利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法
2023-12-11 22:48:22 1
專利名稱：利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法。
背景技術：
家蠶是一種重要的經濟和模式生物，為我國社會主義經濟的發展做出了巨大貢獻並正在為中國經濟可持續發展進一步做著更大的貢獻。由中國家蠶基因組計劃研究小組領導的家蠶基因組框架圖的率先完成，不但確立了我國家蠶功能基因組研究在國際上的地位，而且也為蠶絲業和昆蟲學科的發展提供了新的契機。功能基因組時期的主要工作包括主要功能基因的鑑定克隆，重要生物學性狀的分子機理的闡明，最終實現重要經濟性狀的人為調節和創造。家蠶最重要的性狀是家蠶絲腺能在短時間高效地大量合成絹絲蛋白。利用家蠶絲腺的這一特點，在絲腺中高效表達外源蛋白一直是許多蠶學和生物學科技工作者追求的目標。目前，這項工作主要瓶頸是轉基因技術的突破和轉基因蠶中被表達的外源蛋白在絲心蛋白中的比例含量低。解決這些制約學科研究發展的瓶頸，是創造真正實用的家蠶絲腺生物反應器，拓寬家蠶的應用領域，保持蠶絲產業可持續發展，促進我國蠶學和昆蟲學科的長遠發展的重要基礎工作。
利用鱗翅目來源的轉座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉基因技術最初在日本取得成功，但該技術在我國一直沒有獲得實質性突破，成為制約我國該學科研究發展的瓶頸。目前，本發明申請人已經建立了系統而完善的家蠶胚胎顯微注射轉基因技術並取得成功，為本研究的工作開展打下了良好的基礎。最近，在國外，在轉基因家蠶絲腺裡生產外源蛋白曾被報導。然而，由於轉基因家蠶繭的主要成分仍然是家蠶本身的蠶絲蛋白，而這些家蠶表達系統是分別利用家蠶絲心蛋白的兩個非主要的成分——輕鏈和fibrohexamerin/P25的啟動子，故這些家蠶表達系統不是很有效的外源蛋白的表達系統。
普通家蠶繭的主要組成是蠶絲絲心蛋白(fibroin)和絲膠(sericin)，其中絲心蛋白是繭的主要成分，約佔繭層重的82％。蠶絲絲心蛋白由家蠶的後部絲腺(PSG)細胞合成，絲膠由中部絲腺細胞合成，它們都在中部絲腺聚集，最後經過前部絲腺被榨絲後而吐絲結繭。絲心蛋白由350-kDa的重鏈蛋白(H-chain)，26-kDa的輕鏈蛋白(L-chain)和30-kDafibrohexamerin/P25(fhx)三種蛋白構成。這些蛋白在後部絲腺細胞內首先按照一定的比例(H-chain∶L-chain∶fhx＝6∶6∶1)形成絲心蛋白基本單位，然後絲心蛋白基本單位被分泌到腺腔。在絲心蛋白基本單位中重鏈蛋白是最主要的成分，達92％，而輕鏈蛋白只佔約7％，fhx約佔1％。最近報導的在轉基因家蠶絲腺裡產生外源蛋白都是利用輕鏈蛋白和fhx啟動子，這些家蠶表達系統不能很有效的表達外源蛋白是由於這兩個組分本來就是絲心蛋白的兩個非主要的成分。家蠶絲心蛋白最主要成分——重鏈蛋白啟動子的開發將有助於較大幅度地提高轉基因家蠶繭中外源重組蛋白的比例，而且在利用鱗翅目來源的轉座子piggyBac的家蠶胚胎顯微注射轉基因技術的研究報導中，有關利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法未見報導。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法。該方法突破轉基因蠶中被表達的外源蛋白在絲心蛋白中的含量低的難點，首次開發和利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子，使家蠶絲腺生物反應器向人為控制的方向發展。
本發明將家蠶胚胎顯微注射技術，螢光檢測與分子生物操作技術相結合，構建了一個在家蠶絲腺中特異高效表達的家蠶絲心蛋白重鏈啟動子，簡稱為Fib-HP3，長度為2304bp，其核酸序列是aagcttgttgtacaaaactgccacacgcatttttttctccactgtaggttgtagttacgcgaaaacaaaatcgttctgtgaaaattcaaacaaaaatattttttcgtaaaaacacttatcaatgagtaaagtaacaattcatgaataatttcatgtaaaaaaaaaatactagaaaaggaatttttcattacgagatgcttaaaaatctgtttcaaggtagagatttttcgatatttcggaaaattttgtaaaactgtaaatccgtaaaattttgctaaacatatattgtgttgttttggtaagtattgacccaagctatcacctcctgcagtatgtcgtgctaattactggacacattgtataacagttccactgtattgacaataataaaacctcttcattgacttgagaatgtctggacagatttggctttgtatttttgatttacaaatgtttttttggtgatttacccatccaaggcattctccaggatggttgtggcatcacgccgattggcaaacaaaaactaaaatgaaactaaaaagaaacagtttccgctgtcccgttcctctagtgggagaaagcatgaagtaagttctttaaatattacaaaaaaattgaacgatattataaaattctttaaaatattaaaagtaagaacaataagatcaattaaatcataattaatcacattgttcatgatcacaatttaatttacttcatacgttgtattgttatgttaaataaaaagattaatttctatgtaattgtatctgtacaatacaatgtgtagatgtttattctatcgaaagtaaatacgtcaaaactcgaaaattttcagtataaaaaggttcaactttttcaaatcagCATCAGTTCGGTTCCAACTCTCAAGATGAGAGTCAAAACCTTTGTGATCTTGTGCTGCGCTCTGCAGgtgagttaattattttactattatttcagaaggtggccagacgatatcacgggccacctgataataagtggtcgccaaaacgcacagatatcgtaaattgtgccatttgatttgtcacgcccgggggggctacggaataaactacatttatttatttaaaaaatgaaccttagattatgtaacttgtgatttatttgcgtcaaaagtaggcaagatgaatctatgtaaatacctgggcagacttgcaatatcctatttcaccggtaaatcagcattgcaatatgcaatgcatattcaacaatatgtaaaacaattcgtaaagcatcattagaaaatagacgaaagaaattgcataaaattataaccgcattattaatttattatgatatctattaacaattgctattgcctttttttcgcaaattataatcattttcataacctcgaggtagcattctgttacattttaatacattgg
tatgtgattataacacgagctgcccactgagtttctcgccagatcttctcagtgggtcgcgttaccgatcacgtgatagattctatgaagcactgctcttgttagggctagtgttagcaaattctttcaggttgagtctgagagctcacctacccatcggagcgtagctggaataggctaccagctaataggtagggaaaacaaagctcgaaacaagctcaagtaataacaacataatgtgaccataaaatctcgtggtgtatgagatacaattatgtactttcccacaaatgtttacataattagaatgttgttcaacttgcctaacgccccagctagaacattcaattattactattaccactactaaggcagtatgtcctaactcgttccagatcagcgctaacttcgattgaatgtgcgaaatttatagctcaatattttagcacttatcgtattgatttaagaaaaaattgttaacattttgtttcagTATGTCGCTTATACAAATGCAAACATCAATGATTTTGATGAGGACTATTTTGGGAGTGATGTCACTGTCCAAAGTAGTAATACAACAGATGAAATAATTAGAGATGCATCTGGGGCAGTTATCGAAGAACAAATTACAACTAAAAAAATGCAACGGAAAAATAAAAACCATGGAATACTTGGAAAAAATGAAAAAATGATCAAGACGTTCGTTATAACCACGGATTCCGACGGTAACGAGTCCATTGTAGAGGAAGATGTGCTCATGAAGACACTTTCCGATGGTACTGTTGCTCAAAGTTATGTTGCTGCTGATGCGGGAGCATATTCTCAGAGCGGGCCATACGTATCAAACAGTGGATACAGCACTCATCAAGGATATACGAGCGATTTCAGC本發明利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法，依次包括下列步驟(1)載體的構建本發明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉座子載體是piggyBac衍生來載體，它是將來自於pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆進用BgIII/HpaI酶切並被補平的p3E1.2載體(Cary et al.，1989)，重組pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉座子載體是參照Horn Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭載體採用兩步克隆法構建的，首先，複雜的構建都在含有所有可能識別6個鹼基的限制性內切酶和Notl的多克隆位點的pSLfa1180fa克隆穿梭載體中完成，然後，構建好的重組pSLfa1180fa克隆穿梭載體用識別10個鹼基的限制性內切酶Ascl和Fsel消化，得到的重組部分最後被克隆進pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重組注射載體；啟動子元件的PCR擴增是用含有家蠶品種p50絲心蛋白基因的細菌人造染色體(BAC)克隆(下面簡稱H-chain BAC)為模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是從pBS-A3EGFP質粒的中擴增得到，具體構建如下首先是不同元件片段的獲得絲心蛋白重鏈啟動子3(簡稱為Fib-H P3)由絲心蛋白重鏈基因5′-上遊序列，外顯子1，內含子1和外顯子2的5′端非重複序列組成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物對從H-chain BAC擴增獲得；輕鏈結合位點(簡稱為LBS)由包含Cys-c20(C-端的倒數第20個胺基酸)的絲心蛋白重鏈基因的3′端和包含重鏈基因多聚腺嘌呤化信號序列的3』端下遊序列組成，它是用含有一個BamHI位點的LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和含有一個Sall位點的LBS-r(79359-79335)(5′-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3′)從H-chainBAC擴增獲得；EGFP基因是用含有一個XbaI位點的pEGFP-f(5′-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3′)和含有一個BamHI位點的pEGFP-r(5′-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′)從pBS-A3EGFP質粒擴增獲得，上面的PCR擴增條件是94℃預變性5分鐘，5個94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分30秒的循環，然後是25個94℃1分鐘，55℃1分鐘；和72℃1分30秒的循環，接下來是72℃7分鐘和4℃保存；然後是這些擴增元件按照下面的方法克隆進pSLfa1180fa(下面簡稱為pSL)穿梭載體①克隆LBS片段進pSL穿梭載體獲得pSL-LBS質粒；②克隆EGFP片段進pSL-LBS質粒獲得pSL-LBS-EGFP質粒；③克隆Fib-H P1片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1質粒，而克隆Fib-H P3片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質粒；④克隆外顯子2的5′端非重複序列片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+5』-Exon2質粒，然後再克隆絲心蛋白重鏈基因5』-上遊序列和外顯子1的片段進pSL-LBS-EGFP+5』-Exon2質粒而獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H 2質粒；最後，把獲得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質粒的重組部分克隆進pBac[3XP3-DsRedaf]載體，獲得重組注射載體pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)轉基因家蠶的獲得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作輔助質粒產生轉位酶，用QIAGEN Plasmid Midikit(Qiagen)試劑盒純化注射質粒DNA，採用Kanda Tamura(1991)描述的方法進行家蠶胚胎顯微注射，注射後的蠶卵用無毒膠封口，在25℃條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體；最後，獲得的轉基因個體飼養、傳代，並進行表達的檢測和表達效率的測量。
啟動子特異表達的檢測和表達效率的測量可用如下方法啟動子注射載體獲得的轉基因家蠶用不同的探針進行Southern blot和Northern blot分析以及用EGFP抗體進行Western blot分析。實驗中的所有核酸探針都是用地高辛標記試劑(DIG-High Prime reagent(Boehringer Mannheim，U.S.))進行標記。①Southern blot分析用酚-氯仿法從G1代的蛾或G2代的第7天的蛹抽提轉基因家蠶基因組DNA。6ug的基因組DNA用Spe I內切酶完全消化，電泳後轉移到尼龍膜(Hybond N+，AmershamBioscience)上，固定後進行雜交實驗。探針是EGFP片段；②Northern blot分析取～100mg的五齡第四天家蠶後部絲腺用1mL的TRIzolreagent(Invitrogen，U.S.)抽提後部絲腺總RNA。用10μg的總RNA電泳並按照標準方法進行Northern blot分析(Sambrook et al.，1989)。探針用EGFP探針和絲心蛋白重鏈3』端探針。絲心蛋白重鏈3』端片段是用LBS-f(79027-79043)(5′-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3′)和Fib-H 3′-endR(5′-ttttttAAATGCTCTCATTTATTAACG-3′)引物對從pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質粒擴增獲得。實驗可估計外源基因EGFP的相對轉錄和表達量；③Western blot分析去掉亂絲的繭碎片溶解於60％的LiSCN溶液中(按照約0.025g的繭片/1ml of 60％LiSCN比例進行溶解和處理)，然後離心取上清液，並用Tris緩衝液(10mM Tris-HCl pH＝7.0，2％SDS，5％β-巰基乙醇)稀釋5倍後作為實驗分析的樣品。這些樣品與5×加樣緩衝液混合併在100℃變性3分鐘後上樣於10％SDS-聚丙稀醯胺膠並進行Western blot分析。Western blot分析的抗體是GFP Epitope Tag(Affinity BioReagents，U.S.)，GFP量的估計的標準樣品是利用PA1-980A Neutralizing Peptide(Affinity BioReagents，U.S.)。實驗可估計轉基因蠶繭中EGFP的含量。
本發明的優點是，首次開發和利用了家蠶重鏈蛋白啟動子，通過轉基因家蠶大量表達外源表達蛋白，含量遠遠高於利用輕鏈蛋白和fhx啟動子在轉基因家蠶絲腺裡產生外源蛋白的含量，利用輕鏈蛋白和fhx啟動子在轉基因家蠶絲腺裡產生外源蛋白的含量，它們分別為0.84％和0.1％，而本方法外源蛋白的表達含量可達到16％左右。解決這一瓶頸，創造真正實用的家蠶絲腺生物反應器，可拓寬家蠶的應用領域，保持蠶絲產業可持續發展，促進我國蠶學和昆蟲學科的長遠發展。利用該項技術流程，通過大量飼養目的轉基因家蠶，就可以簡單地收穫轉基因家蠶蠶繭而大量獲得目的外源蛋白。
具體實施例方式
實施例選擇家蠶品種用上述方法構建家蠶絲心蛋白重鏈啟動子和目的外源蛋白基因的注射載體，並進一步獲得目的轉基因家蠶，經用上述方法測定，在轉基因家蠶蠶繭中外源蛋白的表達含量為16％。
權利要求
1.一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法，其特徵在於依次包括下列步驟(1)載體的構建本發明利用的pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉座子載體是piggyBac衍生來載體，它是將來自於pSL-3XP3-DsRedaf的1.3kb EcoRI/NruI的平端片段克隆進用BglII/HpaI酶切並被補平的p3E1.2載體(Cary et al.，1989)，重組pBac[3XP3-DsRedaf]注射轉座子載體是參照Horn Wimmer(2000)的利用pSLfa1180fa克隆穿梭載體採用兩步克隆法構建的，首先，複雜的構建都在含有所有可能識別6個鹼基的限制性內切酶和NotI的多克隆位點的pSLfa1180fa克隆穿梭載體中完成，然後，構建好的重組pSLfa1180fa克隆穿梭載體用識別10個鹼基的限制性內切酶AscI和FseI消化，得到的重組部分最後被克隆進pBac[3XP3-DsRedaf]形成目的重組注射載體；啟動子元件的PCR擴增是用含有家蠶品種p50絲心蛋白基因的細菌人造染色體(BAC)克隆(下面簡稱H-chain BAC)為模板(Wu et al.，1999)，EGFP基因是從pBS-A3EGFP質粒的中擴增得到，具體構建如下首先是不同元件片段的獲得絲心蛋白重鏈啟動子3(簡稱為Fib-H P3)由絲心蛋白重鏈基因5』-上遊序列，外顯子1，內含子1和外顯子2的5』端非重複序列組成，它是用Fib-H-P-f和Fib-H-P-r(63846-63823)引物對從H-chain BAC擴增獲得；輕鏈結合位點(簡稱為LBS)由包含Cys-c20(C-端的倒數第20個胺基酸)的絲心蛋白重鏈基因的3』端和包含重鏈基因多聚腺嘌呤化信號序列的3』端下遊序列組成，它是用含有一個BamHI位點的LBS-f(79027-79043)(5』-gtacggatccaAGTTACGGAGCTGGCAG-3』)和含有一個SalI位點的LBS-r(79359-79335)(5』-gcgcgtcgacTAGTACATTCAAATAAAATGCATAC-3』)從H-chainBAC擴增獲得；EGFP基因是用含有一個XbaI位點的pEGFP-f(5』-ctagtctagaATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3』)和含有一個BamHI位點的pEGFP-r(5』-cagtggatcCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3』)從pBS-A3EGFP質粒擴增獲得，上面的PCR擴增條件是94℃預變性5分鐘，5個94℃1分鐘，50℃1分鐘和72℃1分30秒的循環，然後是25個94℃1分鐘，55℃1分鐘；和72℃1分30秒的循環，接下來是72℃7分鐘和4℃保存；然後是這些擴增元件按照下面的方法克隆進pSLfa1180fa(下面簡稱為pSL)穿梭載體①克隆LBS片段進pSL穿梭載體獲得pSL-LBS質粒；②克隆EGFP片段進pSL-LBS質粒獲得pSL-LBS-EGFP質粒；③克隆Fib-H P1片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P1質粒，而克隆Fib-H P3片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質粒；④克隆外顯子2的5』端非重複序列片段進pSL-LBS-EGFP質粒獲得pSL-LBS-EGFP+5』-Exon2質粒，然後再克隆絲心蛋白重鏈基因5』-上遊序列和外顯子1的片段進pSL-LBS-EGFP+5』-Exon2質粒而獲得pSL-LBS-EGFP+Fib-H2質粒；最後，把獲得的pSL-LBS-EGFP+Fib-H P3質粒的重組部分克隆進pBac[3XP3-DsRedaf]載體，獲得重組注射載體pBac[3XP3-DsRedaf]-R3；(2)轉基因家蠶的獲得pHA3PIG(Tamura et al.，2000)被用作輔助質粒產生轉位酶，用QIAGEN PlasmidMidi kit(Qiagen)試劑盒純化注射質粒DNA，採用Kanda Tamura(1991)描述的方法進行家蠶胚胎顯微注射，注射後的蠶卵用無毒膠封口，在25℃條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代(G0)的蠶蛾進行自交或回交，獲得G1代蠶卵，掃描G1代蠶卵獲得轉基因個體；最後，獲得的轉基因個體飼養、傳代，並進行表達的檢測和表達效率的測量。
全文摘要
一種利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子大量表達外源蛋白的方法，突破轉基因蠶中被表達的外源蛋白在絲心蛋白中的含量低的難點，首次開發和利用家蠶絲心蛋白重鏈啟動子，通過轉基因家蠶大量表達外源表達蛋白，含量遠遠高於利用輕鏈蛋白和fhx啟動子在轉基因家蠶絲腺裡產生外源蛋白的含量，達到16％左右。解決這一瓶頸，創造真正實用的家蠶絲腺生物反應器，可拓寬家蠶的應用領域，保持蠶絲產業可持續發展。利用該方法，通過大量飼養目的轉基因家蠶，可以簡單地收穫轉基因家蠶蠶繭而大量獲得目的外源蛋白。
文檔編號A01K67/00GK1912116SQ20061005444
公開日2007年2月14日 申請日期2006年7月14日 優先權日2006年7月14日
發明者趙愛春, 夏慶友, 魯成, 向仲懷 申請人:西南大學