一種高效的腫瘤個體化免疫治療方法及其應用的製作方法

2023-10-04 06:31:34

一種高效的腫瘤個體化免疫治療方法及其應用的製作方法【專利摘要】本發明提供了一種高效的腫瘤臨床治療方法。本發明提供了一種患者自體熱休克蛋白gp96-抗原複合物在臨床腫瘤個體化免疫治療中的應用；本發明提供了在自體gp96-抗原複合物臨床應用中增強效果的方法。本發明所述增強效果的方法為在免疫自體gp96-抗原複合物的同時聯合應用低劑量環磷醯胺。本發明對於胃癌、肝癌等具有顯著的治療效果。【專利說明】一種高效的腫瘤個體化免疫治療方法及其應用【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種促進臨床應用自體gp96蛋白個體化治療腫瘤療效的方法及其應用。【
背景技術：
】[0002]惡性腫瘤是嚴重危害人類生命健康的常見病，已成為全球一個主要死亡原因，在2012年造成820萬人死亡，全球癌症帶來的經濟損失高達8950億美元。由於癌症的發生是一個逐步積累的過程，發病率與死亡率隨著年齡的增大呈現指數上升的趨勢。而我國隨著國民經濟的發展、醫療衛生的進步和預期壽命的延長，人口分布已進入老齡化階段，且主要人口年齡分布仍在逐年增大，老齡化日趨嚴重。同時環境汙染依然嚴重。我國腫瘤發病率呈一個快速增大的態勢。惡性腫瘤已成為我國疾病死亡的第一殺手。近幾年來國內每年新增腫瘤病人220萬人，死亡約160萬人，目前全國腫瘤患者總數估計在450萬人左右。我國居民每死亡的5人中，即有I人死於癌症。腫瘤病因複雜，治療費用高昂，我國每年用於惡性腫瘤的醫療費用高達1200多億元。由於治療缺乏有效性，我國腫瘤患者5年生存率不足25%，京津滬這樣的大城市也僅為40%。[0003]應用自體腫瘤組織提取的gp96多肽複合物作為個體化治療性疫苗免疫治療腫瘤，充分考慮到個體間的差異，可以達到最佳治療效果，是當今醫學及藥物學發展的重要方向之一。[0004]gp96蛋白存在於細胞內質網膜內，是熱休克蛋白家族成員之一。gp96作為分子伴侶在蛋白摺疊與運輸過程中發揮重要作用；同時它能結合細胞中5-25個胺基酸的抗原多肽，從腫瘤組織純化的gp96_多肽複合物是最能代表腫瘤組織的抗原肽庫。皮下免疫gp96-多肽複合物後，gp96複合物通過抗原呈遞細胞(APC)表面受體分子進入細胞並將結合的抗原表位呈遞給MHCI類和II類分子，從而啟動患者腫瘤特異性T細胞免疫應答。[0005]研究表明腫瘤具有個體特異性，腫瘤的特異性不僅表現在腫瘤類型之間，還表現在不同個體之間。即使是同種類型腫瘤，不同個體的腫瘤生物學和免疫學特性也存在顯著差別。這使得針對已知腫瘤抗原而設計的腫瘤疫苗不能有效激發針對腫瘤細胞的免疫反應。而腫瘤自體gp96抗原複合物攜帶了完整的腫瘤個體信息，應用該複合物免疫治療充分考慮了個體間的差異，並利用gp96天然T細胞佐劑的特性，可以達到最佳治療效果。[0006]臨床試驗已經證明，自體熱休克蛋白gp96複合物能夠激活腫瘤特異性T細胞，對術後殘留的腫瘤細胞，包括休眠腫瘤細胞和腫瘤幹細胞進行有效殺傷和清除，可以達到延緩腫瘤復發和延長患者生命的效果。應用熱休克蛋白gp96自體疫苗激活腫瘤特異性T細胞，對於治療腎癌、黑色素瘤及腦膠質瘤等安全有效，顯著延長患者生存期。接受自體gp96治療的黑色素瘤MIa和Mlb期患者平均存活期比對照治療延長18.4個月(31.2vs12.8月，產=0.03，危險比HR=0.45)。接受gp96自體疫苗治療的未轉移中等風險腎癌患者(包括I/II期，III期的T1/2/3)，復發時間延長45%(/X0.01，危險比HR=0.55)，與對照相比復發時間延長約1.8年，同時接受治療的患者存活期延長。接受治療的復發性膠質母細胞瘤患者中位生存期延長83%(47.6周比26周)。因此該治療方法已經於2008年在俄羅斯批准上市治療腎癌，並被美國FDA和歐盟EMA批准作為治療黑色素瘤、腦膠質母細胞瘤、腎癌的孤兒藥。[0007]調節性T細胞(Treg)是一群具有抑制功能的T細胞亞群，能夠在獲得性免疫、天然免疫過程中發回抑制作用，主要特徵是表達⑶4陽性、⑶25高表達和Foxp3陽性。有證據表明Treg細胞比例增高或數量增多是腫瘤患者免疫耐受的一個重要機制。有證據表明，去除或者減少Treg細胞能增強機體針對病毒、腫瘤等疾病的免疫反應,或者增加自身免疫病的發生危險。【
發明內容】[0008]本發明要解決的技術問題是如何在臨床水平有效的個體化免疫治療惡性腫瘤。[0009]本發明的一個目的是提供一種腫瘤個體化免疫治療的方法。該方法的一個要點是從患者手術切除的腫瘤組織製備自體gp96-抗原複合物作為個體化疫苗。該方法的另一個要點是在患者免疫時有效抑制調節性T細胞增強個體化疫苗的免疫效果。[0010]上述的gp96-抗原複合物是將手術切除的腫瘤組織充分研磨破碎，離心獲得的上清勻漿液依次進行ConA親和層析和強陰離子交換層析得到的；上述手術切除的腫瘤組織包括但不限於食管癌組織、肺癌組織、胰腺癌組織、結腸癌組織、直腸癌組織、肝癌組織、腎癌組織、胃癌組織等；上述純化步驟包括如下步驟:1、將組織裂解液的酸鹼度調節到pH7.5;以0.15cm/min的徑流速緩慢上樣到ConA親和層析柱；以0.15cm/min的徑流速衝洗ConA層析柱，體積30倍層析柱柱體積，溶液為200mMPBS溶液；以0.15cm/min的徑流速洗脫ConA層析柱親和組分，洗脫緩衝液為濃度100g/L的a-D-吡喃葡萄糖200mMPBS溶液，洗脫體積為3倍層析柱柱體積，洗脫過程為洗脫液洗脫2體積、停滯40分鐘、洗脫液洗脫I體積、200mMPBS溶液洗脫I體積。[0011]2、將步驟1、中的4體積洗脫液以1.2cm/分鐘的徑流速上樣到強陰離子層析柱；以1.2cm/分鐘的徑流速衝洗雜蛋白，緩衝液依次分別是PB2個層析柱柱體積、200mMPBS10個層析柱柱體積、300mMPBS30個層析柱柱體積；以1.2cm/分鐘的徑流速洗脫目標組分，緩衝液為600mMPBS，洗脫4個層析柱柱體積，得到的洗脫液濃縮換液後即是治療所用的自體gp96-抗原複合物疫苗。[0012]上述的個體化免疫治療過程中治療方案為自體gp96_抗原複合物免疫聯合免疫增強預處理:患者手術後8周內開始皮下注射該自體gp96-抗原複合物，每7天注射I次，注射6-10次，至少注射6次。患者每一次注射疫苗時進行調節性T細胞抑制預處理已增強免疫反應。患者第一次免疫前3天內腫瘤特異性T細胞反應和最後一次免疫後3-7天的T腫瘤特異性T細胞反應的差異可以反映患者對免疫治療的反應性。[0013]上述的調節性T細胞抑制預處理的臨床方案為在每一次注射疫苗前1-3天內給患者靜脈注射400mg環磷醯胺，從而有效的特異性抑制調節性T細胞的功能，增強每一次免疫的T細胞反應。[0014]附圖簡要說明圖1.免疫腫瘤自體gp96-抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞對自體胃癌細胞的裂解作用。腫瘤自體gp96抗原複合物單獨或聯合低劑量環磷醯胺預處理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最後一次免疫3天後檢測特異性細胞裂解率。效應細胞CTL對特異性靶細胞的裂解百分率以4小時標準51Cr釋放法測定，效應細胞與靶細胞之比分別是10、25、50和100，圖中裂解率為10隻小鼠平均值。[0015]圖2.免疫腫瘤自體gp96_抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞對自體食管癌細胞的裂解作用。腫瘤自體gp96抗原複合物單獨或聯合低劑量環磷醯胺預處理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最後一次免疫3天後檢測特異性細胞裂解率。效應細胞CTL對特異性靶細胞的裂解百分率以4小時標準51Cr釋放法測定，效應細胞與靶細胞之比分別是10、25、50和100，圖中裂解率為10隻小鼠平均值。[0016]圖3.免疫腫瘤自體gp96_抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞自體肺癌細胞的裂解作用。腫瘤自體gp96抗原複合物單獨或聯合低劑量環磷醯胺預處理，按O、1、3周的周期免疫小鼠，最後一次免疫3天後檢測特異性細胞裂解率。效應細胞CTL對特異性靶細胞的裂解百分率以4小時標準51Cr釋放法測定，效應細胞與靶細胞之比分別是10、25、50和100，圖中裂解率為10隻小鼠平均值。[0017]圖4.免疫腫瘤自體gp96_抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞對裸鼠皮下接種的胃癌細胞生長的抑制作用。裸鼠皮下接種人胃癌細胞KATO-1II，荷瘤7天後轉輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細胞。實驗組(n=20)的接受低劑量環磷醯胺預處理+自體gp96-抗原複合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；對照組(n=20)接受經過單獨自體gp96-抗原複合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；陰性對照(n=20)接受經過單獨小鼠肝臟來源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞。[0018]圖5.免疫腫瘤自體gp96_抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞對裸鼠皮下接種的食管癌細胞生長的抑制作用。裸鼠皮下接種人食管癌細胞TE-1，荷瘤7天後轉輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細胞。實驗組(n=20)的接受低劑量環磷醯胺預處理+自體gp96-抗原複合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；對照組(n=20)接受經過單獨自體gp96-抗原複合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；陰性對照(n=20)接受經過單獨小鼠肝臟來源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞。[0019]圖6.免疫腫瘤自體gp96_抗原複合物過程中聯合低劑量環磷醯胺預處理可以加強的小鼠脾臟淋巴細胞對裸鼠皮下接種的肺癌細胞生長的抑制作用。裸鼠皮下接種人肺癌細胞PC-9，荷瘤14天後轉輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細胞。實驗組(n=20)的接受低劑量環磷醯胺預處理+自體gp96-抗原複合物免疫的BALB/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；對照組(n=20)接受經過單獨自體gp96-抗原複合物免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞；陰性對照(n=20)接受經過單獨小鼠肝臟來源的gp96蛋白免疫的Balb/cHU_A2+小鼠的脾臟淋巴細胞。[0020]圖7.從一例胃癌患者腫瘤組織中純化的gp96_抗原複合物的SDS-PAGE電泳結果O[0021]圖8.從25例胃癌患者腫瘤組織中純化的gp96_抗原複合物內毒素檢測結果。[0022]圖9.胃癌患者免疫自體腫瘤gp96複合物後腫瘤異性T細胞的變化。以IFN-g的ELISP0T方法檢測患者外周血中腫瘤抗原特異性T細胞。癌旁組織裂解液為陰性對照。[0023]【具體實施方式】:下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明並不受其限制。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。[0024]實施例1.從胃癌組織中純化gp96蛋白將胃癌組織充分勻漿；高速離心(22000gX30min)3次(粘液腺癌或印戒細胞癌)或者2次(非粘液腺癌或印戒細胞癌)去除細胞碎片；上清採用ConASepharose(GE公司)進行親和層析，用10%(m/V)的a-甲基葡萄糖苷洗脫結合的蛋白；糖苷洗脫液以Hitrap-Q(GE公司層析系統)進行陰離子層析；濃縮、除菌；經過這三步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。其純度用SDS-PAGE、Westenblot鑑定，微生物指標、內毒素指標委託有資質第三方檢測(圖7、圖8)。所有指標均符合國家藥典中對疫苗類無菌藥物的要求。[0025]實施例2.從食管癌組織中純化gp96_抗原複合物蛋白將食管癌組織勻漿後離心，離心上清採用ConASepharose(GE公司)進行親和層析，用10%的a-甲基葡萄糖苷洗脫結合的蛋白，糖苷洗脫液以Hitrap-Q(GE公司層析系統)進行陰離子層析，600mMPBS洗脫的組分經濃縮、除菌。以上步驟均在無菌條件背景B級局部A級的GMP車間內完成，4V條件下進行。經過這四步純化獲得>95%純度的無菌自體gp96-抗原複合物疫苗。其純度用SDS-PAGE、Westenblot鑑定，微生物指標、內毒素指標委託有資質第三方檢測。所有指標均符合國家藥典中對疫苗類無菌藥物的要求。[0026]實施例3.從肺癌組織中純化gp96_抗原複合物蛋白將肺癌組織以Dounce勻漿器兩輪充分勻漿破壞內質網，高速離心3次(22000gX30min)去除細胞碎片；上清組織裂解液上樣至ConASepharose(GE公司)親和層柱,200mMPBS衝洗雜蛋白，用10%的a-甲基葡萄糖苷洗脫結合的蛋白；糖苷洗脫液以Hitrap-Q(GE公司層析系統)進行陰離子層析，350mMPBS衝洗20個柱體積去除雜蛋白，600mMPBS洗脫目標蛋白；再以截留分子量50kD的超濾管濃縮，0.22uM孔徑的濾器除菌。以上步驟均在無菌條件背景B級局部A級的GMP車間內完成，4°C條件下進行。經過這四步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。其純度用SDS-PAGE、Westenblot鑑定，微生物指標、內毒素指標委託有資質第三方檢測。所有指標均符合國家藥典中對疫苗類無菌藥物的要求。[0027]實施例4.免疫小鼠選用生長8-10周的HLA-A2轉基因的BALB/c小鼠(HLA-A2+)用於本實驗。[0028]免疫方式採用將樣品溶於10uL的PBS中頸背皮下注射。皮下注射操作相對簡單，要求免疫劑量適中，故採用該種免疫方式。同時在每次免疫前I天可腹腔注射0.4mg的環磷醯胺。低劑量環磷醯胺可以抑制在gp96免疫中起抑制作用的Treg細胞從而能增強免疫效果。[0029]自體gp96_抗原複合物的最適免疫劑量為25ug。[0030]免疫時間為0、1、3周進行三次的強化免疫，優於免疫一次或二次的效果。[0031]因此採用皮下注射免疫，將gp96_抗原複合物溶於PBS中，注射前劇烈振蕩I分鐘，每隻小鼠免疫gp96-抗原複合物劑量為25ug/只，採用頸背皮下注射，第一次免疫I周后進行第二次免疫，2周後加強免疫，3天後進行細胞毒性分析。每一處理使用10隻小鼠。[0032]實施例5.細胞毒性(CTL)分析小鼠加強免疫3天後，從每隻小鼠收穫得約3X17脾細胞懸於含有10mMHEPES緩衝液、5X10_5M琉基乙醇，抗生素和10%(V/V)FCS培養液中，於培養瓶中與經幅射(4500Rad)的T2細胞(3:1)和lmg/mL肽在完全培養基中37°C培養。6天後收集脾細胞進行4小時標準51Cr釋放實驗(具體方法見Kuhrober,A,etal.1997.1nternat1nalImmunology,9(8):1203-1212)測定細胞毒性活性。簡而言之，腫瘤gp96來源的腫瘤細胞系作為靶細胞，加入不同數量的效應細胞，反應體系為100μL的完全培養基。37°C共培養4小時後收集上清測定特異裂解率。[0033]從51Cr釋放實驗可以看出gp96_抗原複合物可刺激小鼠產生特異性細胞毒性T細胞，每隻小鼠免疫25ug複合物即能誘發機體產生強烈的細胞免疫反應，細胞毒性測定靶細胞的裂解率在50%以上，通過注射環磷醯胺的預處理可以明顯的提高gp96-抗原複合物的免疫效果，且環磷醯胺的作用是依賴於自體gp96疫苗的(圖1、圖2、圖3)。[0034]實施例6.胃癌體內抑瘤實驗體外培養胃癌細胞系KATO-1II細胞，從中提取胃癌特異的gp96-抗原複合物。以該gp96-胃癌抗原複合物單獨免疫(對照組■)或者聯合低劑量環磷醯胺預處理(實驗組▲)或者小鼠肝臟來源gp96複合物(陰性對照?)免疫人HLA轉基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)獲得胃癌特異的脾臟淋巴細胞。將獲得的淋巴細胞分別轉輸KATO-1II皮下接種荷瘤7天的裸鼠作為實驗組、對照組、陰性對照組(n=20)，每周轉輸一次，共3周。檢測腫瘤大小，如圖所示低劑量環磷醯胺預處理明顯的加強了小鼠對胃癌的特異性免疫反應(圖4)。[0035]實施例7.食管癌體內抑瘤實驗體外培養食管癌細胞系TE-1細胞，從中提取食管癌特異的gp96-抗原複合物。以該gp96-食管癌抗原複合物單獨免疫(對照組▲)或者聯合低劑量環磷醯胺預處理(實驗組?)或者小鼠肝臟來源gp96複合物(陰性對照■)免疫人HLA轉基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)獲得食管癌特異的脾臟淋巴細胞。將獲得的淋巴細胞分別轉輸TE-1皮下接種荷瘤7天的裸鼠作為實驗組、對照組、陰性對照組(n=20)，每周轉輸一次，共3周。檢測腫瘤大小，如圖所示低劑量環磷醯胺預處理明顯的加強了小鼠對食管癌的特異性免疫反應(圖5)。[0036]實施例8.肺癌體內抑瘤實驗體外培養HLA-A2陽性人肺癌細胞系PC-9細胞，從中提取肺癌特異的gp96_抗原複合物。以該gp96-肺癌抗原複合物單獨免疫(對照組▲)或者聯合低劑量環磷醯胺預處理(實驗組?)或者小鼠肝臟來源gp96複合物(陰性對照■)免疫人HLA轉基因小鼠(Balb/cHU2+小鼠)獲得肺癌特異的脾臟淋巴細胞。將獲得的淋巴細胞分別轉輸PC-9細胞皮下接種荷瘤14天的裸鼠作為實驗組、對照組、陰性對照組(n=20)，每周轉輸一次，共3周。檢測腫瘤大小，如圖所示低劑量環磷醯胺預處理明顯的加強了小鼠對肺癌的特異性免疫反應(圖6)。[0037]實施例9.改進的胃癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的胃癌患者的治療為一周一個療程,每個療程注射一次。試驗組在術後8周內在常規治療的基礎上開始自體gp96免疫治療。[0038]操作流程i患者入選:初發III期或IV期的胃癌患者，可進行根治性手術。[0039]ii腫瘤組織中gp96_腫瘤抗原複合物的純化按照孟頌東等發表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)對腫瘤組織中gp96蛋白進行提取純化。首先通過ConA柱親和層析,再通過HitrapQ柱離子交換洗脫，得到純度95%以上gp96蛋白。[0040]考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度，每份樣本的蛋白提取量應能滿足10個療程的治療需要。[0041]蛋白應滿足疫苗的微生物要求(檢測方法參照生物製品規程)。[0042]蛋白的內毒素含量需滿足疫苗製劑的要求(鱟試劑法檢測)。[0043]iiigp96_腫瘤抗原複合物的使用患者在手術後8周內接受第一次免疫治療。每次免疫前I天，靜脈注射環磷醯胺，然後三角肌部位皮下或腹部皮下注射自體gp96複合物，每周I次。[0044]IV免疫學指標檢查以自體腫瘤裂解液及自體gp96複合物抗原為刺激物檢測自體腫瘤特異性T細胞活性。比較胃癌患者免疫前後特異性T細胞活性，發現自體gp96複合物免疫顯著激活了患者特異性T細胞，預示了良好的預後。[0045]V隨訪注射完成後，於3個月、6個月、I年、I年半、2年時各訪視I次；之後每半年訪視I次，直至患者復發或死亡。[0046]①2年內每3個月複查I次:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CA-724、CA-125、CEA)；腹、盆腔B超；胸部X線。[0047]b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CA-724、CA-125,CEA)；胸、腹、盆腔增強CT;胃鏡。[0048]②2年後每6個月複查I次，複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CA-724、CA-125,CEA)；胸、腹、盆腔增強CT;胃鏡。[0049]患者隨訪期間疾病復發，達到研究終點，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予其他治療。[0050]實施例10.改進的食管癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的食管癌患者需完成8個療程的治療。一周為一個療程,每個療程注射一次。試驗組在術後8周內開始自體gp96免疫治療。[0051]操作流程選取計劃行手術的I1、III期食管癌患者或I1、IIIA期肺癌患者；獲得患者自願籤署的「知情同意書」以及「手術同意書」;行術前全面檢查以明確根治性手術可行性；手術切取腫瘤組織:a)將組織存放於無菌管中；b)存有腫瘤組織的無菌管在0°C條件下於2個小時內送至GMP製備車間。[0052]鑑定腫瘤組織質量，確認可以提取足量的熱休克蛋白gp96_多肽複合物；熱休克蛋白gp96-多肽複合物提取及檢測；改進的gp96治療及常規治療；改進的熱休克蛋白gp96-多肽複合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0053]b)免疫增強預處理:每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射低劑量環磷醯胺以抑制Treg細胞功能。[0054]c)由研究護士進行gp96蛋白注射，根據既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽水混勻後上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0055]d)第1、2次免疫蛋白注射後，需留院觀察24小時，後幾次注射後需觀察I小時，無不良反應後方可離開。[0056]e)第2次及最後一次注射後3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0057]f)免疫治療前及免疫結束後,採集1ml患者血液,進行免疫學指標的測定。[0058]若患者治療期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範給予相應治療；隨訪:術後2年內每3月訪視I次，2年後每6月訪視I次，直至患者疾病復發或死亡，具體訪視內容如下:①2年內每3個月複查I次:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；食道X線鋇透；胸部X線正側位片；腹部B超。[0059]b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；胸、腹部CT；胃鏡。[0060]②2年後每6個月複查I次，複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、P53、SCG)；胸、腹部CT；胃鏡。[0061]若患者隨訪期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予相應治療。[0062]實施例11.改進的肺癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤肺癌患者術後接受gp96治療及醫生常規治療(放化療)。該研究中入組的gp96免疫治療為一周一個療程，每個療程皮下注射一次自體gp96複合物。[0063]操作流程選取計劃行手術的I1、IIIA期肺癌患者；獲得患者自願籤署的「知情同意書」以及「手術同意書」;行術前全面檢查以明確根治性手術可行性；手術切取腫瘤組織；a)將組織存放於無菌管中；b)存有腫瘤組織的無菌管在0°C條件下於2個小時內送至GMP製備車間。[0064]鑑定腫瘤組織質量，確認可以提取足量的熱休克蛋白gp96_多肽複合物；熱休克蛋白gp96-多肽複合物提取及檢測；改進的gp96治療及常規治療；改進的熱休克蛋白gp96-多肽複合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0065]b)免疫增強預處理:每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射低劑量環磷醯胺。[0066]c)由研究護士進行gp96蛋白注射，根據既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽水進行稀釋，混勻後上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0067]d)第1、2次免疫蛋白注射後，需留院觀察24小時，後幾次注射後需觀察I小時，無不良反應後方可離開。[0068]e)第2次及最後一次注射後3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0069]f)免疫治療如及免疫結束後，米集1ml患者血液,進打免疫學指標的測定。[0070]若患者治療期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範給予相應治療；隨訪；術後2年內每3月訪視I次，2年後每6月訪視I次，直至患者疾病復發或死亡，具體訪視內容如下:①2年內每3個月複查I次:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超。[0071]b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超；頭顱CT、骨掃描(ECT)。[0072]②2年後每6個月複查I次，複查內容:腫瘤標誌物(CA19-9、CEA、CA125);胸部CT、腹部B超；頭顱CT、骨掃描(ECT)。[0073]若患者隨訪期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予相應治療。[0074]實施例12.改進的神經膠質瘤患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的神經膠質瘤患者完成6個療程的治療。一周為一個療程，每個療程注射一次。試驗組在術後12周後進行常規治療及gp96自體免疫治療。[0075]操作流程i患者入選:初發幕上神經膠質瘤，接受根治手術，切除率大於80%。[0076]ii腫瘤組織中gp96_腫瘤抗原複合物的純化按照孟頌東等發表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)對腫瘤組織中gp96蛋白進行提取純化,通過ConA柱親和層析、HitrapQ柱離子交換純化得到純度95%以上gp96蛋白。[0077]考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度，蛋白提取量應足夠完成6個療程。[0078]樣品應滿足疫苗應用的微生物要求。[0079]樣品應滿足疫苗應用的內毒素含量要求。[0080]gp96樣品應具有生物活性。[0081]iii改進的gp96_腫瘤抗原複合物的使用流程患者在手術後應接受I個月的冋步放化療治療，在冋步放化療結束之後、術後12周之前開始接受第一次免疫治療。免疫治療每7天I次,至少注射6次。[0082]每次疫苗注射前I天，患者接受靜脈注射低劑量環磷醯胺以抑制Treg細胞功能。[0083]三角肌部位皮下或腹部皮下注射自體gp96_抗原複合物。[0084]IV免疫學指標檢查以自體腫瘤裂解液及自體gp96複合物抗原為刺激物檢測自體腫瘤特異性T細胞活性。比較神經膠質瘤患者免疫前後特異性T細胞活性，發現自體gp96複合物免疫顯著激活了患者特異性T細胞，預示了良好的預後。[0085]V隨訪注射完成後，於3個月、6個月、I年、I年半、2年時各訪視I次；之後每半年訪視I次，直至患者復發或死亡。[0086]複查內容:①影像學檢查:頭顱核磁共振(MRI)及頭顱強化MRI；②臨床神經功能檢測:感覺、運動、視覺、KPS評分；③注射部位過敏反應檢測:觀察注射部位皮肽情況；④自身免疫性甲狀腺炎檢測:當患者出現自身免疫性甲狀腺炎的臨床症狀時，進行甲狀腺檢測。[0087]實施例13.改進的結直腸癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的II1、IV期結直腸癌患者術後接受gp96治療及醫生常規治療(放化療)。一周為一個療程，每個療程注射一次。試驗組在術後8周內在常規治療的基礎上開始自體gp96免疫治療。[0088]操作流程選取計劃行手術的II1、IV期的結直腸癌患者；獲得患者自願籤署的「知情同意書」以及「手術同意書」;行術前全面檢查以明確根治性手術可行性；手術切取腫瘤組織:a)將組織存放於無菌管中；b)存有腫瘤組織的無菌管在0°C條件下於2個小時內送至GMP製備車間。[0089]鑑定腫瘤組織質量，確認可以提取足量的熱休克蛋白gp96_多肽複合物；熱休克蛋白gp96-多肽複合物提取及檢測；改進的gp96治療及常規治療；熱休克蛋白gp96-多肽複合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0090]b)免疫增強預處理:每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射環磷醯胺。[0091]c)由研究護士進行gp96蛋白注射，根據既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽水混勻後上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0092]d)第1、2次免疫蛋白注射後，需留院觀察24小時，後幾次注射後需觀察I小時，無不良反應後方可離開。[0093]e)第2次及最後一次注射後3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0094]f)免疫治療如及免疫結束後，米集1ml患者血液，進彳了免疫學指標的測定。[0095]若患者治療期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範給予相應治療；隨訪；術後2年內每3月訪視I次，2年後每6月訪視I次，直至患者疾病復發或死亡，具體訪視內容如下:①2年內每3個月複查I次:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CEA、CA19-9、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X線。[0096]b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CEA、CA19-9、AFP)；胸、腹、盆腔增強CT;結腸鏡。[0097]②2年後每6個月複查I次，複查內容:腫瘤標誌物(CEA、CA19-9、AFP)；胸、腹、盆腔增強CT;結腸鏡。[0098]若患者隨訪期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予相應治療。[0099]實施例14.改進的肝癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的肝癌患者進行的gp96治療為一周一個療程,每個療程皮下注射一次自體gp96複合物。試驗組在術後8周內開始自體gp96免疫治療。[0100]1.選取計劃行手術肝癌患者；2.獲得患者自願籤署的「知情同意書」以及「手術同意書」;3.行術前全面檢查以明確根治性手術可行性；4.手術切取腫瘤組織，將組織存放於無菌管中，存有腫瘤組織的無菌管在(TC條件下於2個小時內送至GMP製備車間。[0101]5.鑑定腫瘤組織質量，確認可以提取足量的熱休克蛋白gp96-多肽複合物；6.熱休克蛋白gp96_多肽複合物提取及檢測:按照孟頌東等發表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)對腫瘤組織中gp96蛋白進行提取純化,通過ConA柱親和層析結合HitrapQ柱離子交換方法純化得到純度95%以上gp96蛋白。[0102]考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度，每份樣本的蛋白提取量應能滿足6個療治的治療需要。[0103]微生物檢測，應滿足對蛋白疫苗製品的要求(參照生物製品規程)。[0104]內毒素檢測，應滿足對蛋白疫苗製品的內毒素含量要求(鱟試劑法)。[0105]7.改進的gp96治療及常規治療:熱休克蛋白gp96-多肽複合物皮下注射流程:a)第I次注射前3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0106]b)免疫增強預處理:每次gp96注射前1-3天給患者靜脈注射環磷醯胺。[0107]c)由研究護士進行gp96蛋白注射，根據既往國外研究資料制定劑量，加入生理鹽水混勻後上臂及大腿左右皮下注射，每周I次。[0108]d)第1、2次免疫蛋白注射後，需留院觀察24小時，後幾次注射後需觀察I小時，無不良反應後方可離開。[0109]e)第2次及最後一次注射後3天內需檢查血常規、血生化及心電圖。[0110]f)免疫治療如及免疫結束後，米集1ml患者血液，進彳丁免疫學指標的測定:以自體腫瘤裂解液、自體gp96複合物抗原以及B肝抗原肽、gp96-B肝抗原肽複合物為刺激物檢測自體腫瘤特異性T細胞活性。比較患者免疫前後特異性T細胞活性，發現自體gp96複合物免疫顯著激活了患者特異性T細胞，預示了良好的預後。[0111]患者治療期間疾病復發，則需終止治療，退出研究。由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予其他治療。[0112]8.隨訪:隨訪至患者疾病復發或死亡，最長隨訪期為2年，2年後患者正常隨訪。術後2年內，每3月訪視I次，具體訪視內容如下:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CEA、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X線；b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增強CT;患者隨訪期間疾病復發，由研究者詳實記錄患者疾病復發情況，並按照臨床診療規範(如NCCN指南等)給予其他治療。[0113]實施例15.改進的胰腺癌患者免疫自體gp96_抗原複合物治療腫瘤該研究中入組的gp96免疫治療的胰腺癌患者進行的gp96治療為一周皮下注射一次自體gp96複合物。試驗組在術後8周內開始自體gp96免疫治療。[0114]操作流程:i患者入選:初發可根治性切除的胰腺癌患者。[0115]ii腫瘤組織中gp96_腫瘤抗原複合物的純化按照孟頌東等發表的三步法(MengS，SongJ,RaoZ,TienP,GaoG.2002.Three-steppurificat1nofgp96fromhumanlivertumortissuessuitableforisolat1nofgp96_boundpeptides.JournalofImmunologicalMethods,264(1-2):29-35.)對腫瘤組織中gp96蛋白進行提取純化,通過ConA柱親和層析結合HitrapQ柱離子交換方法純化得到純度95%以上gp96蛋白。[0116]考馬斯亮藍顯色法測定蛋白濃度，每份樣本的蛋白提取量應能滿足6個療治的治療需要。[0117]微生物檢測，應滿足對蛋白疫苗製品的要求(參照生物製品規程)。[0118]內毒素檢測，應滿足對蛋白疫苗製品的內毒素含量要求(鱟試劑法)。[0119]iii優化的gp96_腫瘤抗原複合物的使用患者在手術後8周內接受第一次免疫治療。每次免疫前I天，靜脈注射環磷醯胺，然後三角肌部位皮下或腹部皮下注射自體gp96複合物。每周I次。[0120]IV免疫學指標檢查以自體腫瘤裂解液、自體gp96複合物抗原為刺激物檢測自體腫瘤特異性T細胞活性。比較胰腺癌患者免疫前後特異性T細胞活性，發現自體gp96複合物免疫顯著激活了患者特異性T細胞，預示了良好的預後。[0121]V隨訪注射完成後，於3個月、6個月、I年、I年半、2年時各訪視I次；之後每半年訪視I次，直至患者復發或死亡。[0122]①2年內每3個月複查I次:a)第3、9、15、21月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CEA、AFP)；腹、盆腔B超；胸部X線；b)第6、12、18、24月複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增強CT;②2年後每6個月複查I次，複查內容:腫瘤標誌物(CA-199、CEA、AFP)；胸、腹、盆腔增強CT。[0123]實施例16.ELISP0T法檢測特異性T細胞ELISP0T檢測腫瘤患者PBMC中腫瘤特異性CTL。按照ELISP0T試劑盒的說明書操作。先用含10%胎牛血清的PRMI1640培養基封閉ELISP0T預包被板一小時，臨用前倒掉封閉液，加入10uL含3X15的人的PBMC(直接用新鮮的PBMC或者將PBMC體外擴增培養7天)。實驗組中加入20mg/mL的腫瘤裂解液離心上清、陽性對照加入4mg/mL的PHA進行刺激，陰性對照加入癌旁組織裂解液(20mg/mL)。在細胞培養箱內培養18小時後，檢測特異性斑點的形成，並進行統計分析。通過ELISP0T方法可以檢測患者新鮮血液中腫瘤抗原特異性CTL，特異性CTL的頻率通過計數斑點數量來確定。在20例經自體gp96複合物免疫的胃癌患者中均檢測到高頻率腫瘤抗原特異性CTL，且比免疫前有顯著的提高；同時免疫後針對癌旁組織抗原的T細胞仍然很弱，和免疫前相當。結果說明自體gp96複合物免疫有良好的有效性和安全性(圖9)。【權利要求】1.在腫瘤臨床個體化免疫治療方案中使用調節性T細胞抑制藥物提高臨床治療效果的方法。2.權利要求1中所述調節性T細胞抑制藥物為環磷醯胺。3.權利要求1中所述腫瘤臨床個體化治療方案為:從腫瘤患者手術切除的腫瘤組織中純化自體gp96-腫瘤抗原複合物；腫瘤患者手術後8周內開始皮下注射該自體複合物,每7天注射I次，至少注射6次。4.權利要求1中所述調節性T細胞抑制藥物使用方法為每次注射抗原複合物前1-3天內靜脈注射400mg環磷醯胺。5.權利要求3所述腫瘤患者種類為食管癌患者、肺癌患者、胰腺癌患者、結腸癌患者、直腸癌患者、肝癌患者、腎癌患者、胃癌患者、神經膠質瘤患者等。6.權利要求3種所述抗原複合物純化過程為:a)將權利5中所述組織在NaHC03中機械研磨破碎、高速離心製備組織裂解液b)將步驟a)中組織裂解液pH調節到7.5;以0.15cm/min的徑流速上樣到ConA親和層析柱；以0.15cm/min的徑流速衝洗ConA層析柱30倍層析柱柱體積200mMPBS溶液；以.0.15cm/min的徑流速洗脫ConA層析柱親和組分，洗脫緩衝液為濃度100g/L的α-甲基葡萄糖苷200mMPBS溶液，洗脫體積為3倍層析柱柱體積，洗脫過程為洗脫液洗脫2體積、停滯40分鐘、洗脫液洗脫I體積、200mMPBS溶液洗脫I體積c)將b)中的4體積洗脫液以1.2cm/分鐘的徑流速上樣到HitrapQ強陰離子層析柱；以1.2cm/分鐘的徑流速衝洗雜蛋白，緩衝液依次分別是PB2個層析柱柱體積、200mMPBS.10個層析柱柱體積、300mMPBS30個層析柱柱體積；以1.2cm/分鐘的徑流速洗脫目標組分，緩衝液為600mMPBS,洗脫4個層析柱柱體積d)步驟c)中得到的洗脫組分即為目的自體gp96抗原複合物。【文檔編號】A61P35/00GK104306976SQ201410534622【公開日】2015年1月28日申請日期:2014年10月13日優先權日:2014年4月26日【發明者】黃錫堅,張小俊,高華申請人:深圳市康爾諾生物技術有限公司