組豬痘病毒的小白鼠免疫試驗取32隻4周齡健康清潔級ICR小白鼠隨機分成四組，每組8隻；一組用2*107PFU 的重組豬痘病毒rSPV-SzP肌肉注射免疫，其餘三組分別為用野生型豬痘病毒免疫的陰性對照、用滅活的ATCC 35246菌體免疫的陽性對照及用PBS免疫的空白對照；在初次免疫後的第14天和第35天按相同方法分別進行二免和三免；每天觀察實驗小鼠，以記錄其免疫反應；在初次免疫的前一天及第6、13、20、27、34、41和48天小鼠眼眶採血，分離血清，用間接 ELISA法測其抗體效價。結果見圖2。結果表明重組豬竇病毒免疫的小鼠血清抗體效價明顯高於其他三組。3. 2攻毒保護試驗最後一次免疫後兩周，所有的小鼠均腹腔接種對數生長期的SEZ 0. 2mL，約為5倍的LD50(5*104CFU)；每天觀察小鼠的變化，並記錄死亡率，連續觀察10天；10天仍未死亡的小鼠，施以安樂死；對死亡小鼠進行剖檢並分離病原菌，染色及PCR檢測均證明是馬鏈球菌獸疫亞種。結果(圖3)表明重組豬痘病毒疫苗對小鼠的免疫保護率可高達62. 5%。綜上所述，本發明所述的重組豬痘病毒疫苗能夠在免疫動物體內大量增殖，表達目的蛋白SzP，能夠誘導動物體內產生較高效價的抗體，並對免疫動物產生良好的保護作用，是一種理想的新型疫苗。
權利要求
1.一種用於預防和/或治療馬鏈球菌獸疫亞種引發疾病的疫苗組合物，其中含有重組豬痘病毒和一種或多種藥物學上可接受的載體或佐劑，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。
2.權利要求1中所述的重組豬痘病毒，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。
3.權利要求1或2所述的疫苗組合物，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。
4.權利要求1至4中任一項所述的疫苗組合物，其中所述的豬痘病毒載體為VR-363。
5.權利要求2所述的重組豬痘病毒在製備用於預防和/或治療馬鏈球菌獸疫亞種引發疾病的藥物中的用途。
6.權利要求5所述的用途，其中所述的馬鏈球菌獸疫亞種引發疾病為豬鏈球菌病。
7.一種製備重組豬痘病毒的方法，該方法包括(1)利用特異性引物對擴增馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因；(2)把SzP基因克隆入穿梭載體pUSZl1/P28M中，然後通過PCR和酶切鑑定，獲得含有 SzP基因的穿梭載體pUSZll/P28S ；(3)讓含有SzP基因的穿梭載體pUSZll/P28S與豬痘病毒同源重組，獲得重組豬痘病毒 rSPV-SzP。(4)純化重組豬痘病毒rSPV-SzP。
8.權利要求7所述的方法，其中所述的特異性引物對的核苷酸序列分別如SEQID NO 1 和 SEQ ID NO 2 所示
9.權利要求7或8所述的方法，其中所述的讓含有SzP基因的穿梭載體PUSZ11/P28S 與豬痘病毒同源重組的具體操作為用豬痘病毒(SPV)感染PK15單層細胞，2小時後用脂質體轉染法加入穿梭載體PUSZ11/P28S，二者發生同源重組。PK15細胞在常規條件下培養 4天後，反覆凍融3次，獲得最初的重組豬竇病毒rSPV-SzP。
10.權利要求7至9中任一項所述的方法，其中所述的純化重組豬痘病毒rSPV-SzP的具體操作為將所述重組豬痘病毒rSPV-SzP經倍比稀釋，接種PK15單層細胞，使其在3_4 天內形成獨立的藍色噬斑，挑取單獨的病毒噬斑，適當稀釋後再次接種PK15單層細胞，重複6次，直至最後得到的重組豬痘病毒能夠穩定遺傳。
全文摘要
本發明屬於生物製藥領域。本發明提供了一種重組疫苗，其中含有重組豬痘病毒和一種或多種藥物學上可接受的載體和/或佐劑，該重組豬痘病毒包含豬痘病毒載體和馬鏈球菌獸疫亞種類M蛋白的編碼基因。本發明所述的重組豬痘病毒疫苗能夠在免疫動物體內大量增殖，表達目的蛋白SzP，能夠誘導動物體內產生較高效價的抗體，並對免疫動物產生良好的保護作用。
文檔編號A61P31/04GK102198268SQ20111007656
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月29日 優先權日2011年3月29日
發明者範紅結, 藺輝星, 陸承平 申請人:範紅結, 藺輝星, 陸承平