四區模擬移動床分離純化發酵液中的穀氨醯胺的方法

2023-10-17 06:25:19

專利名稱：四區模擬移動床分離純化發酵液中的穀氨醯胺的方法
技術領域：
本發明屬於生物製品加工領域，涉及一種四區模擬移動床分離純化發酵液中的穀氨醯胺的方法。
背景技術：
L-穀氨醯胺是L-穀氨酸的γ-羧基醯胺化的一種胺基酸，化學名2，5-二氨基-5-氧代戊酸，作為20種構成蛋白質的基本胺基酸之一，穀氨醯胺是人體血液中最豐富的胺基酸，亦是骨骼肌細胞內最豐富的胺基酸，約佔全身游離胺基酸的一半以上，在生物體代謝中起著舉足輕重的作用，是一種「條件性必需胺基酸」。自1952年用X光衍射確定了其分子結構後，對它的應用就日益引起人們的關注，被認為是目前所知道的最重要的胺基酸之一，也是一種極有發展前途的新藥。目前穀氨醯胺生產主要使用發酵法，發酵法生產穀氨醯胺得以工業化生產還依賴於穀氨醯胺分離提取技術。目前國內外穀氨醯胺的分離提取幾乎都採用以離子交換樹脂為填料的柱層析法，雖然可以進行大規模製備，但是分離的效率低，流動相浪費嚴重，固定相利用效率低，產量低，成本高。
70年代以來，美國UOP公司開發了模擬移動床(SMB)原理的色譜技術，該技術使吸附劑顆粒裝填後不在移動，由原料進出口和產品液流進出口不斷切換的方法，形成吸附劑顆粒和液流相對逆流運動來模擬固定相的移動。20世紀90年代模擬移動床色譜應用範圍也不斷擴大，遍及石油、精細化工、生物發酵、醫藥、食品等很多生產領域，尤其在同系化合物、手性異構體藥物、糖類、有機酸和胺基酸等混合物的分離中顯示出其獨特性能。美國的一些專利文獻報導了模擬移動床色譜分離手性藥物如光學異構體、外消旋物質和對映體以及石油化學品的分離。日本Daicel化學工業公司也開發了使用模擬移動床色譜分離手性異構體的方法。但是，對於使用模擬移動床色譜分離提純穀氨醯胺的方法仍未見公開報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種四區模擬移動床分離純化發酵液中的穀氨醯胺的方法，工業化連續生產，提高產品的純度、收率和產量。
本發明的技術解決方案包括以下步驟a、穀氨醯胺酵母發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質，降低料液的粘度；b、將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；c、將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽；d、將脫鹽後的粗晶配成濃度為10-80g/l的進樣液裝入裝有陽離子交換樹脂的模擬移動床系統SMB中進行吸附，由pH10-14的去離子水進行洗脫，控制各功能區樣品的遷移速度，將穀氨醯胺和穀氨酸分別從提取液和提餘液出口收集；e、模擬移動床的萃取液經旋轉蒸發儀濃縮至無水，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。
本發明方法中的模擬移動床系統由多根相同的陽離子交換樹脂柱串聯，即通過離子交換過程中的強弱吸附組分的吸附、精製、解吸、樹脂再生不同功能區之間的按順序切換，根據強弱吸附組分在分離介質上遷移速度不同的原理進行分離，通過組合閥門的切換來改變進料口、提餘液出口、流動相入口、提取液出口的位置得到目標產物；其中，切換時間的標準是通過調整各功能區洗脫液的流速和離子交換柱的根數來控制目標物的遷移速度；各功能區離子交換柱的數量根據所需要洗脫的目標物在此切換時間被洗脫的遷移長度決定，切換時按功能區進行切換。
本發明方法中的模擬移動床色譜(SMBC)分離系統由洗脫泵、進樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號採集器、系統控制器及計算機連接組成，洗脫泵流量200-800ml/min，壓力1-10Mpa；進樣泵流量10-50ml/min，壓力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；提餘泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；閥切換時間為18-24min；整個模擬移動床的溫度為25-35℃，進料液、洗脫液溫度25-35℃，二者溫度保持一致。
本發明方法中的模擬移動床系統由4-16根離子交換柱串聯，模擬移動床系統按照四個口的位置分四區，每區由1-4根相同的離子交換柱，一區位於洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區內，實現穀氨醯胺發酵液粗提取物中強吸附組分的解吸；二區位於提取液出口處與進料口之間，其作用相當於精餾塔，使穀氨醯胺粗提取物中強吸附組分反覆吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到穀氨酸；三區位於進料口與提餘液出口之間，其作用是儘可能地將穀氨醯胺和穀氨酸吸附在固定相上，從提餘液出口得到含穀氨醯胺；四區位於洗脫液入口與提餘液出口之間，一方面，液相中的穀氨醯胺和穀氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進入一區，從而達到循環利用的目的；另一方面將三區與一區隔開，以免提餘液中的穀氨醯胺和穀氨酸進入一區而汙染提取液，起到一定的緩衝作用。
本發明的方法採用模擬移動床系統分離純化發酵液中的穀氨醯胺，連續化工業化生產，產品純度好、效率高、產量大、生產成本低。
具體實施例方式
實例1選用穀氨醯胺發酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動床上實現穀氨醯胺的純化a、取穀氨醯胺酵母發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質，降低料液的粘度；b、將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；c、將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽；d、將脫鹽後的粗晶配成濃度為10g/l的進樣液進入模擬移動床系統由pH10的去離子水進行洗脫；e、將模擬移動床的萃取液經旋轉蒸發儀濃縮至無水，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。
本發明方法中的模擬移動床色譜(SMBC)分離系統由洗脫泵、進樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號採集器、系統控制器及計算機連接組成，洗脫液流速為200ml/min，萃取液流速為100ml/min，提餘液流速為100ml/min閥切換時間為18min；進料液流速為10ml/min；各泵工作壓力1Mpa；整個模擬移動床的溫度為25℃，進料液、洗脫液溫度25℃。
本發明方法中的模擬移動床系統SMB的由4根相同的離子交換柱串聯，按照四個口的位置分4區一區位於洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區內，實現穀氨醯胺發酵液粗提取物中強吸附組分的解吸；二區位於提取液出口處與進料口之間，其作用相當於精餾塔，使穀氨醯胺粗提取物中強吸附組分反覆吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到穀氨酸；三區位於進料口與提餘液出口之間，其作用是儘可能地將穀氨醯胺和穀氨酸吸附在固定相上，從提餘液出口得到含穀氨醯胺；四區位於洗脫液入口與提餘液出口之間，一方面，液相中的穀氨醯胺和穀氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進入一區，從而達到循環利用的目的；另一方面將三區與一區隔開，以免提餘液中的穀氨醯胺和穀氨酸進入一區而汙染提取液，起到一定的緩衝作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時後取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩衝液至刻度；洗脫液由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進樣濃度1mg/ml，進樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格中參數使用外標法測定成品穀氨醯胺含量98％。

實例2選用穀氨醯胺發酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動床上實現穀氨醯胺的純化a、取穀氨醯胺酵母發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質，降低料液的粘度；b、將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；c、將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽；d、將脫鹽後的粗晶配成濃度為45g/l的進樣液進入模擬移動床系統由pH12的去離子水進行洗脫；e、將模擬移動床的萃取液經旋轉蒸發儀濃縮至無不，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。
本發明方法中的模擬移動床色譜(SMBC)分離系統由洗脫泵、進樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號採集器、系統控制器及計算機連接組成，洗脫液流速為500ml/min，壓力5Mpa；進樣液流速為30ml/min，壓力5Mpa，萃取液流速為300ml/min，壓力5Mpa；提餘液流速為300ml/min；閥切換時間為21min工作溫度30℃，進料液、洗脫液溫度30℃。
本發明方法中的模擬移動床系統SMB由12根相同的離子交換柱串聯，按照四個口的位置分4區，每區由3根交換柱，一區位於洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區內，實現穀氨醯胺發酵液粗提取物中強吸附組分的解吸；二區位於提取液出口處與進料口之間，其作用相當於精餾塔，使穀氨醯胺粗提取物中強吸附組分反覆吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到穀氨酸；三區位於進料口與提餘液出口之間，其作用是儘可能地將穀氨醯胺和穀氨酸吸附在固定相上，從提餘液出口得到含穀氨醯胺；四區位於洗脫液入口與提餘液出口之間，一方面，液相中的穀氨醯胺和穀氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進入一區，從而達到循環利用的目的；另一方面將三區與一區隔開，以免提餘液中的穀氨醯胺和穀氨酸進入一區而汙染提取液，起到一定的緩衝作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時後取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩衝液至刻度；洗脫液由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進樣濃度1mg/ml，進樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格中參數使用外標法測定成品穀氨醯胺含量98.68％。

實例3選用穀氨醯胺發酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動床上實現穀氨醯胺的純化a、取穀氨醯胺酵母發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質，降低料液的粘度b、將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；c、將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽；d、將脫鹽後的粗晶配成濃度為80g/l的進樣液進入模擬移動床系統由pH14的去離子水進行洗脫；e、將模擬移動床的萃取液經旋轉蒸發儀濃縮至無不，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。
本發明方法中的模擬移動床色譜(SMBC)分離系統由洗脫泵、進樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號採集器、系統控制器及計算機連接組成，洗脫液流速為800ml/min，壓力10Mpa；進樣液流速為50ml/min，壓力10Mpa，萃取液流速為500ml/min，壓力10Mpa；提餘液流速500ml/min；閥切換時間為24min；工作溫度35℃，進料液、洗脫液溫度35℃。
本發明方法中的模擬移動床系統SMB由16根相同的離子交換柱串聯，按照四個口的位置分4區，每區4根交換柱，一區位於洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區內，實現穀氨醯胺發酵液粗提取物中強吸附組分的解吸；二區位於提取液出口處與進料口之間，其作用相當於精餾塔，使穀氨醯胺粗提取物中強吸附組分反覆吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到穀氨酸；三區位於進料口與提餘液出口之間，其作用是儘可能地將穀氨醯胺和穀氨酸吸附在固定相上，從提餘液出口得到含穀氨醯胺；四區位於洗脫液入口與提餘液出口之間，一方面，液相中的穀氨醯胺和穀氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進入一區，從而達到循環利用的目的；另一方面將三區與一區隔開，以免提餘液中的穀氨醯胺和穀氨酸進入一區而汙染提取液，起到一定的緩衝作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時後取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩衝液至刻度；流動相由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進樣濃度1mg/ml，進樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格參數方式使用外標法測定成品穀氨醯胺含量99.10％。

權利要求
1.四區模擬移動床分離純化發酵液中穀氨醯胺的方法，其特徵在於a、穀氨醯胺酵母發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質，降低料液的粘度；b、將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；c、將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽； d、將脫鹽後的粗晶配成濃度為10-80g/l的進樣液裝入裝有陽離子交換樹脂的模擬移動床系統SMB中由pH 10-14的去離子水進行洗脫，控制各功能區樣品的遷移速度，將穀氨醯胺和穀氨酸分別從提取液和提餘液出口收集；e、模擬移動床的萃取液經旋轉蒸發儀濃縮至無水，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。
2.根據權利要求1所述的四區模擬移動床分離純化發酵液中穀氨醯胺的方法，其特徵在於模擬移動床色譜(SMBC)分離系統由洗脫泵、進樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號採集器、系統控制器及計算機連接組成，洗脫泵流量200-800ml/min，壓力1-10Mpa；進樣泵流量10-50ml/min，壓力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；提餘泵流量100-500ml/min，壓力1-10MPa；閥切換時間為18-24min；整個模擬移動動的溫度25-35℃，進料液、洗脫液溫度25-35℃。
3.根據權利要求1所述的四區模擬移動床分離純化發酵液中穀氨醯胺的方法，其特徵在於模擬移動床系統由4-16根相同的離子交換柱串聯，模擬移動床系統按照四個口的位置分四區，每區1-4根交換柱，一區位於洗脫液入口處與提取液出口處之間；二區位於提取液出口處與進料口之間；三區位於進料口與提餘液出口之間；四區位於洗脫液入口與提餘液出口之間。
全文摘要
本發明公開了四區模擬移動床分離純化發酵液中穀氨醯胺的方法，穀氨醯胺發酵液裝入PES超濾膜的超濾設備中，在不超過0.25MPa的氮氣下進行超濾除去酵母細胞菌體、固形物及蛋白質；將超濾過的發酵液通過活性炭脫色；將脫色後的發酵液通過減壓濃縮、結晶脫鹽；將脫鹽後的粗晶配成濃度為10－80g/l的進樣液裝入模擬移動床，由pH 10－14的去離子水進行洗脫，將穀氨醯胺和穀氨酸分別從提取液和提餘液出口收集；萃取液旋轉蒸發儀濃縮至無水，由甲醇洗脫後在真空乾燥箱烘乾得成品。本發明的方法採用模擬移動床分離純化發酵液中穀氨醯胺，連續化工業生產，產品純度好、效率高、產量大、生產成本低。
文檔編號C12P13/14GK101085748SQ200710022900
公開日2007年12月12日 申請日期2007年5月24日 優先權日2007年5月24日
發明者張大兵, 王亞輝, 孟強, 王豔 申請人:江蘇漢邦科技有限公司