尖尾芋水提物誘導單核巨噬細胞分化分泌發揮抗腫瘤功能的應用的製作方法

2023-10-17 06:22:39 2

本發明涉及尖尾芋水提物，具體涉及尖尾芋水提物誘導單核巨噬細胞分化分泌發揮抗腫瘤功能的應用。

背景技術：

尖尾芋為天南星科植物尖尾芋(alocasiaeucullata(dour)schott)的根莖，該植物廣泛分布於我國廣東、廣西、雲南、貴州、四川等省區，為《中國植物志》收錄的有毒植物之一。尖尾芋中藥名為卜芥，有清熱解毒，消腫鎮痛功效,用於治療多種腫瘤、流感、高熱不退、鉤端螺旋體病、毒蛇咬傷、毒蜂螫傷、慢性支氣管炎等。

抗腫瘤細胞因子是由機體細胞分泌的，能通過非特異性地激發和增強機體免疫功能，使機體產生抗腫瘤免疫應答，從而控制和殺滅腫瘤細胞。目前，與腫瘤生物治療相關的細胞因子大致可分為六類：①幹擾素類：infα、β；②白細胞介素類：il-1～18；③集落刺激因子類：g-csf、gm-csf、m-csf、tpo、epo等；④腫瘤壞死因子類：tnfα、β；⑤轉化生長因子類：tgfα、β；⑥其它：包括白血病生長抑制因子(lif)、癌抑制素(moncom)等。

技術實現要素：

本發明的目的在於提出尖尾芋水提物的新應用，特別是尖尾芋水提物誘導抗腫瘤細胞因子的應用。

進一步地，所述尖尾芋水提物按照以下方法提取而得：取天南星科植物尖尾芋的根莖，沸水提取，濾過，高速離心分離續濾液，濃縮，真空冷凍乾燥得尖尾芋水提物。

進一步地，所述加入蒸餾水的量為新鮮尖尾芋根莖重量的10～12倍。

進一步地，所述沸水提取的次數是兩次。

進一步地，所述沸水提取的時間是4h。

進一步地，所述高速離心分離條件為2000r/min，20min。

進一步地，所述尖尾芋水提物為棕黃色粉末，有香氣，易溶於水，其水溶液為淡黃色或棕黃色。

進一步地，所述尖尾芋水提物中總多糖含量佔66.67％，蛋白質佔7.20％，其中多糖主要由d-葡萄糖和d-半乳糖組成。

進一步地，所述抗腫瘤細胞因子為tnf-α與il-1β。

進一步地，所述抗腫瘤細胞因子是淋巴細胞和/或巨噬細胞分泌的。

本發明通過實驗證明尖尾芋水提物能在體內誘導荷瘤小鼠分泌免疫因子，增強小鼠免疫功能，從而抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長：尖尾芋高劑量組、陽性對照組、尖尾芋中劑量組、尖尾芋低劑量組、陰性對照組的腫瘤體積大小依次增加，組間效應差別具有統計學意義(f＝5.399，p＝0.000)，各測量時間點腫瘤體積有差異。腫瘤標本he染色結果顯示，陰性對照組瘤細胞生長緻密，凋亡細胞少見。而尖尾芋高劑量組和陽性對照組腫瘤細胞較少，排列疏鬆，細胞輪廓不清晰。在荷瘤小鼠各組血清中，尖尾芋高劑量組與荷瘤小鼠空白對照組比較，il-2、tnf-α、inf-γ含量均有顯著性差異(p<0.01)，但tgf-β1含量差異不顯著(p＝0.075)。正常小鼠各組血清中，尖尾芋組與正常小鼠空白對照組比較，il-2、tnf-α增高，差異有顯著性(p0.05)。mtt法測尖尾芋對正常小鼠脾細胞活性，與對照組比較，尖尾芋在濃度為200mg/l的處理組差異無顯著性。當濃度為500、1000mg/l的處理組與對照組比較有顯著性差異，且隨藥物濃度增加而增加，呈濃度依賴趨勢。尖尾芋對小鼠腹腔滲出細胞增殖有增強作用，與對照組比較有顯著性差異。

本發明通過實驗證明尖尾芋水提物能在體外誘導thp-1細胞向巨噬細胞分化，並且產生tnf-α與il-1β：thp-1細胞呈現單細胞懸浮狀態，僅極少數細胞貼壁。在尖尾芋的培養液中誘導72h後，顯示明顯的免疫分化。細胞貼於玻璃瓶底部，且不能被含edta的胰酶消化懸浮細胞的數目與尖尾芋濃度成反比，細胞抑制率與濃度成正比。用流式細胞分析尖尾芋誘導thp-1單核細胞向巨噬細胞分化時，cd14與cd11b的表達增高。1000mg/l的尖尾芋作用細胞後，發現流式細胞 直方圖出現雙峰，與前述細胞出現貼壁和懸浮兩種形態相符，尖尾芋不能使thp-1細胞全部分化。cd14與cd11b陽性細胞比例分別為57.40％,，39.65％。與對照組比較差異具有顯著性(p<0.01)，細胞螢光強度顯著性增強(p<0.01)。且發現尖尾芋誘導thp-1細胞產生白介素-1β與腫瘤壞死因子-α。流式細胞儀分析細胞周期，濃度為2000，4000mg/l提取物作用thp-1細胞後，sub-g1期細胞比率分別為(22.3±4.1)％和(60.5±0.7)％，與對照組(2.1±1.0)％比較差異均有顯著性(p<0.01)。趨化因子晶片實驗結果發現,同空白對照比較，尖尾芋組中rantes表達增強,並且有il-8、mip-la,(3、groa的表達。細胞因子晶片實驗結果,尖尾芋組中mif表達增強,並且有mip-loumip-ip、il-8,groa、il-lm、rantes、tnf-a的表達。

本發明的有益效果是：

1.本發明從尖尾芋中提取出水煎煮部分。

2.本發明提取製備尖尾芋水提取的方法快速有效，安全可靠，且原料來源廣泛，適合大規模生產。

3.本發明通過實驗證實尖尾芋水提物能在體內非特異性激發和增強機體免疫功能從而控制和殺滅腫瘤細胞，也能在體外誘導thp-1細胞產生tnf-α與il-1β等免疫相關因子，可以開發成預防與治療惡性腫瘤的藥物製劑。

附圖說明

圖1.各組小鼠血清中細胞因子的含量。**p<0.01與荷瘤小鼠陰性對照組比較。#p<0.05，與未接種腫瘤小鼠陰性對照比較。

圖2.尖尾芋對正常小鼠脾細胞的生長活性影響。

圖3.尖尾芋對thp-1細胞形態的影響(200倍)。

圖4流式細胞儀檢測thp-1細胞表面標記分子cd14與cd11b的表達。

圖5尖尾芋誘導thp-1細胞產生il-1β。

圖6尖尾芋誘導thp-1細胞產生tnf-α。

具體實施方式

實施例1

1.尖尾芋水提物的提取

取新鮮尖尾芋根莖，洗淨切碎，置於60℃烘箱烤乾。粉碎，過篩。稱取1000g尖尾芋粉末，沸水提取兩次，加水量分別為12ml·g-1，10ml·g-1生藥，每次4h，濾過，合併濾液，濃縮至約1000ml，放冷，在2000r/min下高速離心20min，收集濾液。真空冷凍乾燥機乾燥，得尖尾芋水提物，備用。

所得尖尾芋水提物為棕黃色粉末，有香氣，易溶於水，其水溶液為淡黃色或棕黃色。

2.糖含量測定

精密量取0.1mg/ml葡萄糖標準溶液0、1、2、3、4、5、6、7ml於10ml容量瓶中定容，再分別從各管中取葡萄糖溶液2ml，各管加入5％苯酚試劑1ml，混勻，加入濃硫酸5ml，靜置5min，充分振搖，室溫冷卻30min，在487nm波長處檢測，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪製標準曲線。

中性糖含量測定採用苯酚硫酸法，以葡萄糖為對照品。精密稱取葡萄糖對照品適量，加水溶解，製成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照溶液。精密吸取供試品溶液2ml於10ml具塞試管中，分別加入5％苯酚溶液1ml，濃硫酸5ml，混勻，放置20min，測定吸收度，根據回歸方程計算供試品溶液中相當於葡萄糖的量。

尖尾芋水提物中總多糖含量佔66.67％。

3.蛋白質含量測定

精密量取10μg/ml的bsa標準溶液0、20、40、60、80、100μl置於試管中，各管分別加蒸餾水至100μl，加入5ml考馬斯亮藍g-250染色劑，靜置15min，于波長595nm處檢測。以吸光度(y)對蛋白濃度(x)作回歸處理得標準曲線方程。

精密稱取10mg提取物，置於10ml容量瓶中，加水溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液100μl於10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍g-250染色劑，靜置15min，于波長595nm處檢測。根據回歸方程計算供試品溶液中相當於bas的量。

尖尾芋水提物中蛋白質含量佔7.2％。

4.多糖的組分分析

多糖的酸水解：取尖尾芋提取物10mg，加入2mol/l硫酸3.0ml，110℃烘箱中水解8h。水解後，加入固體碳酸鋇中和，4000r/min離心，取上清適當濃縮，進行tlc分析。

tlc分析：稱取d-果糖，d-葡萄糖，l-鼠李糖，d-木糖，d-半乳糖各25mg，分別溶於1.5ml重蒸水中，待用。薄層色譜條件：採用矽膠g(20cm×10cm)薄層板，展開劑正丁醇-丙酮-水(4:5:1)，顯色劑為α-萘酚-硫酸試劑，於100℃烘7min，計算矽膠板中原點到斑點中心的距離與原點到溶劑前沿的距離的比值(rf值)。

尖尾芋水提物中單糖水解產物rf值為0.42與0.51，顏色呈現淺紅色，證明其多糖主要由d-葡萄糖和d-半乳糖組成。

實施例2

尖尾芋水提物抗小鼠腫瘤作用

將70隻balb/c小鼠隨機分成七組，每組10隻。(1)正常小鼠陰性對照組(n-nctrl)；(2)模型小鼠陰性對照組(nctrl)；(3)模型小鼠陽性藥物組(pctrl)；(4)模型小鼠低劑量組(a.c-l)；(5)模型小鼠中劑量組(a.c-m)；(6)模型小鼠高劑量組(a.c-h)(7)正常小鼠給藥組(n-a.c)。調整細胞濃度為1×107/ml，第一、二、三、四、五各組小鼠右側腋下皮下注射0.1cm。接種腫瘤細胞一個星期後開始灌胃。第一組灌80mg/ml實施例1所得尖尾芋水提物；第二、六組灌胃160mg/ml實施例1所得尖尾芋水提物；第三組灌胃320mg/ml水提物尖尾芋水提物；第四組灌胃陽性藥香菇多糖；第五、七組小鼠蒸餾水灌胃。21天後測量小鼠皮下腫瘤體積，腫瘤重量、脾臟指數與胸腺指數的變化，he染色觀察腫瘤組織的形態改變。elisa法檢測血清內il-2、il-10、ifn-γ、tnf-α、tgf-1含量，並用mtt法測尖尾芋對正常balb/c小鼠脾臟細胞、腹腔滲出細胞活力影響。

本發明通過實驗證明尖尾芋水提物能在體內誘導荷瘤小鼠分泌免疫因子，增強小鼠免疫功能，從而抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長：尖尾芋水提物高劑量組、陽性對照組、尖尾芋水提物中劑量組、尖尾芋低劑量組、陰性對照組的腫瘤體積大小依次增加，組間效應差別具有統計學意義(f＝5.399，p＝0.000)，各測量時間點腫瘤體積有差異。腫瘤標本 he染色結果顯示，陰性對照組瘤細胞生長緻密，凋亡細胞少見。而尖尾芋高劑量組和陽性對照組腫瘤細胞較少，排列疏鬆，細胞輪廓不清晰。

實施例3

尖尾芋水提物誘導單核巨噬細胞分化

貼壁細胞用細胞刮收集後計數，計算細胞貼壁率和細胞抑制率。其細胞收集用帶螢光的cd14與cd11b孵育，多聚甲醛固定。流式細胞儀檢測帶螢光細胞比例和螢光強度。

刮取尖尾芋處理的thp-1細胞，pbs漂洗，80％的冰乙醇固定，加pi染色。上流式細胞儀檢測各期細胞dna的含量。離心的細胞上清液，按照elisa試劑盒說明檢測其中的tnf-α與il-1β水平。並使用試劑盒humancytokinearraypanelaarraykit和humanchemokinearraykit(r&dsystems)對上清中細胞因子及趨化因子的表達水平進行整體測定。

本發明通過實驗證明尖尾芋水提物能在體外誘導thp-1細胞向巨噬細胞分化，並且產生tnf-α與il-1β：thp-1細胞呈現單細胞懸浮狀態，僅極少數細胞貼壁。在尖尾芋的培養液中誘導72h後，顯示明顯的免疫分化。細胞貼於玻璃瓶底部，且不能被含edta的胰酶消化懸浮細胞的數目與尖尾芋濃度成反比，細胞抑制率與濃度成正比。用流式細胞分析尖尾芋誘導thp-1單核細胞向巨噬細胞分化時，cd14與cd11b的表達增高。1000mg/l的尖尾芋作用細胞後，發現流式細胞直方圖出現雙峰，與前述細胞出現貼壁和懸浮兩種形態相符，尖尾芋不能使thp-1細胞全部分化。cd14與cd11b陽性細胞比例分別為57.40％,，39.65％。與對照組比較差異具有顯著性(p<0.01)，細胞螢光強度顯著性增強(p<0.01)。且發現尖尾芋誘導thp-1細胞產生白介素-1β與腫瘤壞死因子-α。流式細胞儀分析細胞周期，濃度為2000，4000mg/l提取物作用thp-1細胞後，sub-g1期細胞比率分別為(22.3±4.1)％和(60.5±0.7)％，與對照組(2.1±1.0)％比較差異均有顯著性(p<0.01)。趨化因子晶片實驗結果發現,同空白對照比較，尖尾芋組中rantes表達增強,並且有il-8、mip-la,(3、groa的表達。細胞因子晶片實驗結果,尖尾芋組中mif表達增強,並且有mip-loumip-ip、il-8,groa、 il-lm、rantes、tnf-a的表達。