一種基於螢光定量PCR鑑定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑑定方法與流程
2023-10-17 02:58:39 3
本發明屬於分子生物學技術領域，具體涉及一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑑定方法。
背景技術：
自1992年首次從小鼠中分離得到小家鼠類螺桿菌後，到目前為止已分離到至少13種嚙齒類動物螺桿菌，其中膽汁螺桿菌(helicobacterbilis)、肝螺桿菌(helicobacterhepaticus)、嚙齒類螺桿菌(helicobacterrodentium)為較為重要的感染哨齒類動物的螺桿菌，主要存在於消化道，包括盲腸、結腸及肝膽等器官。齧齒動物螺桿菌會引起動物疾病，更易以隱性感染形式存在於免疫缺陷型動物中，感染嚙齒類螺桿菌會導致小鼠肝炎、盲腸結腸炎等多種腸肝疾病，另外一同感染嚙齒類螺桿菌和膽汁螺桿菌會引起小鼠腹瀉。因此，若在科研或生物安全性評價等試驗中採用此類實驗動物，定會對實驗數據造成影響，結果缺乏可靠性。
嚙齒類螺桿菌為螺桿菌屬，而螺桿菌屬的菌種在菌落、菌體形態上差異小、十分相似，採用傳統的生理生化特性的基礎進行分類鑑定有一定困難，同時，由於螺旋桿菌需在微氧環境中生長，所需設備特殊，營養要求嚴苛，生長周期長等特點，制約了螺桿菌的常規檢測方法的多樣。pcr方法是這類生長環境苛刻菌株首選的檢測方法，由於pcr在螺桿菌屬和種水平上的高特異性和敏感性已經普遍用於嚙齒類螺桿菌的檢測中，pcr檢測技術主要根據16srrna序列設計的引物進行，在生物進化中，16srrna的進化落後於其他基因，因此被稱為細菌界的「分子化石」。具有高度保守性，若兩種細菌基因達到98.8％以上的同源性，即將其認定為同一屬種，此外，該基因序列的長度為1600nt，比較適中，可滿足實驗引物設計的需求。常規pcr方法在一定程度上提高了檢測螺桿菌的敏感性，但在定量及靈敏度等問題上仍存在不足，有待優化完善。
技術實現要素：
有鑑於此，本發明的目的在於提供一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及其鑑定方法，使所述方法具有高特異性、高靈敏度的特點。
為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：
本發明提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。
本發明還提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的試劑盒，包括sybr螢光染料taq酶預混液、螢光誤差校正液、陽性質控品和上述方案所述引物。
優選的，權利要求1所述的引物的質量濃度優選為10μmol/l。
優選的，所述陽性質控品的質量濃度優選為108ng/μl。
優選的，sybr螢光染料taq酶預混液5ml、螢光誤差校正液200μl、陽性質控品2ml和所述的正向引物400μl和所述的反向引物400μl。
本發明還提供了基於所述的試劑盒鑑別嚙齒類螺桿菌的鑑別方法，包括以下步驟：
1)提取待測樣品總基因組dna，得到待測樣本總dna；
2)以所述步驟1)得到的樣品總dna為模板，利用所述的引物進行qpcr擴增，得到螢光檢測結果；
3)以陽性質控品為陽性對照，以超純水為陰性對照，待測樣品的擴增曲線與陽性質控品的擴增曲線結果一致，且陰性對照沒有產生擴增曲線，則判定為樣品為嚙齒類螺桿菌。
優選的，qpcr擴增的擴增體系包括以下組分含量：
sybr螢光染料taq酶預混液10μl，螢光誤差校正液0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。
優選的，qpcr擴增的擴增程序為95℃預變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個循環；95℃15s，60℃1min，95℃15s。
本發明提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。本發明提供的引物適用於16srrna螢光定量pcr擴增，並且準確地從肝螺桿菌、膽螺桿菌等多種螺桿菌中鑑別出嚙齒類螺桿菌，特異性達100％。
本發明還提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的試劑盒及其鑑別方法，所述試劑盒方便準確地鑑定嚙齒類螺桿菌的存在，操作簡便，無需進行瓊脂糖凝膠電泳，只需螢光定量pcr儀即可完成，實現快速、大通量診斷和檢測，降低了鑑別時間和檢測成本，研究表明本發明提供的這一螢光pcr檢測方法，特異性達100％，靈敏度達30拷貝。
附圖說明
圖1為2％瓊脂糖凝膠電泳檢測普通pcr引物特異性結果；
圖2為2％瓊脂糖凝膠電泳檢測普通pcr靈敏度結果；
圖3為螢光pcr溶解曲線分析圖；
圖4螢光pcr擴增動力學曲線；
圖5標準曲線圖；
圖6螢光pcr靈敏度檢測結果；
圖7特異性檢測結果；
圖8樣品檢測結果。
具體實施方式
本發明提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌用引物，所述引物包括正向引物和反向引物；所述正向引物具有如序列表中seqidno.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列。
根據genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列號：u96297.1)設計一對引物，其中正向引物為：5』-gagatagtggagtgctagc-3』(seqidno.1)；反向引物：5』gctccatttcacaatattgc-3』(seqidno.2)，目的片段大小為268bp。所述引物委託上海生工合成。
本發明還提供了一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的試劑盒，包括sybr螢光染料taq酶預混液、螢光誤差校正液、陽性質控品和上述方案所述引物。
本發明提供的試劑盒包括正向引物和反向引物。正向引物和反向引物的摩爾濃度優選為10μmol/l。所述的正向引物的體積優選為400μl和所述的反向引物的體積優選為400μl。
本發明提供的試劑盒包括sybr螢光染料taq酶預混液。所述sybr螢光染料taq酶預混液優選為sybrpremixextaqⅱ試劑。在所述試劑盒中，所述sybrpremixextaqⅱ試劑的體積優選為5ml。所述sybrpremixextaqⅱ試劑的來源購自大連寶生物工程有限公司。
本發明提供的試劑盒包括螢光誤差校正液。所述螢光誤差校正液優選為roxreferencedyeⅱ試劑。所述roxreferencedyeⅱ的體積優選為200μl。所述roxreferencedyeⅱ試劑購自大連寶生物工程有限公司。
本發明提供的試劑盒包括陽性質控品。所述陽性質控品的拷貝含量優選為101～108拷貝/μl。所述陽性質控品的體積優選為2ml。
本發明中，所述陽性質控品的製備方法，包括以下步驟：
1)用上述方案中的引物擴增嚙齒類螺桿菌，得到的pcr產物經過膠回收後，與plb載體連接，得到重組質粒；
2)將所述重組質粒轉化到dh5α大腸桿菌中，篩選得到陽性菌落，菌落擴增使用質粒小提試劑盒提取質粒，得到質粒；
3)經過紫外分光光度計測量吸收值，得到陽性質控品的濃度和拷貝數。
本發明中，所述步驟1)中擴增的程序優選為94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35個循環；72℃1min30s；16℃2h。
本發明中，所述步驟1)中擴增的體系優選包括：10μm的正向引物1μl，10μm的反向引物1μl，taqmax10μl，dna模板2μl和ddh2o6μl。
本發明中，所述連接的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的連接方法即可。本發明實施例中，所述連接採用連接試劑盒。所述連接試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。
本發明中，所述轉化的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的轉化方法即可。
本發明中，所述陽性菌落的篩選方法優選採用菌落pcr法。本發明對所述菌落pcr法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的菌落pcr法即可。本發明中，所述質粒小提試劑盒的來源優選購自為北京天根生化科技有限公司。
本發明中，所述陽性質控品的質量濃度優選為50ng/μl，原始拷貝數為1.5×1010拷貝/μl。
本發明還提供了基於所述的試劑盒鑑別嚙齒類螺桿菌的鑑別方法，包括以下步驟：
①提取樣本總基因組dna，得到待測樣本總dna；
②以所述步驟①得到的樣品總dna為模板，利用上述方案所述的引物進行qpcr擴增，得到螢光檢測結果；
③以陽性質控品為陽性對照，以超純水為陰性對照，待測樣品的擴增曲線與陽性質控品的擴增曲線結果一致，且陰性對照沒有產生擴增曲線，則判定為樣品為嚙齒類螺桿菌。
本發明中，所述提取基因組dna的方法沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的提取基因組dna的方法即可。本發明中，所述提取基因組dna的方法採用試劑盒法提取。
提取基因組dna後，本發明優選進行dna濃度的檢測。所述檢測的方法優選採用核酸定量儀進行檢測。根據檢測結果，調整模板的濃度至20～120ng/μl。
本發明中，qpcr擴增的擴增體系優選包括以下組分含量：
sybrpremixextaqⅱ10μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，50ng/μl的dna模板2μl，10μmol/l正向引物0.8μl，10μmol/l反向引物0.8μl，ddh2o6μl。
本發明中，qpcr擴增的擴增程序優選為95℃預變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個循環；95℃15s，60℃1min，95℃15s。
本發明中，qpcr擴增優選採用實時螢光定量pcr儀器(appliedbiosystemssteponetmreal-timepcrsystemthermalcyclingblock)進行擴增。所述qpcr擴增設置空白對照和陽性對照。所述空白對照用相同體積的超純水替換樣品鑑別組的模板dna，所述陽性對照用相同體積的陽性質控品替換樣品鑑別組的模板dna。空白對照、陽性對照和樣品鑑別擴增所用程序相同。
下面結合實施例對本發明提供的一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及其鑑定方法進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。
實施例1
pcr特異性引物的設計
根據genbank公布的helicobacterrodentium16sribosomalrnagene的基因序列(序列號：u96297.1)，目的片段大小為268bp。設計一對引物f：5』-gagatagtggagtgctagc-3』；r：5』gctccatttcacaatattgc-3』，引物由上海生工合成。
實施例2
pcr擴增方法的建立
(1)常規pcr反應體系為20μl：
h.ro-16srrna-f(10μm)1μl；
h.ro-16srrna-r(10μm)1μl；
taqmix10μl；
基因組dna2μl；
ddh2o6μl。
其中，基因組dna分別為肝螺桿菌陰性對照、膽螺桿菌陰性對照、嚙齒類螺桿菌。
(2)常規pcr反應程序：
94℃1min30s；94℃30s，52℃30s，72℃15s，35個循環；72℃1min30s；16℃2h。2％瓊脂糖凝膠電泳觀察pcr結果，如圖1所示，各泳道樣品具體為：1：dl2000marker，2：空白對照，3：肝螺桿菌陰性對照，4：膽螺桿菌陰性對照，5：嚙齒類螺桿菌陽性樣品，只有泳道5出現大小約為268bp的條帶，並且條帶清晰，這說明所述擴增引物對嚙齒類螺桿菌具有擴增特異性。
實驗例3
陽性質粒標準品製備
將實施例2中嚙齒類螺桿菌擴增得到的pcr產物經過膠回收試劑盒回收後，與plb載體連接，經過轉化到dh5α大腸桿菌中，篩選得到陽性菌落，菌落擴增使用質粒小提試劑盒提取質粒，得到質粒，經過紫外分光光度計測量濃度為50ng/μl，原始拷貝數為1.5×1010拷貝/μl。
實施例4
普通pcr敏感性實驗
將所得質粒按照10倍稀釋得到1.5×100～1.5×108拷貝數/μl，使用1.5～1.5×108拷貝/μl為樣本，檢測普通pcr靈敏度，反應體系與反應程序實施例2相同。經過2％瓊脂糖凝膠電泳如圖2所示，1：3×109拷貝/μl，2：3×108拷貝/μl，3：3×107拷貝/μl，4：3×106拷貝/μl，5：3×105拷貝/μl，6：3×104拷貝/μl，7：3×103拷貝/μl，8：3×102拷貝/μl，9：30拷貝/μl，10：空白對照，11：dl2000marker。由圖2可知，在3×102拷貝/μl時，目的條帶可見。
實施例5
螢光定量pcr反應標準曲線的建立
螢光定量pcr反應標準曲線的建立將標準品進行10倍系列稀釋，取15-1.5×106拷貝/μl的6個梯度濃度的質粒作模板，進行實時螢光定量pcr擴增，製作溶解曲線(圖3)和標準曲線(圖5)。螢光定量pcr反應體系包括sybrpremixextaqⅱ10μl，h.ro-16srrna-f0.8μl，h.ro-16srrna-r0.8μl，roxreferencedyeⅱ0.4μl，dna模板(0.05fg/μl～500pg/μl)2μl，ddh2o6μl。反應程序為95℃預變性30s；95℃5s，52℃30s，72℃30s，40個循環；95℃15s，60℃1min，95℃15s。擴增動力學曲線如圖4所示，具體為1：3×106拷貝/μl，2：3×105拷貝/μl，3：3×104拷貝/μl，4：3×103拷貝/μl，5：3×102拷貝/μl，6：30拷貝/μl。
由圖4所示，指數增長期曲線平行，反映了pcr的擴增效率相近，不同稀釋度之間的ct值相差均勻，ct值與拷貝數呈現良好的線性關係。
實施例6
螢光定量pcr敏感性試驗
敏感性試驗將標準品進行10倍梯度稀釋後，取濃度為0.15～1.5×106拷貝/μl的標準品進行螢光定量pcr檢測，同時做普通pcr檢測。結果圖6所示，其中1：3×106拷貝/μl，2：3×105拷貝/μl，3：3×104拷貝/μl，4：3×103拷貝/μl，5：3×102拷貝/μl，6：30拷貝/μl，7：3拷貝/μl，8：0.3拷貝/μl，9：空白對照。
圖6表明螢光定量pcr檢測方法可以檢測到30個拷貝/μl的標準品，而常規pcr僅能檢測到300個拷貝/μl的標準品，表明建立的h.rodentium實時螢光定量pcr檢測方法具有較高的敏感性，比常規pcr至少高10倍。
實施例7
螢光定量pcr的特異性試驗
特異性試驗檢測肝螺桿菌，膽螺桿菌，h.rodentium，方法同實施例5，結果如圖7所示。圖7表明，只有h.rodentium有螢光信號，發生了擴增反應，而肝螺桿菌，膽螺桿菌未發生任何擴增，說明所述方法具有很好的特異性。
實施例8
螢光定量pcr的樣品檢測
實驗大小鼠糞便dna提取物檢測，收集不同實驗房大小鼠糞便，使用糞便dna提取試劑盒提取dna，根據如上所示的螢光pcr體系及程序，並添加陽性及空白對照。結果圖8所示，其中1：陽性對照，2-14：檢測樣品，15：空白對照。圖8顯示，2～15樣品均未擴增出如陽性對照所示的擴增曲線，這表明實驗動物均未感染h.rodentium。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。
sequencelisting
揚州大學
一種基於螢光定量pcr鑑定嚙齒類螺桿菌的引物、試劑盒及鑑定方法
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人工序列
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